Name: E1Aミニジーンツールを使用したmRNAスプライシング変更の研究 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 学ぶE1Aミニジーンを用いたmRNAスプライシング変化評価法。HEK293細胞を使用し、化学療法後の選択的スプライシング制御におけるタンパク質機能を迅速かつ簡便に解析する実験プロトコルです。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我々は、フンダサン・デ・アンパロ・ア・ペスキサ・ド・エスタド・デ・サンパウロ(FAPESP、グラント・テマティコ2017/03489-1を通じて、JKとFLB 2018/05350-3へのフェローシップ)とコンセルホ・ナシオナル・デ・デセンボルメント・チエンティフィコ・エ・デセンボルメント・チエンティフィコ・エ・デセンボルメント・チエンティフィコ・エ・ココモ(この資金)に感謝します。私たちは、PMTE1AプラスミドとZerlerとE1Aクローニングでの彼らの仕事のためにpMTE1AプラスミドとZerlerと同僚を提供してくれたエイドリアン・クレイナー博士に感謝したいと思います。また、パトリシア・モリエル教授、ワンダ・ペレイラ・アルメイダ博士、マルセロ・ランチェロッティ教授、カリーナ・コゴ・コゴ・ミュラー教授の研究室スペースと機器の使用に感謝します。

1. めっき細胞
注: このプロトコルでは、以前に Nek4 の安定な誘導発現のために生成された HEK293 安定セルラインが21を使用したが、HEK293 22、HeLa23、24、25、26、U-2OS27、COS728、SH-SY5Y29のような他の多くの細胞株に適した同じプロトコルである。基底条件下でのミニ遺伝子E1Aアイソフォームの発現パターンは、これらの細胞間で異なり、各条件に対して特徴付けるべきである。このプロトコルは安定した細胞株に限定されない。候補タンパク質の評価における最も一般的なアプローチは、一過性の共トランスフェクションによるミニジーンの固定量でのその量を増加させることである。同じプロトコルは、ノックアウトセルに適しています。
<ol><li>車両、未感染およびGFPコントロールを考慮したプレート細胞。</li>
	<li>培養HEK293細胞は、牛胎児血清(FBS)の10%、4.5g/Lグルコース、4mM L-グルタミンを添加したダルベックコの改変イーグル培地(DMEM)に関心のある遺伝子の安定した発現を有し、100μg/mLのヒグロマイシンB、培養培養用プレート上での37°Cおよび2% のCO%で培養処理されたプレートに対して2%の高湿球菌体質を有する。</li>
	<li>0.25% トリプシン-EDTAを使用してセルを分割します。プレート3 x 105細胞を6ウェルプレートに入れ、5%CO2で37°Cで24時間インキュベートします。 注:トランスフェクションの場合、細胞はトランスフェクション後の細胞死を減少させるために70〜80%コンフルエントでなければなりません。</li>
</ol>2. 細胞トランスフェクション
注:pMTE1Aミニジーンプラスミドの1〜2μgを使用したが、DNA量と発現時間は、毒性を避けるために最小限に抑える必要があります。例えば、1μgのpMTE1A DNAを用いたトランスフェクションの30時間後にHeLa細胞で高い毒性が認められた。ここで説明するトランスフェクションには、脂質系トランスフェクション試薬が用いられました。
<ol><li>70-80%コンフルエントの場合にのみ、細胞合流を24時間めっきし、HEK293安定細胞をトランスフェクトした後に細胞合流をチェックする。</li>
	<li>真空ポンプシステムを使用する代わりに、ピペットで細胞培養培地を慎重に取り出します。その後、抗生物質なしで2 mLの完全なDMEM培地を慎重に加え、プレートをインキュベーターに戻します。</li>
	<li>トランスフェクションバッファー(200 μL/well)を使用してチューブを調製し、2 μgの pMTE1A DNA、ボルテックスを加え、2 μLのトランスフェクション試薬を加えます。再び渦を起たし、室温で10分間インキュベートする。</li>
	<li>インキュベーターからプレートを取り出し、慎重にトランスフェクション混合物を滴下して追加します。</li>
	<li>HEK293安定細胞に、トランスフェクション後6時間のNek4発現誘導にテトラサイクリン(0.5μg/mL)を加える。中程度の変更は必要ありません。 注: このセクションで説明するボリューム/量は、1 つの井戸用です。実験で使用されるすべてのウェルの混合物を同じチューブで準備します。</li>
	<li>EGFPでトランスフェクトする1つの井戸、または別のフッ素酸を発現するプラスミドを調製し、トランスフェクション効率を推定します。より良い結果は、少なくとも40%のトランスフェクション効率で観察することができるが、より低いトランスフェクション効率と良好な性能は以前に観察された。</li>
	<li>共トランスフェクション(関心タンパク質およびミニジーン)を使用する場合は、内因性mRNAから結果を得ることを避けるために、非トランスフェクション細胞とウェルを保ちます。E1Aの場合、HEK293細胞は既にE1A遺伝子30を発現している。</li>
</ol>3. 薬の準備
注:治療の時間と濃度は、いくつかの遺伝子の代替スプライシングの変化を指摘する文献の結果に基づいて選択されました。
<ol><li>測定を開始する前に用量応答曲線を実行し、細胞生存率に影響を及ぼさない代替スプライシング誘導に対する最小濃度を決定する。</li>
	<li>エタノール中の5 mM濃度でパクリタキセルストック溶液を調製します。最終濃度は1μMで、-20°Cに保ちます。 車両制御として0.02%エタノールを使用してください。</li>
	<li>0.5 mg/mL(1.66 mM)程度で0.9%NaClに希釈してシスプラチン溶液を調製します。熱浴で光、渦、インキュベートから保護し、30分間37°C。最終濃度は30μMで、新鮮な準備をするか、1ヶ月まで2〜10°Cで保管してください。 注:すべての薬物は、光から保護されなければなりません。</li>
</ol>4. 細胞処理と収集
注:HEK293安定細胞は、トランスフェクション後48時間回収し、このために、48時間以内に最高のNek4発現レベルが達成されるため、トランスフェクション後24時間処理した。しかし、このとき、13Sアイソフォーム発現(90%まで)の高レベルが観察された。13Sアイソフォームの割合を減少させるために、トランスフェクション最大後30時間の細胞を治療し、収集してみてください。
<ol><li>RNA/DNaseフリーのチップとチューブを使用してください。メーカーの推奨に従ってフェノールクロロホルム試薬を使用して、トータルRNA抽出を行います。</li>
	<li>トランスフェクション後24時間、蛍光顕微鏡を用いて細胞形態およびトランスフェクション効率を検証する。</li>
	<li>細胞培養培地を除去し、真空ポンプシステムの代わりにピペットを優先的に使用する。次に、先に述べた最終濃度の化学療法薬を用いて細胞培養培地を添加する。</li>
	<li>37°Cでインキュベートし、18〜24時間の5%CO2。</li>
	<li>細胞培養培地を容器に捨て、0.5~1mLのRNA抽出試薬を直接ウェルに添加してRNAを回収します。ウェルが非常にコンフルエントである場合は、RNAの品質を向上させるために1 mLのRNA抽出試薬を使用してください。</li>
	<li>ピペットで均質化し、1.5 mL遠心分離管に移します。この時点で、プロトコルは、-80°Cでサンプルを保存することによって一時停止するか、またはすぐにRNA抽出に進むことができます。 警告:フェノールベースのRNA抽出試薬は有毒であり、すべての手順は化学ヒュームフードで行われ、残渣は適切に配置する必要があります。</li>
</ol>5. RNA抽出とcDNA合成
<ol><li>ヒュームフードではサンプルを解凍し、室温で5分間インキュベートします。0.1 -0.2 mLのクロロホルムを加え、激しく攪拌します。</li>
	<li>室温で3分間インキュベートします。</li>
	<li>遠心分離機 15分間 12,000 x g および 4 °C.</li>
	<li>上部水相を収集し、新しい1.5 mL遠心分離管に移します。総量の約60%を収集します。ただし、DNAまたは有機(低)相を収集しないでください。</li>
	<li>0.25 - 0.5 mLのイソプロパノールを加え、反転によって4回攪拌します。室温で10分間インキュベートします。</li>
	<li>遠心分離機は10分間10分間、4°Cで遠心分離機を使用し、上清を捨てます。 </li>
	<li>RNAペレットをエタノールで2回洗浄します(75%のジエチルピロカーボネート(DEPC)処理水)。7,500 x g で5分間遠心分離機を使用し、エタノールを捨てます。</li>
	<li>タオルペーパーでチューブを反転させて余分なエタノールを取り除き、チューブをヒュームフードの内側に開けてペレットを5〜10分間部分的に乾燥させます。</li>
	<li>RNAペレットを15μLのDEPC処理水で再懸濁します。</li>
	<li>230 nm、260 nm、および 280 nm の吸光度を使用して、RNA の品質を確認するために、合計 RNA を定量化します。</li>
	<li>RNAの全品質を確認するために、1%アガロースゲルを1.2%(v/v)の2.5%次亜塩素酸ナトリウム溶液で30分間31分間前処理して実行します。</li>
	<li>1~2 μgのRNAを使用してcDNA合成を行います。<ol>
<li>ピペットRNA、オリゴdT(50μM)1 μL、dNTP(10 mM)の1 μL、ヌクレアーゼフリー水で体積を12 μLにします。サーモサイクラーで65°Cで5分間インキュベートします。</li>
		<li>サーモサイクラーからサンプルを取り出して冷却し、反応混合物を調製します:4 μLの逆転写酵素バッファー、ジチオスライトール2 μL(DTT)、リボヌクレアーゼ阻害剤1μL。37°Cで2分間インキュベートします。</li>
		<li>熱安定性の逆転写酵素を1 μL加えます。37°Cで50分間インキュベートし、70°Cで酵素を15分間不活性化します。 注:cDNAは-20°Cで数週間保存できます。推定イントロン保持イベントによるゲノム汚染に対する非逆転写酵素(NRT)制御を行う。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. pMTE1A ミニジーン PCR
<ol><li>反応組成物(MgCl2の1.5 mM、0.3 mMのdNTPミックス、各プライマーの0.5 μM、ホットスタートTaqポリメラーゼの2.5 Uおよび150 ngのcDNA)を用いてPCRを行います。 94°C 2分、29サイクル:94°C1分、50°C2分、72°C2分、72°C10分。</li>
	<li>PCR産物の20~25μLを核酸染色を含む3%アガロースゲルに負荷し、約1時間100Vで実行します。</li>
</ol>7. 画像処理および解析ソフトウェアを用いたゲルの解析32
<ol><li>実行後、任意のバンド飽和を避けるゲル(ゲルイメージング取得システムを使用して)を撮影し、画像処理ソフトウェアを使用してバンドを定量化します。</li>
	<li>定量化については、~631bp、〜493bp、および〜156bpの各バンドをそれぞれ13S、12Sおよび9Sアイソフォームに対応することを検討する。</li>
	<li>ソフトウェアの [ファイル] メニューから、撮像収集システムから取得した画像ファイルを開きます。グレースケールに変換し、明るさとコントラストを調整し、必要に応じて外れ値のノイズを除去します。</li>
	<li>長方形選択ツールで最初の車線の周囲に 長方形 を描き、解析|を使用して選択します 。ゲル|[最初のレーン] コマンドを選択するか、キーボードショートカットを押します。</li>
	<li>マウスを使用して、最初のレーンの長方形の中央をクリックして押さえた後、次のレーンにドラッグします。 分析|へ移動ゲル|[次のレーン] を選択するか、使用可能なショートカットを押します。残りのすべてのレーンにこの手順を繰り返します。</li>
	<li>すべてのレーンがハイライト表示され、番号が付いた後、[ 分析] |ゲル|各レーンの プロファイルプロットを描画するには、レーンをプロットします。</li>
	<li>直線選択ツールを使用して、各バンドに対応する各ピークの底部に線を引き、バックグラウンドノイズを省きます。すべてのピークが閉じられた後、すべての車線から、ワンドツールを選択し、各ピークの内側をクリックします。ハイライト表示された各ピークに対して、表示される[結果] ウィンドウに測定値がポップアップ表示されます。</li>
	<li>各サンプルの 3 バンドすべてから強度を合計し、合計に対する各アイソフォームの割合を計算します。</li>
	<li>各アイソフォームのパーセンテージまたは未処理サンプルに対する割合の差をプロットします。 注: 3 つの E1A バリアントの合計が 100% に等しくなければなりません。</li>
</ol>

<ol><li>Ule, J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+Splicing+Regulatory+Networks%3A+Functions%2C+Mechanisms%2C+and+Evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Alternative Splicing Regulatory Networks: Functions, Mechanisms, and Evolution.</a> Molecular Cell. 76 (2), 329-345 (2019).</li>
<li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nature Genetics. 40 (12), 1413-1415 (2008).</li>
<li>Nilsen, T. W., Graveley, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+the+eukaryotic+proteome+by+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing.</a> Nature. 463 (7280), 457-463 (2010).</li>
<li>Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+and+their+transduction+pathways+regulating+alternative+splicing%3A+a+new+dimension+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Signals and their transduction pathways regulating alternative splicing: a new dimension of the human genome.</a> Human Molecular Genetics. 11 (20), 2409-2416 (2002).</li>
<li>Kornblihtt, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing%3A+a+pivotal+step+between+eukaryotic+transcription+and+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).</li>
<li>Zhong, X. -Y., Ding, J. -H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+SR+protein+phosphorylation+and+alternative+splicing+by+modulating+kinetic+interactions+of+SRPK1+with+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones.</a> Genes & Development. 23 (4), 482-495 (2009).</li>
<li>Misteli, T., Cáceres, J. F., Clement, J. Q., Krainer, A. R., Wilkinson, M. F., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serine+Phosphorylation+of+SR+Proteins+Is+Required+for+Their+Recruitment+to+Sites+of+Transcription+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Serine Phosphorylation of SR Proteins Is Required for Their Recruitment to Sites of Transcription In Vivo.</a> Journal of Cell Biology. 143 (2), 297-307 (1998).</li>
<li>Kanopka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+adenovirus+alternative+RNA+splicing+by+dephosphorylation+of+SR+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of adenovirus alternative RNA splicing by dephosphorylation of SR proteins.</a> Nature. 393 (6681), 185-187 (1998).</li>
<li>Anufrieva, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapy-induced+stress+response+is+associated+with+downregulation+of+pre-mRNA+splicing+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Therapy-induced stress response is associated with downregulation of pre-mRNA splicing in cancer cells.</a> Genome Medicine. 10 (1), 49(2018).</li>
<li>Shultz, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRSF1+Regulates+the+Alternative+Splicing+of+Caspase+9+Via+A+Novel+Intronic+Splicing+Enhancer+Affecting+the+Chemotherapeutic+Sensitivity+of+Non-Small+Cell+Lung+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">SRSF1 Regulates the Alternative Splicing of Caspase 9 Via A Novel Intronic Splicing Enhancer Affecting the Chemotherapeutic Sensitivity of Non-Small Cell Lung Cancer Cells.</a> Molecular Cancer Research. 9 (7), 889-900 (2011).</li>
<li>Gabriel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+splicing+factor+SRSF4+in+cisplatin-induced+modifications+of+pre-mRNA+splicing+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Role of the splicing factor SRSF4 in cisplatin-induced modifications of pre-mRNA splicing and apoptosis.</a> BMC Cancer. 15, (2015).</li>
<li>Lee, S. C. -W., Abdel-Wahab, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+targeting+of+splicing+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Therapeutic targeting of splicing in cancer.</a> Nature Medicine. 22 (9), 976-986 (2016).</li>
<li>Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+minigene+systems+to+dissect+alternative+splicing+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements.</a> Methods. 37 (4), 331-340 (2005).</li>
<li>Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+minigene+approach+to+analyze+tissue-specific+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing.</a> Brain Research Protocols. 4 (3), 383-394 (1999).</li>
<li>Zerler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+E1A+coding+sequences+that+enable+ras+and+pmt+oncogenes+to+transform+cultured+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Adenovirus E1A coding sequences that enable ras and pmt oncogenes to transform cultured primary cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 6 (3), 887-899 (1986).</li>
<li>Gattoni, R., Schmitt, P., Stevenin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+splicing+of+adenovirus+E1A+transcripts%3A+characterization+of+novel+reactions+and+of+multiple+branch+points+abnormally+far+from+the+3%27+splice+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro splicing of adenovirus E1A transcripts: characterization of novel reactions and of multiple branch points abnormally far from the 3' splice site.</a> Nucleic Acids Research. 16 (6), 2389-2409 (1988).</li>
<li>Stephens, C., Harlow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+splicing+yields+novel+adenovirus+5+E1A+mRNAs+that+encode+30+kd+and+35+kd+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Differential splicing yields novel adenovirus 5 E1A mRNAs that encode 30 kd and 35 kd proteins.</a> The EMBO journal. 6 (7), 2027-2035 (1987).</li>
<li>Ulfendahl, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+adenovirus-2+E1A+mRNA+encoding+a+protein+with+transcription+activation+properties%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">A novel adenovirus-2 E1A mRNA encoding a protein with transcription activation properties.</a> The EMBO journal. 6 (7), 2037-2044 (1987).</li>
<li>Berk, A. J., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+adenovirus+2+early+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of the adenovirus 2 early mRNAs.</a> Cell. 14 (3), 695-711 (1978).</li>
<li>Svensson, C., Pettersson, U., Akusjärvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+of+adenovirus+2+early+region+1A+mRNAs+is+non-sequential%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Splicing of adenovirus 2 early region 1A mRNAs is non-sequential.</a> Journal of Molecular Biology. 165 (3), 475-495 (1983).</li>
<li>Basei, F. L., Meirelles, G. V., Righetto, G. L., dos Santos Migueleti, D. L., Smetana, J. H. C., Kobarg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+interaction+partners+for+Nek4.1+and+Nek4.2+isoforms%3A+from+the+DNA+damage+response+to+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Science%22%5BJournal%5D)">New interaction partners for Nek4.1 and Nek4.2 isoforms: from the DNA damage response to RNA splicing.</a> Proteome Science. 13 (1), 11(2015).</li>
<li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Akt-SRPK-SR+Axis+Constitutes+a+Major+Pathway+in+Transducing+EGF+Signaling+to+Regulate+Alternative+Splicing+in+the+Nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The Akt-SRPK-SR Axis Constitutes a Major Pathway in Transducing EGF Signaling to Regulate Alternative Splicing in the Nucleus.</a> Molecular Cell. 47 (3), 422-433 (2012).</li>
<li>Caceres, J., Stamm, S., Helfman, D., Krainer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+alternative+splicing+in+vivo+by+overexpression+of+antagonistic+splicing+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of alternative splicing in vivo by overexpression of antagonistic splicing factors.</a> Science. 265 (5179), 1706-1709 (1994).</li>
<li>Zhong, X. -Y., Ding, J. -H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+SR+protein+phosphorylation+and+alternative+splicing+by+modulating+kinetic+interactions+of+SRPK1+with+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones.</a> Genes & Development. 23 (4), 482-495 (2009).</li>
<li>Naro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+centrosomal+kinase+NEK2+is+a+novel+splicing+factor+kinase+involved+in+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The centrosomal kinase NEK2 is a novel splicing factor kinase involved in cell survival.</a> Nucleic Acids Research. 42 (5), 3218-3227 (2014).</li>
<li>Lu, C. -C., Chen, T. -H., Wu, J. -R., Chen, H. -H., Yu, H. -Y., Tarn, W. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+and+Molecular+Characterization+of+the+Splicing+Factor+RBM4%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic and Molecular Characterization of the Splicing Factor RBM4.</a> PLoS ONE. 8 (3), 59092(2013).</li>
<li>Jarnæss, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+Factor+Arginine%2FSerine-rich+17A+%28SFRS17A%29+Is+an+A-kinase+Anchoring+Protein+That+Targets+Protein+Kinase+A+to+Splicing+Factor+Compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Splicing Factor Arginine/Serine-rich 17A (SFRS17A) Is an A-kinase Anchoring Protein That Targets Protein Kinase A to Splicing Factor Compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 35154-35164 (2009).</li>
<li>Bressan, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+association+of+human+Ki-1%2F57+with+pre-mRNA+splicing+events%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Functional association of human Ki-1/57 with pre-mRNA splicing events.</a> FEBS Journal. 276 (14), 3770-3783 (2009).</li>
<li>Vivarelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraquat+Modulates+Alternative+Pre-mRNA+Splicing+by+Modifying+the+Intracellular+Distribution+of+SRPK2%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Paraquat Modulates Alternative Pre-mRNA Splicing by Modifying the Intracellular Distribution of SRPK2.</a> PLoS ONE. 8 (4), 61980(2013).</li>
<li>Russell, W. C., Graham, F. L., Smiley, J., Nairn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+a+Human+Cell+Line+Transformed+by+DNA+from+Human+Adenovirus+Type+5%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5.</a> Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).</li>
<li>Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleach+gel%3A+A+simple+agarose+gel+for+analyzing+RNA+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Bleach gel: A simple agarose gel for analyzing RNA quality.</a> Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Bai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+3%27+splice+site+choice+in+vivo+by+ASF%2FSF2+and+hnRNP+A1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Control of 3' splice site choice in vivo by ASF/SF2 and hnRNP A1.</a> Nucleic Acids Research. 27 (4), 1126-1134 (1999).</li>
<li>Cote, G. J., Nguyen, N., Lips, C. J. M., Berget, S. M., Gagel, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+an+in+vitro+RNA+processing+system+for+CT%2FCGRP+precursor+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Validation of an in vitro RNA processing system for CT/CGRP precursor mRNA.</a> Nucleic Acids Research. 19 (13), 3601-3606 (1991).</li>
</ol>

著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

ミニ遺伝子は、生体内のグローバル代替スプライシングの効果を決定するための重要なツールです。このアデノウイルスミニジーンE1Aは、細胞13,14におけるこれらの量を増加させることによってタンパク質の役割を評価するために何十年も正常に使用されてきた。ここでは、化学療法曝露後の代替スプライシングを評価するためのミニジーンE1Aの使用を提案する。Nek4アイソフォーム1を発現する安定した細胞株を用い、一時的なトランスフェクションによって生じる過剰発現のアーチファクトを回避した。Nek4のアイソフォーム1は、基底条件21におけるミニ遺伝子E1A代替スプライシングに効果を示さなかったが、多くのスプライシング関連インターアクターを有し、したがって、これらの細胞におけるE1A代替スプライシングにおける化学療法治療の特異的効果を評価することを可能にする。
感度が低いにもかかわらず、主に放射性アプローチと比較して、ここで説明する方法は簡単...

スプライシングは、5'mRNAキャッピングと3'mRNAポリアデニル化に同時に発生する真核生物mRNA処理における最も重要なステップの一つです。スプライセオソームによるスプライシング部位(SS)の認識には、小さなリボヌクレオタンパク質(snRNP U1、U2、U4およびU6)を含むリボヌクレオタンパク質複合体、小さなRNA(snRNA)およびいくつかの調節タンパク質1 がスプライシングに必要である。
イントロン除去(構成スプライシング)に加えて、真核生物では、イントロンを保持することができ、エキソンを除外することができ、mRNA代替スプライシング(AS)と呼ばれるプロセスを構成する。代替プレmRNAスプライシングは、真核生物ゲノムのコード容量を拡大し、比較的少数の遺伝子から多数のタンパク質を産生することを可能にする。複数のエキソンを含むヒトmRNAの95〜100%が代替スプライシング2,3を受けることができると推定される。これは、神経細胞の発達、アポトーシス活性化および細胞ストレス応答4のような生物学的プロセスの基本であり、同じレパートリー遺伝子を使用して細胞機能を調節する生物の代替手段を提供する。
代替スプライシングに必要な機械は、構成スプライシングに使用されるのと同じであり、SSの使用は、代替スプライシングの発生のための主要な決定要因です。構成スプライシングは、強いスプライシング部位の使用に関連しており、これは通常、スプライセソーム認識のためのコンセンサスモチーフに類似している5。
代替エキソンは、典型的には、その シス−調節要素の一度構成エキソンよりも効率が低く認識され、これらのエキソンに隣接する5'SSおよび3'SSの配列は、スプライセソームに対する劣った結合能力を示す。mRNAはまた、エキソン(エキソニックスプライシングエンハンサー(ESE)およびエキソニックスプライシングサイレンサー(ESS))およびイントロン(イントロニックスプライシングエンハンサー(ISE)およびイントロニックスプライシングサイレンサー(ISS))に位置するエンハンサーまたはサイレンサーと名付けられた領域を含み、それぞれ5。これらの配列は、トランス調節要素、またはスプライシング因子(SF)によって認識される。SFは、主に、ESEsに結合するセリン/アルギニンリッチスプライシング因子(SRSF)とESSs配列5に結合する異種核リボヌクレオタンパク質(hnRNP)ファミリーの2つのファミリーのタンパク質によって表される。
代替スプライシングは、スプライシング因子6、7、8の相互作用パートナーおよび細胞局在化を修飾するトランス因子のリン酸化/脱リン酸化によって変調することができる。スプライシング因子の新しい調節因子を同定することは、スプライシングを調節するための新しいツールを提供することができ、その結果、いくつかの癌治療。
Anufrievaら 9は、mRNAマイクロアレイ遺伝子発現プロファイルにおいて、101細胞株および異なるストレス状態(白金系薬物、ガンマ照射、トポイソメラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤およびタキサン)におけるスプライセソーム成分のレベルにおける一貫した変化を観察した。スプライシングパターンと化学療法効果の関係は、化学療法耐性である肺癌細胞において既に実証されており、カスパーゼ-9変異体の変化率10を示す。化学療法パネルで治療されたHEK293細胞は、プロアポトーシス変異体の増加に伴うスプライシングの変化を示す。Gabriel et al.11 は、異なる細胞株におけるシスプラチン処理後のスプライシングの少なくとも700の事象の変化を観察し、スプライシング経路がシスプラチンに影響を受けていることを指摘した。スプライシングモジュレーターは既に抗腫瘍活性を実証しており、スプライシングが腫瘍の発達にとって重要であることを示し、主に化学療法応答12.したがって、化学療法薬のような細胞ストレッサー剤の後にスプライシングを調節する新しいタンパク質を特徴付けることは、治療の新しい戦略を発見するために非常に重要です。
相互作用研究からの代替スプライシング調節の手がかりは、特に新しいまたは特徴のないタンパク質の機能を特徴付けるために重要であり、ASにおけるタンパク質の実際の役割を検証するためのより一般的で簡単なアプローチを要求することができる。ミニ遺伝子は、スプライシング調節に影響を与えるタンパク質の一般的な役割の分析のための重要なツールです。それらは、代わりにスプライスおよび横たわるゲノム領域13を含む目的の遺伝子からのセグメントを含む。ミニジーンツールを使用すると、マイナーであり、したがって増幅反応に制限されないミニジーンの長さなどのいくつかの利点を持つin vivoのスプライシングの分析が可能になります。同じミニ遺伝子を異なる細胞株で評価することができます。すべての細胞成分は、主に翻訳後修飾(リン酸化および細胞区画の変化)の調節が存在し、13,14に対処することができる。さらに、代替スプライシングパターンの変化は、細胞ストレス後に観察され、かつ、ミニ遺伝子系を用いることで、異なる刺激によって変調される経路を同定することを可能にする。
スプライシングイベント13,14の異なる種類に特異的なミニジーンシステムが既にいくつか存在するが、予備的なアッセイとして、ミニジーンE1A15は、生体内での5'SS選択の研究のための非常に確立された代替スプライシングレポーターシステムである。1つの遺伝子のみから、E1A、5つのmRNAは、3つの異なる5′スプライス部位の選択に基づいて代替スプライシングによって生成され、1つの主要なまたは1つのマイナーな3′スプライス部位16、17、18の。E1A変異体の発現は、アデノウイルス感染の期間19、20に従って変化する。
我々は、両方のNek4アイソフォームがSRSF1およびhnRNPA1などのスプライシング因子と相互作用することを以前に示しており、アイソフォーム2はミニジーンE1A代替スプライシングを変化させるが、アイソフォーム1はその21では効果を有さない。アイソフォーム1は最も豊富なアイソフォームであり、化学療法抵抗とDNA損傷応答を変化させるため、ストレス状態でミニジーンE1A代替スプライシングを変えることができるかどうかを評価します。
Minigeneアッセイは、単純で低コストで迅速な方法であり、RNA抽出、cDNA合成、増幅およびアガロースゲル分析のみが必要であり、細胞代替スプライシングパターンに対する異なる治療法の影響まで、興味のあるタンパク質による代替スプライシングに対する効果が得られるため、評価に有用なツールとなり得る。

<table><tbody><tr><td>100 pb DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>15628-050</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェルプレート</td><td>Sarstedt</td><td>833920</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>シグマ</td><td>A9539-250G</td><td></td></tr><tr><td>シスプラチン</td><td>シグマ</td><td>P4394</td><td></td></tr><tr><td>DEPC 水</td><td></td><td>ThermoFisher AM9920</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>dNTP ミックス</td><td>ThermoFisher</td><td>10297-018</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 - FBS</td><td>ThermoFisher</td><td>12657029</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>Leica</td><td>DMIL LED FLUO</td><td></td></tr><tr><td>Gel imaging acquisition system - ChemiDoc Gel Imagin System</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP - pEGFPC3</td><td>Clontech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293 stable cells - HEK293 Flp-In</td><td></td><td></td><td>Flp-In&tradeから生成。T-REx&trade;293 - Invitrogen および ref 21</td></tr> に記載されている <tr><td>Hygromycin B</td><td>ThermoFisher</td><td>10687010</td><td>Flp-In 細胞のメンテナンスに使用</td></tr><tr><td>画像処理および解析ソフトウェア - FIJI ソフトウェア</td><td></td><td></td><td>ref. 32</td></tr><tr><td>脂質ベースのトランスフェクション試薬 - jetOPTIMUS Polyplus 試薬</td><td>Polyplus</td><td>117-07</td><td></td></tr><tr><td>Oligo DT</td><td>ThermoFisher</td><td>18418020</td><td></td></tr><tr><td>Paclitxel</td><td>Invitrogen</td><td>P3456</td><td></td></tr><tr><td>プレートリーダー/ UV 吸光度</td><td>Biotech</td><td></td><td>Epoch Biotek/ Take3 アダプター</td></tr><tr><td>pMTE1A プラスミド</td><td></td><td></td><td>Adrian Krainer 博士提供</td></tr><tr><td>pMTE1A F</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp;5フィート-ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3</td><td></td></tr><tr><td>pMTE1A R</td><td>Invitrogen</td><td>5' -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3'</td><td></td></tr><tr><td>冷蔵遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>F5810R</td><td></td></tr><tr><td>Reverse Transcriptase - M-MLV</td><td>ThermoFisher</td><td>28025013</td><td></td></tr><tr><td>Reverse transcriptase - Superscript IV</td><td>ThermoFisher</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>Ribunuclease inhibitor RNAse OUT</td><td>ThermoFisher</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>RNA extraction phenol-chloroform based reagent - Trizol</td><td>ThermoFisher</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>SybrSafe DNA ゲル染色</td><td>ThermoFisher</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Taq Platinum</td><td>Thermo</td><td>10966026</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyclin</td><td>Sigma</td><td>T3383</td><td>フラッグエンプティまたは Nek4- フラグ発現誘導に使用</td></tr><tr><td>Thermocycler Bio-Rad</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T4799</td><td></td></tr></tbody></table>

e1aミニジーンツールを使用したmrnaスプライシング変更の研究

Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes

mRNA処理には、5'キャッピング、ポリA付加、スプライシングなどの翻訳用mRNAを準備するための複数の同時ステップが必要です。構成的なスプライシングに加えて、代替mRNAスプライシングは、1つの遺伝子から多機能タンパク質の発現を可能にする。相互作用研究は一般的に新しいまたは未知のタンパク質に対する最初の分析であるため、餌タンパク質とスプライシング因子との関連は、mRNAスプライシングプロセスに参加できることを示すが、どのような文脈で、またはどの遺伝子が調節されているかを決定することは経験的プロセスである。この関数を評価する良い出発点は、古典的なミニジーンツールを使用することです。ここでは、異なる細胞ストレス刺激後の代替スプライシング変化を評価するためのアデノウイルスE1Aミニジーンの使用法を提示する。異なるストレス処理の後に、HEK293におけるE1Aミニジーンのスプライシングを安定的に過剰発現させるNek4タンパク質のスプライシングを評価した。このプロトコルは、E1Aミニジーントランスフェクション、細胞処理、RNA抽出およびcDNA合成、続いてPCRおよびゲル分析およびE1Aスプライス変異体の定量化を含む。特定の治療法と組み合わせたこのシンプルで確立された方法の使用は、細胞プロセスやmRNAスプライシングによって調節できる遺伝子に光を当てる信頼できる出発点です。

E1Aミニジーンを用いた5'スプライス部位アッセイを行い、化学療法博覧会後の細胞におけるスプライシングプロファイルの変化を評価した。パクリタキセルまたはシスプラチン処理後のHEK293安定細胞におけるAS調節におけるNek4-アイソフォーム1の役割を評価した。
アデノウイルスE1A領域は、異なるスプライスドナーの使用のために、1つのRNA前駆体からの3つの主要なmRNAの産生を担う。彼らは共通の5'と3'の用語を共有しますが、切除イントロンの大きさは異なります。アデノウイルスE1A mRNAは、その沈積係数、13S、12Sおよび9Sに従って命名される。アデノウイルス感染の初期段階(約7時間)の間に、ウイルスDNA複製のために感染細胞を調製するために重要なタンパク質(13S-723 aaおよび12S-586 aa)および、それらの他の後期(約18h)で、小タンパク質(9S-249 aa)が20に産生される。...

このプロトコルは、化学療法治療後の代替スプライシング調節において特徴のない機能を有するタンパク質の役割を評価するための迅速かつ有用なツールを提示する。

E1Aミニジーンツールを使用したmRNAスプライシング変更の研究

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides ...

このプロトコルの全体的な目標は、グローバル mRNA スプライシングの変更を評価するためにミニジーン E1A2 を使用するための詳細なガイダンスを提供することです。これは、特別なレジームや実験室条件の必要なしに代替スプライシング規制でターゲットタンパク質の機能を評価するための迅速で安価で簡単なツールです。まず、目的の遺伝子の安定した発現を有するHEK 293細胞を培養すること。0.25%トリプシンEDTAを使用して細胞を分割し、6ウェルプレートでウェルあたり300,000個の細胞をプレートし、5%の二酸化炭素で摂氏37度で24時間インキュベートします。24時間後、合流を確認し、70〜80%コンフルエントの場合にのみHEK 293安定細胞をトランスフェクトする。慎重にピペットで細胞培地を除去し、抗生物質なしで完全なDMEM培地の2ミリリットルを追加し、インキュベーターにプレートを戻します。トランスフェクションバッファーを使用してチューブを調製し、次いで pMTE1A DNA の 2 マイクログラムを追加し、2 マイクロリットルのトランスフェクション試薬を追加します。再び渦を、室温で10分間インキュベートする。インキュベーターからプレートを取り出し、慎重にトランスフェクション混合物をドロップワイズで追加します。トランスフェクションの6時間後、NEK4発現誘導のためのHEK 293安定細胞にテトラサイクリンを添加する。トランスフェクションの24時間後、蛍光顕微鏡を用いて細胞形態とトランスフェクション効率を検証します。ピペットを使用して細胞培養培地を除去し、次いで化学療法剤で細胞培養培地を添加する。さらに24時間細胞をインキュベートする。RNAを収集するには、細胞培養培地を廃棄し、0.5~1ミリリットルのRNA抽出試薬を直接ウェルに添加する。ウェルが非常にコンフルエントである場合は、RNAの品質を向上させるために1ミリリットルのRNA抽出試薬を使用してください。ピペットで細胞を均質化し、1.5ミリリットルの遠心分離管に移します。すぐにRNA抽出に進むか、またはマイナス80°Cでサンプルを保存します。ヒュームフードでサンプルを解凍し、室温で5分間インキュベートします。0.1~0.2ミリリットルのクロロホルムを加え、激しく攪拌し、室温で3分間インキュベートします。遠心分離機は12,000倍Gと摂氏4度で15分間、その後、上の水相を収集し、新しい1.5ミリリットル遠心管に移します。総容積の約60%を収集するが、DNAまたは有機相を収集しないでください。0.25〜0.5ミリリットルのイソプロパノールを加え、反転によってサンプルを4回攪拌します。室温で10分間インキュベートし、その後12,000倍Gで摂氏4度で10分間遠心分離機を行い、上清を捨てます。RNAペレットをエタノールで2回洗浄し、遠心分離機を7、500倍Gで5分間洗浄し、エタノールを捨てます。ペーパータオルでチューブを反転させて余分なエタノールを取り除き、チューブをヒュームフードの内側に開けてペレットを5~10分間部分的に乾燥させます。RNAペレットを15マイクロリットルのDEPC処理水で再懸濁します。230、260、280ナノメートルで吸光度を測定することで、全RNAを定量化し、RNAの品質を検証します。RNAの全品質を確認するには、2.5%次亜塩素酸ナトリウム溶液の1.2%を30分間前処理した1%のアガロースゲルを実行します。RNAの1~2マイクログラムを用いてcDNA合成を行います。RNA、オリゴd-Tの1マイクロリットル、DNTPの1マイクロリットル、ヌクレアーゼフリー水を12マイクロリットルに組み合わせます。サーモサイクラーで反応を摂氏65度で5分間インキュベートします。サーモサイクラーからサンプルを取り出し、逆転写酵素バッファーの4マイクロリットル、DTTの2マイクロリットル、およびリボヌクレアーゼ阻害剤の1マイクロリットルを加える。摂氏37度で2分間インキュベートします。熱安定性の逆転写酵素を1マイクロリットル加え、摂氏37度で50分間インキュベートします。70°Cで酵素を15分間不活性化します。テキスト原稿に記載されているとおりPCRを実行し、核酸染色を含む3%アガロースゲルにPCR産物20~25マイクロリットルをロードし、約1時間100ボルトで実行します。任意のバンド飽和を避けてゲルを撮影し、画像処理ソフトウェアを使用してバンドを定量化します。631、493、および 156 塩基対のバンドは、それぞれ 13S、12S、および 9S アイソフォームに対応します。ソフトウェアの[ファイル]メニューから、イメージファイルを開き、グレースケールに変換します。明るさとコントラストを調整し、必要に応じて外れ値のノイズを除去します。長方形選択ツールを使用して最初の車線の周囲に長方形を描き、[解析]、[ゲル]、および [最初の車線を選択]コマンドを使用するか、キーボード ショートカットを使用して選択します。マウスを使用して、最初の車線の長方形の中央をクリックして押さえた後、次のレーンにドラッグします。[解析]、[ゲル]、および [次のレーン] を選択します。残りのすべてのレーンに対してこの手順を繰り返します。すべての車線がハイライト表示され、番号が付いた後、[解析]、[ゲル]、[プロット レーン] に移動して、各車線のプロファイル プロットを描画します。直線選択ツールを使用して、各帯に対応する各ピークの底部に線を引き、バックグラウンドノイズを省きます。すべての車線からすべてのピークが閉じられた後、杖ツールを選択し、各ピーク内をクリックします。ハイライトされた各ピークの結果ウィンドウに測定値がポップアップ表示されます。631、493、および 156 の基本ペア・バンドに対応する 13S、12S、および 9S のピークのみを考慮してください。スプレッドシート エディタの強度データをコピーし、各サンプルの 3 つのバンドすべてから強度を合計し、合計に対する各アイソフォームの割合を計算します。各アイソフォームのパーセンテージ、または未処理サンプルに対する割合の差をプロットします。E1Aからミニジーンを含むプラスミドを用いて、生成した各アイソフォームからのmRNAの割合を評価することによって代替スプライシングに対する効果を観察した。E1Aアイソフォーム変異体の基底式発現は、E1A発現の細胞株および時間に依存した。HEK293安定細胞株、またはHEK 293リコンビナーゼ含有部位は、HeLa細胞と比較して13Sの高い発現を示したが、48時間後に同様のレベルの13Sおよび12Sアイソフォームを示した。シスプラチンに曝露された細胞は、12S発現を支持する5つのプライムS-Sスプライシング選択におけるシフトを示した。この効果は、フラグ空ベクトルを安定的に発現させるHEK 293で観察された、ならびにNek4のアイソフォーム1と同様である。パクリタキセル処理後の代替スプライシングの変化は非常に慎重であったが、変化の方向はFlagおよびNek4発現細胞では反対であった。このプロトコルを実行する場合、主にHEK 293細胞を使用する場合、内因性E1A発現との誤解を避けるために、未感染および非逆転写酵素コントロールを使用することが重要です。陽性の結果を得た後、化学療法応答に関連する特定の遺伝子の代替スプライシングを評価することができる。何らかの効果が観察されると、この単純なプロトコルは、タンパク質が化学療法応答における代替スプライシングを調節する役割を果たす、より一貫した経路のためにこれらの研究を指示することができる。

using-the-e1a-minigene-tool-to-study-mrna-splicing-changes

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

選択的スプライシング制御は、さまざまな生理学的および病理学的プロセスにおける必須の細胞プログラムである上皮間葉転換(EMT)に寄与することが示されています。ここでは、EMT中の選択的スプライシングの検出に誘導性EMTモデルを利用する方法について説明します。...

上皮間葉転移の間の選択的スプライシングの検出

タンデムスプライシングイベントは、12ヌクレオチド未満の場所で発生します。このようなスプライスバリアントの比率を定量化することは、絶対定量PCRアプローチを使用して実現可能です。この原稿では、2つのスプライシングイベントがSerine-701の包含/排除およびα/β...

STAT3スプライスバリアント転写産物を定量化するために絶対的および相対的定量PCRのデータをマージ

ここでは、固形腫瘍および血液悪性腫瘍における薬剤耐性に異常なスプライシングの影響を調査することを目的とプロトコルについて説明します。この目標のために、我々は、RNA-seqのを介してin vitroモデルにおける親及び抵抗性のトランスクリプトームプロフィールを分析し、候補遺伝子を検証するための定量RT-PCRベースの方法を確立しました。...

に薬剤耐性に関連する新規スプライス変異体を検出するために、RNA配列決定を使用して、<em&gt;インビトロ</em&gt;がんモデル

その場で交配 (っぽい) プロトコル マウス脳セクションの代替の Pre-mrna スプライシング パターンを検出する短いアンチセンス...

代替の Pre-mrna スプライシング RNA In Situハイブリダイゼーション法によるマウス脳のセクションでの定量的解析

円形RNAを生成するレポーター遺伝子のクローン化と解析を行います。これらのレポーター遺伝子は、線形スプライシングを解析する構築物よりも大きく、Alu要素を含んでいます。円形RNAを調べるため、細胞にトランスフェクトされ、リニアRNAを除去した後にRT-PCRを用いてRNAを解析します。...

円形RNA解析に対する小遺伝子を含むAlu要素の使用

この記事では、(a)核抽出物からのU1 snRNPの枯渇に関する実験的手順について説明し、それに伴うスプライシング活性の喪失について説明します。(b)ガレクチン-3-U1...

ガレクチン-3 - ビーズ上のU1 snRNP複合体によるスプライシング活性の相補

選択的スプライシング(AS)および選択的ポリアデニル化(APA)は、転写産物アイソフォームとその産物の多様性を拡大します。ここでは、バルクRNA-seqを分析するためのバイオインフォマティクスプロトコルと、実験条件によって変化するASおよびAPAを検出および視覚化するための3'エンドシーケンシングアッセイについて説明します。...

RNA-seqデータにおける選択的スプライシングおよびポリアデニル化の同定(英語)

このプロトコルは、スプライシングに対する5'-スプライス部位変異の影響をモニターするためのミニジーンレポーターアッセイを記述し、変異誘発スプライシング阻害のレスキューのためのサプレッサーU1 snRNAを開発する。レポーターおよびサプレッサーU1...

スプライシング効率を監視するためのレポーターベースの細胞アッセイ

銅成長アッセイであるACT1-CUP1アッセイは、前駆体メッセンジャーRNA(pre-mRNA)スプライシングと、変異体スプライシング因子がスプライソソーム機能に与える影響を迅速に読み取ることができます。この研究はプロトコルを提供し、関心のあるスプライシングの問題に対処するために可能なカスタマイズを強調しています。...

ACT1-CUP1アッセイは、出芽酵母におけるスプライソソーム変異体の基質特異的感受性を決定

ゲノム規模でのRNA編集イベントの迅速な検出と信頼性の高い定量化は依然として困難であり、現在は直接RNAシーケンシング法に依存しています。ここで説明するプロトコルは、RNA編集を検出するための簡単で迅速でポータブルな方法として、微小温度勾配ゲル電気泳動(μTGGE)を使用しています。...

RNA編集の迅速な検出のためのノンシーケンシングアプローチ

学ぶE1Aミニジーンを用いたmRNAスプライシング変化評価法。HEK293細胞を使用し、化学療法後の選択的スプライシング制御におけるタンパク質機能を迅速かつ簡便に解析する実験プロトコルです。

E1Aミニジーンツールを使用したmRNAスプライシング変更の研究

さらに動画を探す