目覚めしたゼブラフィッシュ幼虫と頭蓋骨と皮膚除去による若年組織の完全に活性な脳組織のインビボイメージング

この方法は、後の幼虫段階でゼブラフィッシュの脳を視覚化し、これまで不可能であった生体内で非常に詳細な方法で神経アーキテクチャを観察することを可能にする。後の幼虫の発達中に出現し、脳の明確なイメージングを防ぐ色素細胞は、単に除去されるため、この方法では問題ありません。この方法では、脳の幼虫発達中に後期に起こるプロセス、シナプス可塑性、ニューロンの変性、またはそれらの再生に影響を与えるプロセスを研究することが可能であるべきである。

実験を開始する前に、マイクロピペットプーラーを使用して、ガラスの毛細血管から鋭く薄いガラス針を準備します。次に、プラスチック製のパスツールピペットを使用して、適切な溶液を含む直径90ミリメートルのペトリ皿に幼虫を集めます。選択した幼虫をACSFを含む直径35ミリメートルのペトリ皿に移し、24×24ミリメートル、正方形、ガラスカバースリップをペトリ皿蓋に入れます。

その後、実験に必要なACSFの体積をカルボゲンとの酸素化に適したフィアルにアリコートする。幼虫を埋め込むには、パスツールピペットを使用して、麻酔した幼虫を実体顕微鏡下の取り付けチャンバーに移します。幼虫がまだ動くことができれば、魚が完全に動くことができないまで、実験に魚を使わないで下さいます。

幼虫が不動の場合は、余分な培地を慎重に取り除き、すぐに少なくとも1ミリリットルの低融解アガロースを幼虫に加える。ゼブラフィッシュの向きを、後ろ地をできるだけアガロースの表面に近づけます。幼虫が反転顕微鏡を用いて画像化される場合は、固化後、幼虫を含むアガロースを小さな立方体ブロックにトリミングする。

イメージングのために脳を露出させるために、必要に応じて関心のある脳領域の上に余分なアガロースをトリミングし、ガラス針を使用して、組織に深く浸透することなく、関心のある領域の近くの皮膚を小さな切開を行います。かろうじて皮膚表面の下に針を移動し、関心のある領域の皮膚が取り除かれるか、または脇に押し出すことができるまで、関心のある領域の周りに非常に小さなカットを慎重に行い続けます。組織がすべての胚から取り除かれたら、以前に調製された反転顕微鏡のイメージングチャンバーに低融解アガロースの小さな滴を加え、小さなヘラを使用して、画像チャンバーのアガロースドロップに180度の立方体アガロースブロックを反転させます。

アガロースが固まったら、イメージングチャンバーに新鮮なACSFを充填し、幼虫のイメージングを開始します。ここでは、そのまま受精後14日間のトランスジェニック幼虫をそのまま頭蓋骨をそのまま観察することができる。図示のように、重ね合わせ皮膚内の色素細胞は頭全体に分布し、対象領域における蛍光シグナルを妨害する。

開いた頭蓋骨の手術の後、対象領域は、詳細な高解像度イメージングのために自由にアクセスできるようになります。皮膚、頭蓋骨、または血液脳関門はまた、開いた頭蓋骨手術後にのみこれらの脳細胞で観察される堅牢な核色素染色によって示されるように、脳への物質の浸透を妨げる。これらの利点は、受精後30日でも観察される。

赤い蛍光タンパク質の発現による蛍光脳血管構造を含むトランスジェニック魚では、mCherry、内皮細胞において、画像スタックの深さ値で色分けすると、脳内に深く埋もれた血管でさえも、250ミクロン近くまではっきりと見え、追跡可能であることを示している。この手順を実行する場合は、常にこれは生きている動物の手術であることを覚えておいてください。したがって、それは尊敬と焦点を当てた心を必要とします。

この手順の後、シナプス構造を含む神経形態の記録、生理学的および細胞内輸送事象は、受精後7日以上経過した幼虫で行うことができる。この技術により、後の幼虫段階で起こる脳内の細胞プロセスを研究し、例えば社会的行動や意思決定などの複雑な行動の確立に関与するアプローチを提供したいと考えています。