エンドヌクレアーゼベースの部位特異的DNA損傷の可視化と定量化

この方法論ビデオでは、DNA損傷関連の細胞プロセスを研究し、DNA修復に関与するタンパク質の採用を視覚化し定量化するために定期的に使用される免疫染色およびクロマチン免疫沈降プロトコルの重要なステップを紹介します。この技術は、損傷したゲノム遺伝子座に結合した新しいタンパク質を同定するための強力なツールと、DNA修復中の微調整された調節に必要な翻訳後の改変を研究者に提供する。これらの技術は、さまざまな細胞プロセスの研究に応用することができるので、レーザーマイクロ照射や核ベースのDNA損傷誘導システムを使用する場合、それらは潜在的な関連性を持っています。

最近では、DNA修復の理解を深めるために使用できる部位特異的なDNA損傷を誘導するための強力なツールが開発されました。生化学的および遺伝的アプローチを適用して、これらの器具は、DNA損傷部位におけるDNA修復複合体の募集および組み立てに関連する細胞事象を明らかにする上で不可欠である。さらに、これらの技術は、固定細胞と生細胞の両方を使用して、単一細胞分解能でこれらのプロセスの研究を可能にする。

10%の胎児の子牛血清、2ミリモルグルタミン、および1%抗生物質抗ミキサン溶液を添加したDMEM培地中の単層のU2OS細胞を維持する。加湿した5%の二酸化炭素環境で80%合流が達成されるまで、2~3日ごとに培地を再生します。培地を吸引し、PBSで細胞を洗浄する。

トリプシン-EDTA溶液で細胞を取り外します。細胞が剥離すると、細胞に培養培地を添加してトリプシンの活性を停止し、細胞懸濁液を生じる。細胞計数チャンバーを使用してセルをカウントします。

各ウェルに無菌12ミリメートルの丸いカバースリップを持つ24ウェルプレート上のウェルあたり1ミリリットルあたり20,000セルをプレートします。加湿した5%の二酸化炭素環境で37度で細胞を24時間インキュベートし、カバースリップに取り付けられるようにします。1ミリリットルのネオカルジノススタチン当たり10ナノグラムで細胞を治療するか、または、内核ベースのシステムを介して二本鎖破断を誘導するために適切な方法を使用します。

加湿した5%の二酸化炭素環境で細胞を37度で1~8時間インキュベートし、DNA修復の運動に従う。4%ホルムアルデヒドPBS溶液で細胞を25度で20分間固定します。固定液を取り出し、それぞれ5分間PBSで細胞を3回洗浄します。

PBSを取り出し、PBSに溶解した0.2%トリトンXを加えます。サンプルを20分間インキュベートします。PBSで細胞を3回洗います。

BSA-PBSTで5%BSAを希釈して非特異的結合をブロックし、サンプルを少なくとも20分間インキュベートする。1%BSA-PBST溶液に希釈した一次抗体の適切な量を加える。各カバースリップをパラフィルムまたは希釈した抗体の10マイクロリットルの液滴に逆さまに置きます。

サンプルを湿度室に4度で1時間半インキュベートします。カバースリップを24ウェルプレートに横に戻し、PBSで3回洗浄します。1%BSA-PBSTで希釈した二次抗体の適切な量を加える。

各カバースリップをパラフィルム上に逆さまに置き、希釈された抗体の10マイクロリットルの液滴を覆います。湿度チャンバー内のサンプルを4度で1時間インキュベートします。カバースリップを24ウェルプレートに戻し、PBSで3回洗います。

最後のPBS洗浄液を取り外す前に、ピン板と針の半分でカバースリップをそっと取り出し、取り付け媒体の液滴でガラススライドに逆さまにします。クロマチン免疫沈降法は、DNAに対するタンパク質の結合パターンを同定するために広く用いられている技術である。DSB周辺の欲望修復タンパク質の占有率を明らかにするために、特定の抗体を使用して、クロマチン調製物から目的のタンパク質を免疫沈降させ、そのタンパク質が結合しているDNA領域と共に行う。

さらに、特定のゲノム座でのDSBで使用されている特定の翻訳後修飾の存在をマッピングするために、ChIPが一般的に適用されてきました。1ミリリットル当たり約2,000万個の細胞を、各サンプルに対して15センチメートルの皿で培養する必要があります。培地を取り除き、氷冷PBSで細胞を2回洗浄する。

1%ホルムアルデヒド-PBS溶液で細胞を固定します。プレートを軌道シェーカーの上に置き、20分間静かに攪拌します。グリシンによる固定を停止して125ミリモルの最終濃度に達し、25度で5分間穏やかな攪拌でオービターシェーカーにインキュベートします。

氷の上にプレートを置き、氷冷PBSで2回洗います。氷冷PBSで細胞をこすり、15ミリリットル円錐形のチューブに移します。5,000rpmで細胞を4度で5分間遠心する。

上清を慎重に吸引し、ペレットを2ミリリットルの細胞ライシスバッファーに再懸濁し、氷の上で10分間インキュベートする。遠心分離機を5,000rpmで4度で5分間行う。慎重に上清を捨て、ペレットを500〜1、500マイクロリットル核ライシスバッファーに再懸濁し、氷の上で30〜60分間インキュベートします。

超音波処理に適したポリスチレンの円錐管にリゼートを移します。ライセートを超音波処理し、DNAを平均断片サイズ300〜1000塩基に剪断する。事前洗浄および免疫沈降ステップ用のダイナビーズを準備します。

リパバッファーでビーズを4度で10分間2回洗浄します。手順 3.1 で元のストック ソリューションから取り出したのと同じ量の RIPA バッファでダイナビーズを再中断します。各サンプルのプレクリア25〜30マイクログラムクロマチンは、4度で1〜2時間回転を介して4マイクロリットルダイナビーズを有する。

ダイナビーズを磁石で沈殿させ、上清を新しいエペンドルフチューブに移します。各クロマチンサンプルに適切な量の抗体を加え、一晩4度回転させます。翌日、洗浄されたダイナビーズを40マイクロリットルずつ各サンプルに加え、一晩で4度回転してインキュベートします。

300マイクロリットルの低塩バッファーで1回、4度の回転で10分間洗浄します。300マイクロリットルの高塩バッファーで1回、4度の回転で10分間洗浄します。300マイクロリットルの塩化リチウムバッファーで1回、4度の回転で10分間洗浄します。

300マイクロリットルTEで10分間2回洗浄し、最初の洗浄は4度で回転し、2回目は25度で洗浄します。ビーズに200マイクロリットル溶出バッファーを加え、連続的な振盪で15分間、サーモシェーカーで65度でインキュベートします。上清を新しいチューブに移し、200マイクロリットル溶出バッファーで再びビーズを溶出します。

ミリリットルプロテイナーゼKあたり500マイクログラムとSDSの半分を加え、サンプルを50度で2時間インキュベートします。クロロホルム抽出を行い、上水相を新しいエペンドルフチューブに移します。2.5分の絶対エタノールと0.1体積3モル酢酸ナトリウムpH 5.2を加えます。

マイナス80度で少なくとも20分間インキュベートする。エタノールを取り出し、ペレットを乾燥させます。ペレットを50マイクロリットルTEに再懸濁します。DNAに関する特殊な分布を研究するために、クロマチン免疫沈降を適用する必要があります。

この図では、I-PpoI誘導DNA損傷に対する応答としてガンマヒストンAXの時間的な濃縮を示す、ChIP-qPCRによって得られた典型的な実験結果を示す。画像の左側には、適時に検出されたガンマヒストンAX信号がブレーク側に示され、右側には、ガンマヒストンAX分布が、破断が誘導されていない制御遺伝子領域で提示される。DNA修復は比較的最近の研究分野ですが、生化学的および顕微鏡的な方法の両方の助けを借りて、私たちの知識は急速に増加しています。

それにもかかわらず、西洋ブロット、免疫沈降法、質量分析などの生化学的手法は、大量の細胞を必要とする。調査修復プロセスは、目的の細胞母集団のスナップショットを表します。顕微鏡分野は、DNA損傷誘発細胞プロセスをヌクレオソームレベルで可視化し、タンパク質の共局在化の正確なマッピングを確実にする超解像顕微鏡などの高解像度技術によって革命化されています。

一方、クロマチン免疫沈降法は、特にシーケンシング法と組み合わせることで、所望のDNA修復関連タンパク質のゲノム全体の結合パターンを視覚化し、クロマチンまたはヘテロクロマチン領域のいずれかで二本鎖破断を可視化する強力なツールです。