Name: CLARITY組織クリアリング法による全マウントレティナの免疫染色 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 学ぶCLARITY組織クリアリング法によるマウス全マウントレティナの免疫染色プロトコル。高解像度三次元イメージングで網膜ニューロンの細胞・亜細胞構造を可視化し、疾患状態での形態変化を解析する。

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Bing、ネイサン・スピックス、ハオ・リュウの技術サポートに感謝します。この研究は、国立衛生補助金協会EY022640(D.-Q.Z.)とオークランド大学プロボスト学部学生研究賞(E.J.A.)によって支援されました。

マウスケアと実験手順は、実験動物のための国立衛生研究所のガイドラインに従って行われ、オークランド大学の施設動物のケアと使用委員会によって承認されました(プロトコルNo. 18071)。
注: ソリューションの名前とその構成を 表 1に示します。
1. 組織の準備
<ol><li>マウスをCO2の過剰摂取で安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼を行う。</li>
	<li>湾曲した鉗子で目を核とし、0.1 M PBSの小さなシャーレに移す(表1)。解剖顕微鏡の下で、角膜スクレラ接合部に沿って小さな穴を針で突く。4%パラホルムアルデヒド(PFA)に1時間移します。</li>
	<li>目をPBSの皿に戻します。解剖顕微鏡の下で、角膜スクレラ接合部の周りのすべての方法をカットするために解剖はさみを使用しています。角膜とレンズを取り外します。視神経の基部で切断し、慎重に脱皮を鉗子で剥がし、残性を分離します。</li>
	<li>レティナの周りに4つの小さな切り傷を均等にし、PBSに浸した細かい先端ブラシを使用して、ニトロセルロース濾紙から切り取られた小さな正方形の上にクローバーのような形で平らに(GCL側を下に)置き、レチナを安定させます。</li>
	<li>鉗子を使ってレチナをニトロセルロース紙の角を保持し(取り付けられたレチナに触れず)、4%PFAの48ウェルプレートに1時間置きます。</li>
	<li>フィルターペーパーとレチナをPBSでウェルに移し、洗浄します(3倍で5分間ずつ)。</li>
	<li>A4P0(表1)に移し、穏やかな攪拌で一晩4°Cでインキュベートする。</li>
	<li>ピペット植物油を井戸に入れ、A4P0溶液を完全にカバーします。40°Cの水浴で3時間、振盪を起さないでインキュベートします。</li>
	<li>PBSで(それぞれ5分間3倍)洗浄し、すべての油が洗い流されていることを確認します。必要に応じて、最後のすすめの前に、残りの油を慎重にウェルの上部から除去するためにピペットを使用してください。</li>
	<li>穏やかな揺れで2日間40°Cで10%SDSでインキュベート。2日目にSDSを新しいソリューションに交換してください。</li>
	<li>濾紙とレチナをトリトンX-100(PBST、 表1)でPBSに移し、洗浄(それぞれ1.5時間5倍)します。</li>
	<li>PBSTで4°Cで0.01%アジドナトリウム(NaN3)で保存するか、免疫染色に直接移動します。</li>
</ol>2. 免疫染色と屈折率のマッチング
<ol><li>PBSTの細かい先端ブラシで軽く剥がして、フィルター紙からレチナを取り除きます。</li>
	<li>一次抗体にレチナをインキュベートする (表2)ブロッキング溶液に希釈した(表1)を緩やかに振るとともに40°Cで2日間培養する。</li>
	<li>PBSTで(5倍、1.5時間)洗浄します。</li>
	<li>適切な二次抗体を用いてインキュベートする(表3)を緩やかに振盪して40°Cで2日間ブロッキング溶液に希釈し、残りの手順を通して光から保護する。</li>
	<li>0.02 Mリン酸緩衝液( 表1参照)で洗浄(5x、1.5時間ずつ)</li>
	<li>ソルビトールベースの屈折率マッチング溶液(sRIMS、 表1参照)で一晩で穏やかな揺れでインキュベートする。</li>
</ol>3. 取り付け
<ol><li>ガラス顕微鏡スライドの背面に正方形の境界をマークするために、細かい先端の永久マーカーと18 mm x 18 mm x 1.5 mmガラスカバースリップを概説します。</li>
	<li>スライドを裏返し、シリンジを使用してスライドの前面にシリコーングリースの細い線で境界をトレースし、余分な取り付け溶液が逃げるために1つのコーナーに小さなギャップを残します。</li>
	<li>有形分を境界領域の中央に移し、ガラススライドに対して感光体側に平らに置くように細かい先端ブラシで配置します。</li>
	<li>ピペットのsRIMSは約60 μLで平坦なレチナを覆い、エンクロージャの一角まで伸び、レチナは平らで所定の位置に留まるように注意します。</li>
	<li>sRIMSでコーナーから始まるカバースリップを塗布し、気泡の形成を避け、すべての側面のグリースに触れるまでゆっくりと下げます。</li>
	<li>取り付けられたレティナの両側に3つのカバーリップのスタックをスペーサーとして配置します。別のスライドの長いエッジを使用してカバースリップを押し下げて、マウントが平らで均等になるようにします。</li>
	<li>スライドはイメージングまで4°Cで平らに保管してください。</li>
</ol>4. イメージング
<ol><li>従来の蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡上の画像サンプル (材料表)顕微鏡のステージにスライドを配置し、サンプルを見つけることから始めます。 注:反転された目的顕微鏡を使用している場合は、スライドを上向きに上に置き、まずスライドの露出した領域がすべてのシリコーングリースと取り付け溶液から離れているかどうかを確認します。</li>
	<li>共標識サンプルのZ積層画像を得るためには、まず各チャンネルの信号に個別に焦点を合わせ、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡の露光時間または走査速度を設定します。</li>
	<li>目的の範囲の上部と下部に焦点面を手動で設定するか、中点を設定してから中点の周囲の範囲を指定して、Z スタックの範囲を設定します。</li>
	<li>必要に応じて、ステップサイズまたはスライス数を調整します。</li>
	<li>イメージをキャプチャして元のファイルを保存し、TIFF ファイルまたはその他の目的の形式でエクスポートします。</li>
</ol>5. 画像解析
<ol><li>選択の画像解析ソフトウェアを使用して選択して (材料表)、Zスタックの単一の画像と3次元レンダリングの両方で最適な明瞭度が達成されるまで、各チャンネルの明るさとコントラストを調整します。 注:選択したステップサイズが十分に小さい場合、3Dデコンボリューションを実行して信号を強化することもできます。</li>
</ol>

<ol><li>Witkovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+and+retinal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Documenta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Dopamine and retinal function.</a> Documenta Ophthalmologica. 108 (1), 17-40 (2004).</li>
<li>McMahon, D. G., Iuvone, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+organization+of+the+mammalian+retina%3A+from+gene+regulation+to+physiology+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Circadian organization of the mammalian retina: from gene regulation to physiology and diseases.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 39, 58-76 (2014).</li>
<li>Prigge, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M1+ipRGCs+Influence+Visual+Function+through+Retrograde+Signaling+in+the+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">M1 ipRGCs Influence Visual Function through Retrograde Signaling in the Retina.</a> Journal of Neuroscience. 36 (27), 7184-7197 (2016).</li>
<li>Zhang, D. Q., Belenky, M. A., Sollars, P. J., Pickard, G. E., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanopsin+mediates+retrograde+visual+signaling+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Melanopsin mediates retrograde visual signaling in the retina.</a> PLoS One. 7 (8), 42647(2012).</li>
<li>Liu, L. L., Alessio, E. J., Spix, N. J., Zhang, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+GluA2-containing+calcium-impermeable+AMPA+receptors+on+dopaminergic+amacrine+cells+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Expression of GluA2-containing calcium-impermeable AMPA receptors on dopaminergic amacrine cells in the mouse retina.</a> Molecular Vision. 25, 780-790 (2019).</li>
<li>Liu, L. L., Spix, N. J., Zhang, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+Receptors+Contribute+to+Retrograde+Synaptic+Transmission+from+Ganglion+Cell+Photoreceptors+to+Dopaminergic+Amacrine+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NMDA Receptors Contribute to Retrograde Synaptic Transmission from Ganglion Cell Photoreceptors to Dopaminergic Amacrine Cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 279(2017).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332(2013).</li>
<li>Poguzhelskaya, E., Artamonov, D., Bolshakova, A., Vlasova, O., Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+method+to+perform+CLARITY+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Simplified method to perform CLARITY imaging.</a> Molecular Neurodegeneration. 9, 19(2014).</li>
<li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs.</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li>
<li>Magliaro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+CLARITY%3A+Quantitative+Optimization+of+the+Diffusion+Based+Delipidation+Protocol+for+Genetically+Labeled+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Clarifying CLARITY: Quantitative Optimization of the Diffusion Based Delipidation Protocol for Genetically Labeled Tissue.</a> Frontiers in Neuroscience. 10, 179(2016).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Zheng, H., Rinaman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+CLARITY+for+visualizing+immunofluorescence+labeling+in+the+developing+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain.</a> Brain Structure and Function. 221 (4), 2375-2383 (2016).</li>
<li>Witkovsky, P., Arango-Gonzalez, B., Haycock, J. W., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+retinal+dopaminergic+neurons%3A+differential+maturation+of+somatodendritic+and+axonal+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Rat retinal dopaminergic neurons: differential maturation of somatodendritic and axonal compartments.</a> Journal of Comparative Neurology. 481 (4), 352-362 (2005).</li>
</ol>

著者らは、競合する財政的利益を宣言しない。

全マウントのレティナのためのCLARITYプロトコルの変更。 我々は、ほとんどの以前の研究7、9、11で使用されているように、真空排気または乾燥室を必要とせずに適切な重合を達成するためにCLARITYプロトコルを簡素化しました。重合プロセスは酸素によって阻害され、プロトコルの重合工程中に試料を空気から単離することを要求する。しかし、窒素で脱気するのではなく、前述の12のように、徹底的にリンスした後のプロトコルの残りの部分に悪影響を及ぼすことなく重合を可能にするサンプルを十分に単離したサンプルを油で覆うことを発見した。我々はさらに、受動的なクリアリング法を用いてプロトコルを簡素化し、電気泳動クリアリング11に関連する組織構造に対する組織の褐変および損傷のリスクを制限した。受動のクリアリングは穏やかな動揺および上昇温度によ...

脊椎動物の残りは、おそらく中枢神経系(CNS)の最もアクセスしやすい部分であり、脳の発達、構造、機能を研究するための優れたモデルとして機能します。レチナ内の5つのクラスのニューロンは、2つのプレキシフォーム層で分離された3つの核層に分布する。外核層(ONL)は、光を電気信号に変換する古典的な感光体(ロッドとコーン)で構成されています。電気信号は、双極細胞、水平細胞、アマクリン細胞を含む内部核層(INL)のニューロンによって処理され、次いで神経節細胞層(GCL)の神経節細胞(RCL)に伝達される。RGCは、画像形成および非画像形成視覚機能に寄与するために脳に突出する軸索を有する、レティナの出力ニューロンである。さらに、3種類のグリア細胞(ミュラー細胞、アストログリア、ミクログリア)は、ニューロンに栄養素を提供し、細胞外環境の有害な変化からニューロンを保護します。
アマセリン細胞の特殊な亜集団の1つは、CNSにおける重要な神経調節薬であるドーパミンを産生および放出し、光の適応中に神経回路を再構成する1,2。ドーパミン作動性アマリン細胞(DAC)は、形態学的プロファイルのユニークな特徴を有する。彼らのソマトンは近位INLにあり、内膜層(IPL)の最も遠位部分にデンドライトが出る。DACの軸索のようなプロセスは、非髄膜、薄くて長く、まばらに分岐し、静脈瘤(ドーパミン放出の部位)です。それらはAIIアマトリン細胞のソマトンの周りのリングのような構造を含むIPLのデンドライトを有する密な神経叢を形成する。軸索はまた、OPLに向かってINLを通って走り、レティナ3を横切る遠心経路を形成する。我々は、DACプロセスが、双極性細胞および本質的に感光性神経節細胞(ipRGCs)4、5、6を含むシナプス前ニューロンからのグルタミン酸放出に応答して受容体を発現することを実証した。しかし、グルタミン酸受容体が軸索、樹状突起、あるいはその両方に発現するかどうかは、垂直の筋切片で切断され、互いに区別できないため5,6である。免疫染色は、DCの3次元分岐と細胞内区画上のグルタミン酸受容体の存在を明らかにするために、全型型のレチナで行う必要があります。レティナは比較的透明ですが、マウス全型型のレティナの厚さは約200μmで、深部組織への抗体の浸透を制限し、組織光散乱による高解像度イメージングのための光の浸透を低減します。これらの制限を克服するために、我々は、マウスのレチナを全マウントするに厚い脳切片のために最近開発された免疫染色適合組織ヒドロゲル脱脂質化法(CLARITY)を適応させました。
クラリティ法は、もともと、太い脳試料7の免疫染色およびイメージングのためにDeisseroth研究所によって開発されました。強力な洗剤、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、電気泳動を使用して脂質成分(組織光散乱を引き起こす)を除去し、タンパク質と核酸を所定の位置に残します。除去された脂質は、残りのタンパク質構造を支持するためにアクリルアミドなどのヒドロゲルモノマーで構成された透明な足場に置き換えられる。クリアされた組織は、免疫組織化学を介して標識することができ、組織を通して実質的に増加した光の浸透深さ(組織表面の下数ミリメートルまで)で画像化することができます。それ以来、CLARITY法は、いくつかの研究グループ8、9、10によって最適化され、簡素化されています。修飾されたCLARITYプロトコルは、受動的なクリア技術を使用して、全脳および他の無傷の器官11をクリアするための電気泳動によって生じる可能性のある組織損傷を回避する。しかし、この方法はまだ全マウントのレティナには適用されていません。ここでは、全身マウントレチナの受動的なCLARITY技術を応用し、免疫組織化学やイメージングに対して透明性を高めました。我々は、試験されたレチンタンパク質の大部分が免疫細胞化学のこのプロセス中に保存されたことを発見した。屈折率マッチングソリューションを用いて、ONLからGCLまでの約200μmの厚さにわたって、全型型のレティナでレチン性ニューロンを画像化することができました。

<table><tbody><tr><td>16% パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>15710</td><td>固定剤</td></tr><tr><td>アクリルアミド</td><td>フィッシャー バイオテクノロジー</td><td>BP170</td><td>ヒドロゲルモノマー</td></tr><tr><td>Axio Imager.Z2</td><td>ツァイス</td><td></td><td>蛍光顕微鏡</td></tr><tr><td>BSA</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1600</td><td>ブロッキング剤</td></tr><tr><td>エクリプス Ti</td><td>ニコンインスツルメンツ</td><td></td><td>スキャニング 共焦点顕微鏡</td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>BDH0258</td><td>バッファー成分</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>バッファー成分</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9763</td><td>バッファー成分</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>バッファー成分</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0751</td><td>バッファー成分</td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td>静菌防腐剤</td></tr><tr><td>NDS</td><td>Aurion</td><td>900.122</td><td>ブロッキング剤</td></tr><tr><td>NIS Elements AR</td><td>ニコン</td><td></td><td>画像解析ソフト</td></tr><tr><td>SDS</td><td>BioRad</td><td>1610301</td><td>Delipidation agent</td></tr><tr><td>ソルビトール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51876</td><td>バッファーコンポーネント</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>界面活性剤</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP337</td><td>界面活性剤</td></tr><tr><td>VA-044</td><td>和光ケミカルズ</td><td>011-19365</td><td>サーマルイニシエータ</td></tr></tbody></table>

clarity組織クリアリング法による全マウントレティナの免疫染色

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

もともと、Deisseroth研究室で開発された組織ヒドロゲル脱脂法(CLARITY)は、厚い脳試料の免疫染色およびイメージングに改変され、広く使用されている。しかし、この高度な技術はまだ全マウントのレティナには使用されていません。レティナは部分的に透明ですが、その厚さは約200μm(マウス)であり、依然として抗体の深部組織への浸透を制限し、高解像度イメージングのための光の浸透を減少させる。ここでは、アクリルアミドモノマーで重合してナノ多孔質ヒドロゲルを形成し、タンパク質の損失を最小限に抑え、組織の損傷を避けるためにドデシル硫酸ナトリウムでクリアすることで、マウス全実装のレチナにCLARITY法を適合させました。CLARITY処理されたレチナを、レチナルニューロン、グリア細胞、シナプスタンパク質に対する抗体で免疫染色し、屈折率整合溶液に搭載し、画像化した。我々のデータは、CLARITYが全型実装におけるレチナルニューロンおよびグリア細胞の標準的な免疫物質化学的染色およびイメージングの品質を向上させることができることを示している。例えば、ドーパミン作動性アマリン細胞の微細軸索様および樹状構造の3D分解能は、CLARITYによって大幅に改善された。非処理型全型型レチナと比較して、CLARITYは、ポストナプティック密度タンパク質95などのシナプスタンパク質の免疫染色を明らかにすることができる。我々の結果は、CLARITYが脂質の除去後にレチナをより光学的に透明にし、レチナルニューロンとそのタンパク質の微細な構造を保存することを示し、これは全型実装中のレチナルニューロンとその細胞下構造の高解像度イメージングを得るために日常的に使用することができる。

修飾されたCLARITY処理されたレチナは、光学的に透明な組織である。 十分な脱脂を提供し、細胞タンパク質の構造的完全性を保持しながら、レチナにおける免疫組織化学的用途と互換性のある組織クリアリング方法を策定するために、我々は、マウスの全実装にCLARITY組織クリアリング法を適合させた。プロトコルを簡素化し、全体マウントの retinas 用に変更することができました (プロトコルを参照)。組織ハイブリダイゼーション、クリア、および屈折率マッチングを完了した後、この修飾されたCLARITYプロトコルで処理されたレチナは、非処理対照レチナと比較した場合に、レチナの厚さ全体にわたってほぼ完全な光学透過性を示した(図1B)。この結果は、CLARITYプロトコルのこの改変が十分にクリアされた全マウントの残りの組織を提供することを示す。
修飾したCLARITY処理されたレティナにおけるニューロンの3Dイメージングを改...

ここでは、脳組織のCLARITY法を全マウントレチナに適応させ、標準的な免疫組織化学染色およびレチナルニューロンとその細胞下構造の高解像度イメージングの品質を向上させるプロトコルを提示する。

CLARITY組織クリアリング法による全マウントレティナの免疫染色

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...

このプロトコルは、眼疾患ニューロンの微細形態の調査を可能にし、疾患状態で起こる細胞および細胞下形態変化に関する洞察を与えることができる。この方法は、レチナの光透過性を大幅に向上させ、ホルモンのレチナ調製物における高解像、3次元イメージング、回路配線、および細かい細胞下の細胞構造を可能にする。湾曲した鉗子でマウスの目を核とし、0.1 M PBSの小さなペトリ皿に移します。角膜強膜接合部に沿って小さな穴を開けて針を解剖顕微鏡で針に突き刺し、その後、眼を4%パワーホルムアルデヒドに1時間移します。目をPBSの皿に戻します。解剖顕微鏡の下で、角膜側接合部の周りのすべての方法を切断するために解剖はさみを使用してください。角膜とレンズを取り外します。その後、視神経の基部でそれをカットし、慎重に残りの部分を分離するために鉗子で強皮を剥がします。レティナの周りに4つの小さなカットを均等に行い、PBSに浸した細かい先端ブラシを使用して、ニトロセルロース濾紙から切り取られた小さな正方形のクローバーのような形で平らなGCL側に置きます。ニトロセルロース紙の隅を鉗子で拾い、4%パワーホルムアルデヒドを備えた48ウェルプレートに1時間置き、フィルターペーパーとレチナをPBSで井戸に移し、それぞれ5分間3回洗浄します。氷の上にA4P0溶液を解凍します。その後、A4P0溶液にレチナを移し、穏やかな攪拌で摂氏4度で一晩インキュベートします。植物油を井戸に加えて、A4P0溶液を完全にカバーします。摂氏40度の水浴で3時間、揺れずとインキュベートします。その後、PBSで1回5分間洗浄します。穏やかな揺れで摂氏40度で10%のデセシル硫酸ナトリウムでレティナをインキュベートし、濾紙とレティナをトリトンX-100でPBSに移し、1回の洗浄で90分間5回洗浄します。最終洗浄後、0.01%のアジドナトリウムでPBS-Tに摂氏4度でレチナを保存するか、免疫染色に直接移動します。PBS-Tの細かい先端ブラシで軽く剥がして、フィルター紙からレチナを取り除きます。穏やかな揺れで摂氏40度で2日間ブロッキング溶液で希釈された一次抗体でインキュベート。インキュベーション後、PBS-Tで90分間5回洗浄する。緩やかな揺れで摂氏40度で2日間ブロッキング溶液に希釈された適切な二次抗体でレティナをインキュベートする。手順の残りの部分を通して、光からサンプルを保護します。0.02 Mリン酸緩衝液で90分間、レチナを5回洗浄します。最後に、ソルビトールベースの屈折率マッチング溶液で、一晩穏やかな揺れで摂氏40度でレチナをインキュベートします。ガラス顕微鏡スライドの背面に正方形の境界をマークするために、細かい先端の永久マーカーでガラスカバースリップを概説します。スライドを裏返し、シリンジを使用して、スライドの前面にシリコーングリースの細い線で境界をトレースします。脱出するために余分な取り付け溶液のために1つのコーナーに小さなギャップを残します。有形領域の中央にレチナを移し、ガラススライドに対して感光体側と平らに横たわるように細かい先端ブラシで配置します。ピペットは約60マイクロリットルのsRIMSを平らにされたレチナを覆い、エンクロージャの一角まで伸びるようにする。レティナが平らで所定の位置に保たれていることを確認します。sRIMSでコーナーから始めてカバースリップを塗布し、すべての側面のグリースに触れるまでゆっくりと下げます。取り付けられたレティナの両側に3つのカバースリップの積み重ねをスペーサーとして置きます。別のスライドの長い端を使用してカバースリップを押し下げて、マウントが平らで均等になるようにします。スライドは、イメージングまで摂氏4度で保存します。顕微鏡のステージにスライドを配置し、サンプルを見つけることから始めます。サンプルのZ積層画像を取得するには、まず各チャンネルの信号に個別に焦点を合わせ、それぞれ蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡の露光時間または走査速度を設定します。目的の範囲の上下に焦点面を手動で設定するか、中点を設定してから中点の周りの範囲を指定して、Z スタックの範囲を設定します。必要に応じて、ステップサイズまたはスライス数を調整します。イメージをキャプチャし、元のファイルを保存します。その後、TIF ファイルまたは別の目的の形式としてエクスポートされます。画像解析を使用して、単一の画像とZスタックの3次元レンダリングの両方で最適な明瞭さが達成されるまで、各チャンネルの明るさとコントラストを調整するためのソフトウェアを使用します。修飾されたCLARITYプロトコルで処理した場合、レチナの厚さ全体にわたって完全な光学透過性が観察され、非処理制御レチナと比較した。ONLのスタフィンラベル付きコーンのZ積み重ね画像、INLのDACのラベル付けされたTH、GCLのRMCにマークされたRBPMSがここに示されています。全厚さのレティナ全体のニューロンの相対的な位置は、オーバーレイ画像で観察された。TH染色とCLARITY処理全体のマウントレチナを標準的な準備から得られた画像と比較した。DAのデンドライトと軸索のようなプロセスは、標準的なレチナよりも明瞭に処理された経後で明らかにされた。DACの軸索状のプロセスは、標準的なレチナと比較して、明瞭なレティナで完全なリング状の構造を示した。蛍光顕微鏡を用いて採取したCLARITYレティナのリング状構造は、共焦点顕微鏡を用いて観察されたものとほぼ同じであった。軸索のようなプロセスも外側のレティナに向かって走った。GluA2およびPSD-95に対する免疫染色は、それぞれAMPA受容体および推定ポストシナプス部位を含む個々のGluA2を明らかにし、明確な穿刺を示した。オーバーレイ画像は、DACプロセス上のいくつかのパンクタを示しました。推定共局在化のポイントは、XZ、YZ、およびXY平面で提示され、THはGluA2とPSD-95の両方と明確に共局化した。クリアされたレティナが取り付けおよびイメージングプロセスのために平らに置くことができるように、ヒドロゲル重合プロセス中にレティナが平らなままである事が重要です。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

新生児マウスの網膜は血管新生を調節する別の遺伝子や薬剤の役割の調査を可能にし、血管新生のよく特徴付け生理学的モデルを提供...

血管新生を調査するために新生児マウス網膜の全体のマウント免疫蛍光染色<em生体内で&gt;</em

ここで説明するプロトコルは、全量網膜製剤の構造評価のためのものです。これには、組織解剖、親水性ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)メンブレンインサートへのマウント、蛍光マーカーによるボーラスローディング、細胞およびシナプス成分の免疫組織化学的分析のためのカルボジイミドおよびパラホルムアルデヒドによる固定の比較の説明が含まれます。...

イメージングと免疫組織化学のための網膜ホールマウントの準備のために最適化されたプロトコル

ACT-PRESTO（器官への巨大分子のアクティブな明快技術-圧力関連の効率的かつ安定した転送）は、受動拡散または圧力補助送達によるクリア組織への、迅速、効率的な、しかし、安価な組織清算および迅速な抗体の浸透を可能にします。この方法を使用して、組織の広い範囲は、クリア複数の抗体によって免疫標識、および体積画像化することができます。...

ACT-PRESTO：生体組織のクリアとボリュームイメージングのための免疫標識方法

ラット網膜血管ペリサイト、すなわち、低温セクション、全体-マウント、および血管ネットワークの低張性分離の免疫組織化学的可視化のための 3...

網膜の低温電子顕微鏡セクション全体-マウント、および微小血管の免疫組織化学的可視化の低張性分離血管準備

抗体標識、光学クリアリング、および高度光顕微鏡検査の組み合わせにより、完全な構造または器官の3次元解析が可能になります。ここでは、厚い腎臓スライスの免疫標識、エチルシナメートによる光学クリアリング、および3次元腎臓構造の可視化と定量を可能にする共焦点イメージングを組み合わせる簡単な方法です。...

免疫標識腎組織の光学クリアリングとイメージング

このプロトコルは、ホールマウントマウス網膜を単離し、免疫染色を実施してすべての網膜神経節細胞(RGC)を標識する手順を説明しています。このプロセスに続いて、AIベースのソフトウェアを使用してRGCをイメージングし、自動的にカウントし、マウス網膜全体のRGCを定量するためのシンプルで高速かつ正確な方法を提供します。...

マウス網膜神経節細胞のホールマウント免疫染色および自動計数(英語)

蛍光トマトレクチンの眼窩後注射後、血小板由来成長因子受容体βによる免疫蛍光染色により、網膜血管系の周皮細胞を調べました。標識された網膜をさらに組織透明化法で処理し、共焦点顕微鏡下で網膜血管系を取り巻く周皮細胞の3次元ビューを視覚化するために全体をマウントしました。...

免疫染色によるマウス網膜血管周皮細胞の3D可視化 

このプロトコールは、光学的透明化と免疫標識を組み合わせて、ホールマウント網膜オルガノイドの全容積共焦点イメージングを実現します。3D構造を保持し、主要なニューロン経路の詳細な視覚化を可能にし、網膜の成熟、空間構成、および疾患モデリングや個別化医療への応用の可能性の研究を改善します。...

細胞分解能によるホールマウントRetinal Organoidの可視化

我々は段階的な準備をする手順を説明...

ホールマウントの胎児神経系の可視化ショウジョウバエ胚

末梢感覚神経線維のサブタイプの免疫細胞化学的同定（とそこにタンパク質発現の検出）が末梢感覚の分子メカニズムの理解の鍵となります。ここでは、末梢感覚神経線維の特異的免疫染色のための皮膚や四肢骨などの周辺/内臓の組織サンプル、、の調製のための方法を説明します。...

スキンと四肢骨の神経支配マウス感覚神経線維の組織の調製と免疫染色

学ぶCLARITY組織クリアリング法によるマウス全マウントレティナの免疫染色プロトコル。高解像度三次元イメージングで網膜ニューロンの細胞・亜細胞構造を可視化し、疾患状態での形態変化を解析する。

CLARITY組織クリアリング法による全マウントレティナの免疫染色

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