E1Aミニジーンツールを使用したmRNAスプライシング変更の研究
April 22nd, 2021
このプロトコルは、化学療法治療後の代替スプライシング調節において特徴のない機能を有するタンパク質の役割を評価するための迅速かつ有用なツールを提示する。
このプロトコルの全体的な目標は、グローバル mRNA スプライシングの変更を評価するためにミニジーン E1A2 を使用するための詳細なガイダンスを提供することです。これは、特別なレジームや実験室条件の必要なしに代替スプライシング規制でターゲットタンパク質の機能を評価するための迅速で安価で簡単なツールです。まず、目的の遺伝子の安定した発現を有するHEK 293細胞を培養すること。
0.25%トリプシンEDTAを使用して細胞を分割し、6ウェルプレートでウェルあたり300,000個の細胞をプレートし、5%の二酸化炭素で摂氏37度で24時間インキュベートします。24時間後、合流を確認し、70〜80%コンフルエントの場合にのみHEK 293安定細胞をトランスフェクトする。慎重にピペットで細胞培地を除去し、抗生物質なしで完全なDMEM培地の2ミリリットルを追加し、インキュベーターにプレートを戻します。
トランスフェクションバッファーを使用してチューブを調製し、次いで pMTE1A DNA の 2 マイクログラムを追加し、2 マイクロリットルのトランスフェクション試薬を追加します。再び渦を、室温で10分間インキュベートする。インキュベーターからプレートを取り出し、慎重にトランスフェクション混合物をドロップワイズで追加します。
トランスフェクションの6時間後、NEK4発現誘導のためのHEK 293安定細胞にテトラサイクリンを添加する。トランスフェクションの24時間後、蛍光顕微鏡を用いて細胞形態とトランスフェクション効率を検証します。ピペットを使用して細胞培養培地を除去し、次いで化学療法剤で細胞培養培地を添加する。
さらに24時間細胞をインキュベートする。RNAを収集するには、細胞培養培地を廃棄し、0.5~1ミリリットルのRNA抽出試薬を直接ウェルに添加する。ウェルが非常にコンフルエントである場合は、RNAの品質を向上させるために1ミリリットルのRNA抽出試薬を使用してください。
ピペットで細胞を均質化し、1.5ミリリットルの遠心分離管に移します。すぐにRNA抽出に進むか、またはマイナス80°Cでサンプルを保存します。ヒュームフードでサンプルを解凍し、室温で5分間インキュベートします。
0.1~0.2ミリリットルのクロロホルムを加え、激しく攪拌し、室温で3分間インキュベートします。遠心分離機は12,000倍Gと摂氏4度で15分間、その後、上の水相を収集し、新しい1.5ミリリットル遠心管に移します。総容積の約60%を収集するが、DNAまたは有機相を収集しないでください。
0.25〜0.5ミリリットルのイソプロパノールを加え、反転によってサンプルを4回攪拌します。室温で10分間インキュベートし、その後12,000倍Gで摂氏4度で10分間遠心分離機を行い、上清を捨てます。RNAペレットをエタノールで2回洗浄し、遠心分離機を7、500倍Gで5分間洗浄し、エタノールを捨てます。
ペーパータオルでチューブを反転させて余分なエタノールを取り除き、チューブをヒュームフードの内側に開けてペレットを5~10分間部分的に乾燥させます。RNAペレットを15マイクロリットルのDEPC処理水で再懸濁します。230、260、280ナノメートルで吸光度を測定することで、全RNAを定量化し、RNAの品質を検証します。
RNAの全品質を確認するには、2.5%次亜塩素酸ナトリウム溶液の1.2%を30分間前処理した1%のアガロースゲルを実行します。RNAの1~2マイクログラムを用いてcDNA合成を行います。RNA、オリゴd-Tの1マイクロリットル、DNTPの1マイクロリットル、ヌクレアーゼフリー水を12マイクロリットルに組み合わせます。
サーモサイクラーで反応を摂氏65度で5分間インキュベートします。サーモサイクラーからサンプルを取り出し、逆転写酵素バッファーの4マイクロリットル、DTTの2マイクロリットル、およびリボヌクレアーゼ阻害剤の1マイクロリットルを加える。摂氏37度で2分間インキュベートします。
熱安定性の逆転写酵素を1マイクロリットル加え、摂氏37度で50分間インキュベートします。70°Cで酵素を15分間不活性化します。テキスト原稿に記載されているとおりPCRを実行し、核酸染色を含む3%アガロースゲルにPCR産物20~25マイクロリットルをロードし、約1時間100ボルトで実行します。
任意のバンド飽和を避けてゲルを撮影し、画像処理ソフトウェアを使用してバンドを定量化します。631、493、および 156 塩基対のバンドは、それぞれ 13S、12S、および 9S アイソフォームに対応します。ソフトウェアの[ファイル]メニューから、イメージファイルを開き、グレースケールに変換します。
明るさとコントラストを調整し、必要に応じて外れ値のノイズを除去します。長方形選択ツールを使用して最初の車線の周囲に長方形を描き、[解析]、[ゲル]、および [最初の車線を選択]コマンドを使用するか、キーボード ショートカットを使用して選択します。マウスを使用して、最初の車線の長方形の中央をクリックして押さえた後、次のレーンにドラッグします。
[解析]、[ゲル]、および [次のレーン] を選択します。残りのすべてのレーンに対してこの手順を繰り返します。すべての車線がハイライト表示され、番号が付いた後、[解析]、[ゲル]、[プロット レーン] に移動して、各車線のプロファイル プロットを描画します。
直線選択ツールを使用して、各帯に対応する各ピークの底部に線を引き、バックグラウンドノイズを省きます。すべての車線からすべてのピークが閉じられた後、杖ツールを選択し、各ピーク内をクリックします。ハイライトされた各ピークの結果ウィンドウに測定値がポップアップ表示されます。
631、493、および 156 の基本ペア・バンドに対応する 13S、12S、および 9S のピークのみを考慮してください。スプレッドシート エディタの強度データをコピーし、各サンプルの 3 つのバンドすべてから強度を合計し、合計に対する各アイソフォームの割合を計算します。各アイソフォームのパーセンテージ、または未処理サンプルに対する割合の差をプロットします。
E1Aからミニジーンを含むプラスミドを用いて、生成した各アイソフォームからのmRNAの割合を評価することによって代替スプライシングに対する効果を観察した。E1Aアイソフォーム変異体の基底式発現は、E1A発現の細胞株および時間に依存した。HEK293安定細胞株、またはHEK 293リコンビナーゼ含有部位は、HeLa細胞と比較して13Sの高い発現を示したが、48時間後に同様のレベルの13Sおよび12Sアイソフォームを示した。
シスプラチンに曝露された細胞は、12S発現を支持する5つのプライムS-Sスプライシング選択におけるシフトを示した。この効果は、フラグ空ベクトルを安定的に発現させるHEK 293で観察された、ならびにNek4のアイソフォーム1と同様である。パクリタキセル処理後の代替スプライシングの変化は非常に慎重であったが、変化の方向はFlagおよびNek4発現細胞では反対であった。
このプロトコルを実行する場合、主にHEK 293細胞を使用する場合、内因性E1A発現との誤解を避けるために、未感染および非逆転写酵素コントロールを使用することが重要です。陽性の結果を得た後、化学療法応答に関連する特定の遺伝子の代替スプライシングを評価することができる。何らかの効果が観察されると、この単純なプロトコルは、タンパク質が化学療法応答における代替スプライシングを調節する役割を果たす、より一貫した経路のためにこれらの研究を指示することができる。
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概要
このプロトコルは、化学療法後のオルタナティブスプライシング制御における未解明機能のタンパク質の役割を評価するための迅速で有用なツールを提示します。ミニ遺伝子E1A2を使用してグローバルmRNAスプライシング変化を評価するための詳細なガイダンスを提供します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 遺伝学
背景
- オルタナティブスプライシングの理解は遺伝子制御を解読する上で重要です。
- 未解明機能のタンパク質はスプライシングメカニズムに影響を与える可能性があります。
- 化学療法はスプライシングパターンを変化させる可能性があります。
- ミニ遺伝子E1A2はこれらの変化を研究するためのモデルとして機能します。
研究の目的
- オルタナティブスプライシング制御における標的タンパク質の機能を評価すること。
- 研究者にコスト効率が高く簡単な方法を提供すること。
- 化学療法後のスプライシング変化の理解を促進すること。
使用された方法
- 対象遺伝子の安定発現を持つHEK 293細胞の培養。
- 0.25%のトリプシンEDTAを用いた細胞分裂。
- 6ウェルプレートに細胞を播種し、特定の条件下で培養。
- 完全なDMEM培地を使用して、70から80%の接合度で細胞をトランスフェクトすること。
主な結果
- このプロトコルはスプライシング変化の効率的な評価を可能にします。
- スプライシング制御における標的タンパク質の役割を実証します。
- 複雑な実験室セットアップなしで結果を得ることができます。
- スプライシングメカニズムに関するさらなる研究の基礎を提供します。
結論
- このプロトコルはオルタナティブスプライシングを研究する研究者にとって価値あるツールです。
- スプライシング制御におけるタンパク質機能の評価を簡素化します。
- 将来の研究はこれらの発見に基づいて治療的意味を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Alternative mRNA splicing is a critical regulatory mechanism influencing protein diversity and cellular response to stress, with direct implications for target validation and mechanistic de-risking in drug discovery. The E1A minigene assay provides a rapid, quantitative platform to interrogate how candidate proteins or treatments modulate splicing outcomes, supporting early-stage portfolio triage and pathway prioritization. This tool enables biopharma teams to empirically link protein function to splicing regulation under defined cellular conditions, informing predictive confidence in target selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional assessment of novel or uncharacterized proteins in alternative splicing regulation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying splicing changes in response to genetic or pharmacological perturbation.
- Facilitates empirical validation of interactome predictions involving splicing factors.
- Provides a standardized readout for pathway clarification and target confidence.
Screening & Assay Development
- Delivers a reproducible, quantitative assay for evaluating splicing modulation across conditions or compounds.
- Supports assay standardization and cross-lab reproducibility through defined isoform quantification.
- Enables rapid screening of candidate regulators or stressors for splicing impact.
- Generates quantitative outputs suitable for downstream comparative analytics.
Translational & Preclinical Research
- Aligns splicing modulation with cellular stress responses relevant to disease models.
- Supports continuity from discovery-stage mechanistic findings to preclinical pathway validation.
- Informs risk-adjusted advancement of targets implicated in splicing-driven phenotypes.
- Provides a foundation for subsequent evaluation of disease-relevant gene targets.
Pipeline & Workflow Integration
The E1A minigene assay integrates into the early discovery-to-lead identification continuum, bridging interactome analysis and functional validation of splicing regulators.
- Discovery Biology: Empowers hypothesis testing on protein function in splicing and pathway mapping under defined stress conditions.
- Screening: Offers a scalable, quantitative platform for evaluating splicing changes across multiple experimental arms.
- Analytics: Provides isoform-specific quantification and statistical comparison of splicing outcomes.
- Translational Research: Connects mechanistic splicing modulation to cellular phenotypes relevant for preclinical modeling.
- Enterprise Reuse: Functions as a broadly applicable assay for diverse protein or compound screening initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in splicing regulation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and cost-effective splicing analysis adaptable to multiple workflows.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient prioritization of splicing-related targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement and cross-program comparability for splicing-modulating interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, transfection, and RNA analysis.
- Needs access to standard molecular biology instrumentation and image quantification software.
- Demands rigorous control inclusion to distinguish exogenous from endogenous splicing events.
- Adaptable to different cell lines and stress conditions with protocol optimization.
- Interpretation limited to splicing events detectable by the E1A minigene system.
