Name: ホスファチジルセリン/ホスファチジルイノシトール4-膜間のリン酸交換の蛍光ベースの測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 学ぶ蛍光ベースの測定法で、酵母Osh6pタンパク質によるホスファチジルセリンとホスファチジルイノシトール4-リン酸の膜間輸送を解析します。人工リポソームを用いたリアルタイム動態評価により、真核細胞の脂質分布メカニズムを解明します。

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原稿を慎重に校正してくれたA.カットトリス博士に感謝しています。この研究は、フランス国家研究庁の助成金ExCHANGE(ANR-16-CE13-0006)とCNRSによって資金提供されています。

著者らは、利益相反はないと宣言している。

これらのアッセイの結果は、蛍光脂質センサーのシグナルに直接依存します。したがって、これらのプローブの精製は、NBDと1:1の比率で、かつ無料のNBDフルオロフォア汚染なしに標識され、このプロトコルの重要なステップです。また、検査中のLTPが適切に折り畳まれ、集計されていないかどうかを確認することも必須です。抽出アッセイで試験したLTPの量は、このLTPがこれらの脂質を効率的に抽出するかどうかを適切に測定するために、アクセス可能なPSまたはPI(4)P分子の量と同等以上でなければならない。実際、NBD-C2ラクトとNBD-PHFAPPは、それぞれ、古典的な飽和結合曲線に従って、PSおよびPI(4)Pに結合する。PSとPI(4)Pのそれぞれの親和性を考えると、これらのプローブは、リポソームにリポソームの残存痕跡が含まれていても、リポソームに大部分が結合したままである。これは、LTPが効率的にこれらの脂質を抽出しないという誤った結論につながることができます。このプロトコルは、標準および市販のPC、PS、およびPI(4)P亜種(18:1/18:1-PC、16:0/18:1-PS、および16:0/16:...

異なる膜間および真核細胞1,2の膜内での脂質の正確な分布は、深い生物学的意味を有する。LTPsの機能の解読は、細胞生物学3、4、5、6、およびinvitroアプローチにおいて重要な問題であり、この問題7、8、9、10、11に対処する上で大きな価値がある。ここでは、細胞膜12間の複数のORP/Oshタンパク質がPS/PI(4)Pに影響を及ぼし、それによって新しいクラスのLTPsを構成することを確立するのに役立ったinvitro、蛍光ベースの戦略が提示される。 ERとPMの間の勾配に沿って分布し、グリセロリン脂質の5〜7%および最大30%をそれぞれ17、18、19に示す。また、PSは、PMの細胞体リーフレットに本質的に濃縮される。この蓄積とPMのPSの不均一なパーティションは、細胞信号プロセス19にとって重要です。PS分子の負電荷のために、PMの細胞体リーフレットは、他のオルガネラ1、2、19、20の細胞体リーフレットよりもはるかにアニオン性である。これにより、静電力を介して、ピリストアレートアラニンを豊富に含むCキナーゼ基質(MARCKS)21、肉腫(Src)22、キルステンラット肉腫ウイルス性腫瘍遺伝子(K-Ras)23、およびRas関連C3ボツリヌス毒素基質1(Rac1)24などのシグナル伝達タンパク質の採用を可能にする。 
PSはまた、C2ドメイン25を介して立体選択的な方法で従来のプロテインキナーゼCによって認識される。ただし、PS は ER26で合成され、その役割を果たす前に PM にエクスポートする必要があることを示します。酵母では、Osh6pおよびOsh7pがERからPM27にPSを移すことを知るまで、これがどのように達成されたかは知られていませんでした。これらのLTPは、創設メンバーがOSBPであり、OSBP関連ドメイン(ORD)をポケットに組み込んで脂質分子をホストするタンパク質(ヒトのORP、酵母のオッシュタンパク質)を含む真核生物中の進化的に保存された家族に属しています。Osh6pとOsh7pは、構造特徴がPSを特異的に結合し、膜間で伝達するように適合したORDのみで構成されています。それにもかかわらず、これらのタンパク質がERからPMにPSをどのように方向的に移したかは不明であった。Osh6pとOsh7pは、PI(4)Pを代替脂質リガンド12としてトラップすることができます。酵母では、PI(4)Pはゴルジのホスファチジルイノシトール(PI)とPMからPI-4キナーゼ、Pik1pおよびStt4pによってそれぞれ合成される。対照的に、この脂質はSac1pホスファターゼによってPIに加水分解されるので、ER膜にはPI(4)Pはありません。したがって、PI(4)P 勾配は ER/ゴルギインターフェイスと ER/PM インターフェイスの両方に存在します。Osh6p および Osh7p は、これら 2 つの膜12の間に存在する PI(4)P 勾配を使用して、ER から PM に PS を転送します。
1サイクル内で、Osh6pはERからPSを抽出し、PMでPI(4)PにPSを交換し、PI(4)PをERに戻して別のPS分子を抽出します。Osh6p/Osh7pは、ER膜とPMを互いに近接して接続して近接させる数少ないタンパク質の1つであるIst2p28と相互作用し、酵母29、30、31にER-PMコンタクトサイトを作成する。また、負に帯電した膜とのOsh6pの関連は、その静電機能を変化させる立体構造変化によるタンパク質がその脂質リガンドの1つを抽出するとすぐに弱くなる32。これは、その膜のドウェル時間を短縮することによってOsh6pを助け、それによってその脂質移動活性の効率を維持する。Ist2pへの結合と組み合わせることで、このメカニズムにより、Osh6p/7pがER/PM界面で脂質交換を迅速かつ正確に実行することが可能になります。ヒト細胞では、ORP5およびORP8タンパク質は、ER-PM接触部位でPS/PI(4)P交換を個別のメカニズム33を介して実行する。それらは、Osh6pに似た中央ORDを有するが、C末端膜貫通セグメント33を介してERに直接固定され、PI(4)PおよびPI(4,5)P233、34、35を認識するN末端プレックストリン相同性(PH)ドメインを介してPMにドッキングする。ORP5/8はPI(4)Pを使用してPSを転送し、ORP5/8はさらにPM PI(4,5)P2レベルを調節し、シグナル伝達経路を調節することが示されています。PI(4)P および PI(4,5)P2レベルの低下は、これらのタンパク質が PIP 依存的な方法で PM に関連付けるため、ORP5/ORP8 活性を低下させます。レンツ・マジェフスキ症候群に至る異常に高いPS合成は、ORP5/836を通してPI(4)Pレベルに影響を与える。両方のタンパク質の活性が遮断されると、PSはPMであまり豊富になくなり、シグナル伝達タンパク質37の発癌能力を低下させる。
逆に、ORP5過剰発現は、癌細胞の浸潤と転移過程38を促進する。したがって、ORP5/8活性の変化は、脂質恒常性の変化を通じて細胞行動を著しく変化させることができる。また、ORP5およびORP8は、ER-ミトコンドリア接触部位を占有し、ミトコンドリア機能を保存し、PS39を供給する可能性がある。さらに、ORP5は、ER-脂質液滴接触部位に局地化し、PS/PI(4)P交換40によってPSを脂質滴に送達する。本明細書に記載されている戦略は、リポソームからの(i)PSおよびPI(4)P抽出物および(ii)リポソーム間のPSおよびPI(4)P輸送を測定し、Osh6p/Osh7p12、32のPS/PI(4)P交換活性を確立および分析するために考案され、他のグループがORP5/ORP835および他のLTPの活性を分析するために使用した 41.これは、それぞれPSとPI(4)Pを検出できる蛍光プレートリーダー、標準Lフォーマット分光蛍光計、および2つの蛍光センサ、NBD-C2ラクトとNBD-PHFAPPの使用に基づいています。
NBD-C2ラクトは、推定されるPS結合部位の近くにユニークな溶媒暴露システインを含むように再設計された糖タンパク質、ラクタドヘリンのC2ドメインに対応します。極性感受性のNBD(7-ニトロベンツ-2-オキサ-1,3-ジアゾール)フルオロフォアは、この残基に共有結合している(図1A)12。より正確に言うと、ラクタドヘリンのC2ドメイン(ボストーラス、ユニプロート:Q95114、残留物270-427)を、大腸菌中のグルタチオンS-トランスバラーゼ(GST)と融合して発現させるpGEX-4T3ベクターにクローン化した。C2ラクト配列を突然変異させ、2つの溶媒にアクセス可能なシステイン残基(C270、 C427) アラニン残基を有し、その後N,N'-ジメチル-N-(イオダセチル)-N'-n-(7-ニトロベンツ-2-オキサ-1,3-ジアゾル-4-yl)エチレンジアミン(IANB)で標識することができる推定PS結合部位(H352C突然変異)近くの領域にシステイン残基を導入する血栓の切断部位は、C2ドメインのGSTタンパク質とN末語との間に存在する。主な利点は、このドメインが他の既知のC2ドメインまたはアネキシンA542に反してCa2+独立的な方法でPSを選択的に認識することです。NBD-PHFAPPは、ヒト4リン酸アダプタータンパク質1(FAPP1)のPHドメインに由来し、PI(4)P結合部位(図1A)の近傍にNBD基で標識することができる単一の溶媒暴露システインを含むように再設計された。ヒトFAPPタンパク質のPHドメインの塩基配列(UniProt:Q9HB20、セグメント[1-100])は、GSTタグと連換えて発現されるpGEX-4T3ベクターにクローン化されている。このPHFAPP配列は、タンパク質43の膜結合界面内に特有のシステイン残基を挿入するように改変されている。さらに、プロテアーゼへのアクセス性を確保するために、9残基リンカーが、PHドメインのトロンビン切断部位とN末語との間に導入された。
リポソームからのPS抽出を測定するには、 NBD-C2Lactは、微量のPSを含むホスファチジルコリン(PC)で作られたリポソームと混合され、PSに対する親和性のために、この構造はリポソームに結合し、NBDフルオロフォアは膜の疎水性環境に接触するにつれて極性の変化を経験する。PSが量論的量のLTPによってほぼ完全に抽出された場合、プローブはリポソームと関連せず、NBD信号は低い(図1B)32。この信号の違いは、LTP(例えば、Osh6p)がPSを抽出するかどうかを決定するために使用されます。同様の戦略は、前述の12, 32のように、NBD-PHFAPPと共に PI(4)P 抽出 (図 1B) を測定するために使用されます。2つのFRETベースのアッセイは、(i)それぞれER膜とPMを模倣するLAからLBリポソームへのPS輸送を測定し、(ii)逆方向にPI(4)P輸送を測定するように設計された。これらのアッセイは、PS/PI(4)P交換を測定するために同じ条件(すなわち、同じバッファー、温度、および脂質濃度)で行われます。PS輸送を測定するために、NBD-C2ラクトは、PCで構成されるLAリポソームと混合し、5モル%のPSおよび2モル%の蛍光ローダミン標識ホスファチジルエタノールアミン(Rhod-PE)およびLBリポソームを5モルPI%PI(4)Pを組み込んだ。
時間ゼロで、ロードPEを有するFRETは、NBD蛍光をクエンチする。PSがLAからLBリポソームに輸送される場合(例えば、Osh6pを注入すると)、LAからLBリポソームへのNBD-C2Lact分子の転位に伴い、速い脱健全性が生じる(図1C)。アクセス可能なPSの量を考えると、NBD-C2のラクトは、実験12の過程で本質的に膜結合状態のままである。したがって、NBDシグナルの強度は、LAとLBリポソーム間のNBD-C2ラクトの分布と直接相関し、PSが転送される量を決定するために容易に正規化することができる。PI(4)Pの逆方向の移動を測定するために、NBD-PHFAPPはLAおよびLBリポソームと混合される。PI(4)P を含むが、ロード-PEを含まない LBリポソームにのみ結合することを考えると、その蛍光は高い。PI(4)PがLAリポソームに移された場合、これらのリポソームに転写され、Rhod-PEを用いたFRETにより信号が減少する(図1C)。信号は正規化されて、PI(4)P が転送される量が43 になります。

<table><tbody><tr><td>&nbsp;L-システイン &ge;97 % (FG)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>W326305-100G</td><td>10 mM L-システイン原液を水に調製します。アリコートは -20 &deg で保存されます。C</td></tr><tr><td>2 mL Amber Vial, PTFE/Rub Lnr, for lipids storage in CHCL3</td><td>Wheaton</td><td>W224681</td><td></td></tr><tr><td>4 mm-diameter glass beads</td><td>Sigma</td><td>Z265934-1EA</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 円錐形遠心分離管</td><td>Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&Auml;KTA清浄機</td><td>GEヘルスケア</td><td></td><td>FPLC</td></tr><tr><td>アルミホイル</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アミコンウルトラ-15 MWCOが3 kDaおよび10 kDa</td>の<td>メルク</td><td>UFC900324、UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>アミコンウルトラ-4がMWCOの3および10 kDa</td>の<td>メルク</td><td>UFC800324、</td>UFC801024<td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td></td><td></td><td>ろ過および滅菌水で50 mg / mLのストック溶液を準備し、-20 &度;C.</td></tr><tr><td>ベスタチン</td><td>シグマ</td><td>B8385-10mg</td><td></td></tr><tr><td>BL21ゴールドコンピテントセル</td><td>アジレント</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C16:0 Liss&nbsp;(Rhod-PE) CHCl3 (1 mg/mL)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810158C-5MG</td><td></td></tr><tr><td>C16:0/C16:0-PI(4)P&nbsp;&nbsp;</td><td>Echelon Lipids</td><td>P-4016-3</td><td>C16:0/C16:0-PI(4)P 粉末 1 mg を 250 & micro に溶解します。MeOHおよび250&microのL;CHCl3のL。その後、CHCl3を1mLまで充填します。解決策は明確でなければなりません。</td></tr><tr><td>CHCl3 (10 mg/mL)中のC16:0/C18:1-PS (POPS)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840034C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>C18:1/C18:1-PC (DOPC) in CHCl3 (25 mg/mL)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C-500mg</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&nbsp;</td><td>シグマ</td><td></td><td>10 mM CaCl2 ストック溶液を水中に調製します。</td></tr><tr><td>細胞かく乱物質</td><td>コンスタントダイナミクス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム (CHCl3) RPE-ISO</td><td>カルロ・エルバ</td><td>438601</td><td></td></tr><tr><td>完全 EDTA フリープロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>ロシュ</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>脱イオン (Milli-Q) 水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ジメチルホルムアミド (DMF)、無水、純度</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>>99%DNAse I 組換え、RNAseフリー、粉末</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DTT Euromedex</td><td>EU0006-B</td><td>Milli-Q水で1 M DTTストック溶液を調製します。&nbsp;1mLのアリコートを調製し、-20°Cで保存します。</td></tr><tr><td>Econo-Pacクロマトグラフィーカラム(1.5 &times; 12 cm)。</td><td>Biorad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポレーションキュベット 2 mm</td><td>Ozyme</td><td>EP102</td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポレーター エッペンドルフ 2510</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>固定角ローター Ti45 および Ti45 チューブ</td><td>ベックマン</td><td>バセリアル ライセート</td><td></td>の紡績</tr><tr><td>ガラスシリンジ (10、25、50 &micro;L)蛍光実験用</td><td>ハミルトン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラスシリンジ(25、100、250、500、および1000 &micro;L) 脂質ストック溶液を扱うため</td><td>ハミルトン</td><td>1702RNR、1710RNR、1725RNR、1750RN タイプ3、1001RN</td><td></td></tr><tr><td>グルタチオン セファロース 4B ビーズ</td><td>GE ヘルスケア</td><td>17-0756-05</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール (純度 99%)</td> <td>シグマ</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>キャップ</td><td></td><td></td><td></td>付き溶血チューブ</tr><tr><td>HEPES、純度 >99%</td><td>シグマ</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>イラストラNAP 10脱塩カラム</td><td>GE</td><td>ヘルスケア GE17-0854-02</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピル &β;-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)&nbsp;</td><td>Euromedex</td><td>EU0008-B</td><td>Milli-Qwaterで1 M IPTGストック溶液を調製します。1mLのアリコートを調製し、-20°Cで保存します。</td></tr><tr><td>K-アセテート</td><td>Prolabo</td><td>26664.293</td><td></td></tr><tr><td>レノックス LB グルコース</td><td></td><td></td>を含まないブロス培地 <td>milli-Q 水で調製し、オートクレーブ滅菌しました。</td></tr><tr><td>液体窒素</td><td>リンデ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メタノール(MeOH)&ge;99.8%</td><td>VWR</td><td>20847.24</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td></td><td>2 M MgCl2溶液を準備します。0.45 &micro;mフィルター。&nbsp;</td></tr><tr><td>マイクロプレート 96 ウェル PS F-Botom Black 非結合</td><td>性 Greiner Bio-one</td><td>655900</td><td></td></tr><tr><td>ミニ押出機 1 mL 気密性 Hamilton シリンジ 2 個付き</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>モノクロメーターベースの蛍光プレートリーダー</td><td>TECAN</td><td>M1000 Pro</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-ジメチル-N-(ヨードアセチル)-N'-(7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)エチレンジアミン) (IANBD Amide)</td><td>分子プローブ</td><td></td><td>25 mg の IANBD を 2.5 mL のジメチルスルホキシド (DMSO) に溶解し、100 μ の 25 アリコートを調製します。1.5 mLスクリューキャップチューブのL。キャップを完全にねじ込まないでください。次に、凍結乾燥機でDMSOを除去し、チューブあたり1 mgの乾燥IANBDを取得します。チューブは閉じて-20°Cで保管されます。暗闇の中のC.&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1.8 mM KH2PO4、オートクレーブ滅菌済み、摂氏4°Cで保存。</td></tr><tr><td>洋ナシ型ガラスフラスコ(25mL、14/23、デュランガラス)</td><td>デュラングループ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペプスタチン</td><td>シグマ</td><td>p5318-25mg</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-C2LACT&nbsp; プラスミド</td><td></td><td></td><td>ご要望に応じてラボから入手可能</td></tr><tr><td>pGEX-PHFAPPプラスミド</td><td></td><td></td> フェ<td></td></tr><tr><td>ニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)からご要望に応じて入手可能&ge;98.5% (GC)</td><td>Sigma</td><td>P7626-25g</td> イソプロパノール ホスホラミドン Sigma R7385-10mg ポリカーボネート フィルター (直径 19 mm) <td>に 200 mM PMSF ストック溶液を調製</td></tr>し<tr><td></td><td></td><td></td>、細孔径 0.2 &micro;<td></td></tr><tr><td>m</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610006</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Prep クロマトグラフィーカラム(ベッド容量 0-2 mL と 10 mL リザーバー付き)</td><td>Biorad</td><td>7311550</td><td></td></tr><tr><td>Prefilters(直径 10 mm)。</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610014</td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>http://pymol.org/</td><td></td> <td>タンパク質の3Dモデルの構築(図1A)</td></tr><tr><td>UV/可視蛍光用石英キュベット(最小容量600 & micro;L)</td><td>Hellma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quartz cuvettes</td><td>Hellma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷蔵遠心分離機&nbsp;Eppendorf 5427R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ロータリーエバポレーター</td><td>Buchi</td><td>B-100</td><td></td></tr><tr><td>スクリューキャップ微量遠心チューブ (1.5 mL)</td><td>Sarsted</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小型磁気PFTE攪拌バー (5 &times; 2 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>スナップキャップ微量遠心チューブ (0.5、1、2 mL)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYPRO orange</td><td></td><td></td><td>SDS-PAGEゲル中のタンパク質を検出するための蛍光染色</td></tr><tr><td>サーモミキサー</td><td>スターラボ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トロンビン、ヒト血漿から</td><td>シグマ</td><td>10602400001</td><td>1mLのミリQ水に20ユニットを溶解し、25 & micro;0.5 mL Eppendorfチューブ内のLアリコート。その後、凍結して-80°Cで保存します。</td></tr><tr><td>トリス、超高純度</td><td>MP</td><td>819623</td><td></td></tr><tr><td>超遠心分離機 L90K</td><td>ベックマン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV/可視吸光度計</td> 温度制御セルホルダーと攪拌装置<td>を備えたSAFAS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV/可視分光蛍光光度計</td><td>ジャスコまたは島津</td><td>製作所 ジャスコ FP-8300 または 島津製作所 RF-5301PC</td><td></td></tr><tr><td>真空チャンバー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>セファクリルS200HR</td><td>GEヘルスケア</td><td></td><td></td>を詰めた</tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>Julabo</td><td></td><td></td></tr> XK 16/70カラム</tbody></table>

ホスファチジルセリン/ホスファチジルイノシトール4-膜間のリン酸交換の蛍光ベースの測定

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

進化的に保存されたオキシステロール結合タンパク質(OSBP)関連タンパク質(ORP)/OSBPホモログ(Osh)ファミリーのいくつかのメンバーは、最近、酵母およびヒト細胞における新しい脂質移動タンパク質(LTP)群を表していることが判明した。ホスファチジルセリン(PS)をPS/ホスファチジルイノシトール4リン酸(PI)交換サイクル を介して 、小胞子(ER)から形質膜(PM)に移します。この知見により、シグナル伝達プロセスに重要なPSがどのように細胞全体に分布しているか、およびこのプロセスとホスホイノシチド(PIP)代謝との間のリンクの調査がより深く理解できる。新しい蛍光ベースのプロトコルの開発は、この新しい細胞機構の発見と特徴付け に 役立っています。本論文では、タンパク質がPSまたはPI(4)Pを抽出し、人工膜間で脂質を移動させる能力を測定するための、蛍光標識された2つの脂質センサNBD-C2ラクト およびNBD-PHFAPPの製造と使用について説明する。まず、プロトコルは、これら2つの構成体の高純度サンプルを製造、ラベル付け、取得する方法を記述する。第2に、これらのセンサーを蛍光マイクロプレートリーダーと併用して、タンパク質がPsまたはPI(4)Pをリポソームから抽出できるかどうかを判断する方法を、Osh6pをケーススタディとして使用する方法を説明する。最後に、このプロトコルは、定義された脂質組成のリポソーム間のPS/PI(4)P交換の運動量を正確に測定し、標準蛍光計を用いた蛍光共鳴エネルギー伝達(FRET)による脂質移動率を測定する方法を示す。

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62177/62177fig01.jpg"> 図1: 蛍光脂質センサとインビトロアッセイの説明(A) ウシラクタジンのC2ドメインの結晶構造に基づくNBD-C2ラクトおよびNBD-PHFAPPの3次元モデル(PDB ID: 3BN648)およびヒトFAPP1タンパク質のPHドメインのNMR構造(PDB ID:2KJ46)N,N'-ジメチル-N-(チオアセチル)-N'-(7-ニトロベンツ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イイル)エチレンジアミン部分、 手動で、精力的に最小化し、C352(NBD-C2Lac...

ここでは、蛍光脂質センサーおよびリポソームを用いて、タンパク質抽出物を用いてホスファチジルセリンまたはホスファチジルイノシトール4-リン酸 をインビトロで輸送するかを決定するプロトコルについて説明する。

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

この方法は、蛍光を使用して、合成膜間の生物学的に重要なリクリクドへのタンパク質転移が真核細胞内のこれらの脂質の分布に寄与するかどうかを判断する。この技術は、タンパク質による天然脂質の抽出および輸送を可能にし、作りやすくなる蛍光細胞やリポソームを必要とする。この方法を使用して、臓器と膜の間のいくつかの必須脂質の分布の背後にあるタンパク質によって細胞生物学への洞察を得るために変更することができます。蛍光による脂質転写のリアルタイム測定を行う方法を説明するには、視覚的な実証が重要です。だから、手順を実証することは、私の研究室のエンジニアであるモード・マグデレーヌでもあります。新鮮なろ過体および脱ガス化されたHEPES酢酸カリウムバッファーを調製し、1ミリモル塩化マグネシウムを添加してHKMバッファーを形成します。次に、PCのみで作られたリポソームを調製するか、または2つのモルパーセントPSまたはPI(4)Pで加減する。さて、フラスコをロータリーエバポレーターに置き、脂質を真空下で乾燥させます。1つの井戸では、2つのモルパーセントPSを含むリポソームを脂質センサーNBD-C2ラクトと混合し、最終的な濃度250ナノモルと100マイクロリットルの体積を混合します。2番目のリポソームとNBD-C2の乳液を3つのミクロモル脂質転写タンパク質またはLTPと混合して十分に充填する。純粋な80マイクロモルPCリポソームと純粋な80マイクロモルPCリポソームと第4の井戸と混合250ナノモルNBD-C2の授乳で第三井戸を埋めます。これらの手順を繰り返して、3 つの追加の 4 つのウェルを準備します。その後、蛍光リーダーにマルチウェルプレートを置きます。各井戸のために摂氏25度で490ナノメートルで励起時に5ナノメートルの帯域幅で505から650ナノメートルまでのNBDスペクトルを記録する。各系列では、他のスペクトルからリポソームのみで記録されたスペクトルを差し引きます。PI(4)P抽出アッセイは、2つのモル%ホスファチジルイノシトール-4-リン酸でドープされたリポソームを調製し、NBD-PH FAPPプローブで測定を行います。制御実験を行い、抽出率を決定します。押し出しリポソームを終了した後、これらの押し出されたリポソームでチューブを充填します。脱ガスし、ろ過されたHKMバッファーを準備し、室温で押し出されたリポソームを含むチューブを保ちます。ローダミンとラベル付けされたフォダミンを含むリポソームを含むチューブをアルミニウム箔で包み、不透明な箱に入れて写真の漂白を防ぎます。25~37°Cの温度を設定し、1~3ナノメートルの短い帯域幅で励起モノクロメーターを460ナノメートルに調整し、10ナノメートル以上の大帯域幅を持つ530ナノメートルに発光します。取得時間を 25 分に設定し、時間

Research

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Biochemistry

生物化学

このビデオでは、マイクロ流体プラットフォームと呼ばれる担持脂質二重膜のホスファチジルエタノールアミン脂質にタグ付けされたpH感受性蛍光色素を使用して、pH調節アッセイを使用して、マイクロ流体パターンでのタンパク質-ホスホイノシチド相互作用を示しています。タンパク質がリン脂質に結合した後のpHの調節は、蛍光消光を引き起こします。...

タンパク質-ホスホイノシチド相互作用を検出するための担持脂質二重膜のpH調節アッセイ

偏光ベース全内部反射蛍光顕微鏡（pTIRFM）は、細胞膜動態のリアルタイム検出を可能にする。この記事では、調節性エキソサイトーシスの間に膜のリモデリングの研究のためpTIRFMの実装について説明します。技術は、直接的または間接的に、膜形状の変化を伴う細胞生物学における他のプロセスに一般化である。...

pTIRFMによる画像形成細胞膜変形は

細胞膜タンパク質と脂質の空間分布と時間ダイナミクスは、生物学におけるホットなトピックです。ここでは、この問題は、概念的には同じ物理量の単一粒子追跡を提供する時空間画像変動解析によって対処されますが、低分子ラベルと標準的な顕微鏡セットアップを使用します。...

商業顕微鏡でのライブ細胞膜上の分子拡散法への高速蛍光イメージングから

液滴単層を平らな単層に融合させることにより、流体-流体界面における表面活性種の横方向の拡散を測定する新しい技術を提示します。...

リン脂質単層の二次元拡散を測定するためにドロップレットをマージした後蛍光回復

ホスホイノシチドは、その相対的存在量急速に様々な刺激に応答して変化するシグナル伝達脂質ています。この記事では、代謝的に抽出し、脱アシル化に続いて3 H- ミオ -イノシトールの 、で細胞を標識することによりホスホイノシチドの豊かさを測定する方法について説明します。抽出グリセロinositidesは次に高速液体クロマトグラフィーにより分離し、フローシンチレーションによって定量化されます。...

高速液体クロマトグラフィー結合フローシンチレーションにより放射性標識およびホスホイノシチドの細胞レベルの定量化

PI（4,5）P 2は、様々な細胞機能を調節するが、細胞の原形質膜でのナノスケール組織はあまり理解されています。標識PI（4,5）プレクストリン相同ドメインに融合された二重色蛍光プローブとP 2によって、我々はナノメートルスケールでの原形質膜中のP 2空間分布（4,5）PIを研究するための新規な方法を記載します。...

新規蛍光プローブと形質膜におけるホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸の単分子超解像イメージング

私たちは、オプシンで再構成された大きな単層リポソームにおけるリン脂質のスクランブルを測定するための蛍光ベースのアッセイについて説明します。...

リン脂質スクランブラーゼ活性の蛍光ベースのアッセイ

pH感受性蛍光体で膜タンパク質の細胞外ドメインをラベリング、superecliptic pHluorin（SEP）は、細胞内局在、発現、および人身売買を決定することができます。全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）の撮像SEP-標識されたタンパク質は、末梢ERおよび原形質膜中のタンパク質レベルの定量化を可能にします。...

細胞内局在や人身売買を監視するpHluorinタグ付き受容体を利用します

このプロトコルは細胞のエキソサイトーシスおよびendocytosis周期の間に脂質の膜の交通を監視するのにpH敏感な脂質のfluorohoresのクラスを使用する蛍光性イメージ投射方法を示す。...

pH 感受性蛍光脂質アナログ ND6 による膜脂質代謝回転の測定(英語)

このプロトコルでは、TIRF顕微鏡を使用して個々のイオンチャネルを追跡し、支持された脂質膜におけるそれらの活性を決定し、それによって側方膜の動きとチャネル機能の間の相互作用を定義する方法について説明します。メンブレンの準備、データの記録、および結果の分析方法について説明します。...

全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を用いた脂質二重膜の横方向移動度とイオンチャネル活性の1分子イメージング(英語)

シクロデキストリンを使用して、原形質膜の脂質と外因性脂質との交換を仲介する方法について説明します。この手法は、脂質ラフト様環境と非ラフト様環境で異なる振る舞いをする膜貫通タンパク質を研究する実験と組み合わせることができます。...

生細胞における脂質交換アッセイ

学ぶ蛍光ベースの測定法で、酵母Osh6pタンパク質によるホスファチジルセリンとホスファチジルイノシトール4-リン酸の膜間輸送を解析します。人工リポソームを用いたリアルタイム動態評価により、真核細胞の脂質分布メカニズムを解明します。

ホスファチジルセリン/ホスファチジルイノシトール4-膜間のリン酸交換の蛍光ベースの測定

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