Name: ケラチノサイト幹細胞の可塑性をモデル化する高スループット表皮球面培養システムの確立 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 学ぶ 3D浮遊培養による表皮球体の作製と維持法。Dispase処理とスフェロイドリプレーティングアッセイを用いて、ケラチノサイト幹細胞の可塑性を高スループットで解析する革新的な細胞培養システムです。

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</ol>

著者は開示する財務上の関係を持っていません。

3Dスフェロイド培養システムの使用は、細胞幹細胞性を評価する上で幅広い有用性を有している。これらのシステムは、組織幹細胞13の濃縮を増強することが実証されているが、ヒト表皮幹細胞の研究に有用性は限られたものであった。ここでは、3D培養技術を用いてヒトケラチノサイト幹細胞を濃縮する戦略について述べています。このシステムでは、NHKcは、KSFM-scmを含むアガロースベッドの上に懸濁されたいくつかのケラチノサイトサブタイプで構成される自己集合型多細胞スフェロイド懸濁液として栽培される。このプロトコルのセットアップは、寒天が室温で急速に重合するので時間に敏感です。予熱血清ピペット、マイクロピペットチップ、寒天/細胞混合チューブ、および42°Cの培地は、早期重合を劇的に低減することができます。我々は、寒天/培地ミックスを井戸に添加した直後に96ウェルプレートを4°Cに置くことで、重合を大幅にスピードアップし、その後の細胞の播種に対して寒天クッションが十分に固くなるのを観察した。重合プロセス中は常にプレート)レベルを維持することが重要であり、寒天/培地ミックスの重合不良は細胞の播種または軟寒天の内...

哺乳類の階層化上皮は、すべての生活システムにおいて最も複雑な上皮アーキテクチャであり、ほとんどの場合、損傷および損傷を受ける。保護組織として、階層化上皮は複雑で効果的な組織損傷応答を生成するように進化した。損傷を受けた細胞は、系統可塑性プログラムを有効にする必要があり、これを使用して損傷した部位に移行し、修復1、2、3を実行できるようにする必要があります。この多面的な応答は、よく理解されていないいくつかの連続したステップで発生します。
上皮再生の複雑なプロセスを研究する上の主要な障害は、細胞再生の定義された段階で動的な細胞活動をキャプチャすることができる高スループットモデルシステムの枯渇にあります。in vivoマウスモデルは創傷治癒に関する関連する洞察を提供し、人間の再生プロセスを最も密接に再現しますが、その開発には手間のかかる労力と大幅なコストが必要であり、スループット能力が制限されます。したがって、高スループットスケールでヒト上皮組織再生の機能調査を可能にするシステムを確立する上で重要なニーズが存在する。
近年、スケーラビリティの課題に対応するために、いくつかの試みが行われています。これは、インビボ再生コンテキストを密接に模倣する革新的なin vitroおよびex vivo細胞ベースのモデルの大きな拡大を通じて見られます。これには、オルガンオンチップ4、スフェロイド5、オルガノイド6、オルガノイド文化7の進歩が含まれます。これらの3D細胞ベースのシステムは、それぞれ独自の利点を提供し、独特の実験的限界を提示します。現在までに、スフェロイド培養は、最も費用対効果が高く、広く使用されている3D細胞培養モデルです。また、いくつかの報告では、スフェロイド培養物を皮膚幹細胞の特性を研究するために使用できることが示されているが、これらの研究は主に動物組織8、9、または皮膚線維芽細胞10で行われ、ヒト表皮スフェロイド培養物の再生特性を徹底的に特徴付ける報告はほとんどない。本プロトコルでは、通常ヒトケラチノサイト(NHKc)由来の表皮スフェロイド培養物の機能開発、培養、維持について詳述する。我々は、このシステムの有用性を同様に、表皮再生およびケラチノサイト幹細胞可塑性の逐次相を試験的にモデル化する。

<table><tbody><tr><td>Affymetrixプラットフォーム</td><td>Affymetrix</td><td></td><td>マイクロアレイ実験用</td></tr><tr><td>Affymetrix's HuGene-2_0-st ライブラリファイル</td><td>Affymetrix</td><td></td><td>Process</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td>マイクロアレイ実験用</td></tr><tr><td>All Prep DNA/RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td>RNA単離に使用</td></tr><tr><td>分析コンソール ソフトウェアバージョン3.0.0.466</td><td></td><td></td> 一<td>方向の被験者間分散分析を使用して、細胞タイプ特異的な転写応答を解析します</td></tr><tr><td>BD FACSAria II フローサイトメーター</td><td>ベックマン</td><td></td><td>フローサイトメトリー用</td></tr><tr><td>コンソール ソフトウェア version 3.0.0.466/Expression console Software</td><td>Affymetrix/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>データ品質の確認用</td></tr><tr><td>サイトケラチン 14</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53253</td><td>1:200 希釈</td></tr><tr><td>ディスパーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4818</td><td>細胞培地用</td></tr><tr><td>FITC標識抗インテグリン&α;6</td><td>Abcam</td><td>ab30496</td><td>FACS解析用</td></tr><tr><td>GeneChip Command Console 4.0 software</td><td>Affymetrix/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>データ品質の確認用</td></tr><tr><td>GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific)</td> <td>Affymetrix/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>ハイブリダイズアレイの洗浄と染色用</td></tr><tr><td>GeneChip HuGene 2.0 ST アレイ</td><td>Affymetrix/Thermo FisherScientific</td><td></td><td>全RNAのハイブリダイゼーションと増幅に</td></tr><tr><td>GeneChip Hybridization Oven 640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>全RNAのハイブリダイゼーションと増幅に |標識サンプルの増幅</td></tr>:<tr><td>GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit(Affymetrix/Thermo Fisher Scientific)。</td><td>Affymetrix/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>ハイブリダイズアレイの洗浄および染色用</td></tr><tr><td>GeneChip Scanner 3000 7G system</td><td>Affymetrix/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>ハイブリダイズアレイのスキャン</td></tr><tr><td>GeneChip WT PLUS 試薬キット</td><td>Affymetrix/Thermo Fisher Scientific</td><td></td> ビ<td>オチン化全RNAの増幅用</td></tr><tr><td>ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子 (hFGF basic/FGF2)</td><td>Cellシグナル伝達技術</td><td>8910</td><td>細胞培地用</td></tr><tr><td>ヒト上皮成長因子 (hEGF)</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>8916</td><td>細胞培地用</td></tr><tr><td>ヒトインスリン</td><td>ミリポア Sigma</td><td>9011-M</td><td>細胞培地用</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad)</td><td>バイオ・ラッド</td><td></td><td>1708880 RT-qPCR に使用</td></tr><tr><td>iScript cDNA 合成キット</td><td>Bio-Rad</td><td>1708890</td><td>に使用RT-qPCR</td></tr><tr><td>KSFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>の17005041</td><td>1% ペニシリン/ストレプトマイシン、20 ng/ml EGF、10 ng/ml 塩基性線維芽細胞成長因子、0.4% ウシ血清アルブミン (BSA)、および 4 &micro;g/ml インスリン</td></tr><tr><td>KSFM-scm</td><td>サーモフィッシャー サイエンティ</td>フィック <td>17005042</td><td>1% ペニシリン/ストレプトマイシン、20 ng/ml EGF、10 ng/ml 塩基性線維芽細胞成長因子、0.4% ウシ血清アルブミン (BSA)、および 4 &micro;g/ml インスリン</td></tr><tr><td>MCDB 153-LB 基礎培地</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7403</td><td>MCDB 153-LB 基礎培地 HEPES バッファー付き</td></tr><tr><td>NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS</td><td>Stellar Scientific</td><td>NST230111</td><td>免疫染色用</td></tr><tr><td>P63</td><td>Thermo Scientific</td><td>703809</td><td>1:200 希釈</td></tr><tr><td>PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; カタログ番号 )</td><td>BD Pharmingen</td><td>555997</td><td>FACS分析用</td></tr><tr><td>pMSCV-IRES-EGFP プラスミドベクター</td><td>Addgene</td><td>20672</td><td>トランスフェクション用</td></tr><tr><td>Promega TransFastキット</td><td>Promega</td><td>E2431</td><td>トランスフェクション用</td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy Plus マイクロキット</td><td>Qiagen</td><td></td><td>マイクロアレイ実験用</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade;滅菌済みシングルユース真空フィルターユニット</td><td>Thermo Scientific</td><td>09-740-63D</td><td>細胞培地用</td></tr><tr><td>Zeiss Axionvert 135 蛍光顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Axiovision Rel. 4.5 ソフトウェアと併用</td></tr></tbody></table>

ケラチノサイト幹細胞の可塑性をモデル化する高スループット表皮球面培養システムの確立

Establishing a High Throughput Epidermal Spheroid Culture System to Model Keratinocyte Stem Cell Plasticity

上皮調節不全は、慢性創傷、炎症、およびすべてのヒト癌の80%以上を含む様々なヒトの状態および病気のためのノードである。ライニング組織として、皮膚上皮はしばしば損傷を受け、損傷した組織を修復するために必要な細胞可塑性を獲得することによって進化的に適応している。長年にわたり、in vitroおよびex vivo細胞ベースのモデルを用いて上皮可塑性を研究するためにいくつかの努力がなされてきた。しかし、これらの取り組みは、上皮細胞可塑性の様々な段階を再現する能力が限られている。ここでは、原発性新生児ヒトケラチノサイトから3D表皮スフェロイドおよび表皮スフェロイド由来細胞を生成するためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは、ケラチノサイト生成可塑性の異なる段階を機能的にモデル化する表皮スフェロイド培養の能力を概説し、表皮スフェロイド再めっきが、integrinα6hi/EGFRlo ケラチノサイト亜集団の不均種正常ヒトケラチノサイト(NHKc)培養を増強できることを示している。我々の報告書は、皮膚角化細胞の可塑性および表皮再生の研究のための高スループットシステムの開発および維持について述べている。

皮膚表皮球アッセイの間、NHKc培養物は96ウェルプレートのアガロースコーティングされたウェルに播種される(図1A)。球状形成細胞は48時間以内に自己凝集するべきである。自律回転楕円体形成は、標準の反転位相コントラスト顕微鏡を用いて、早くも24時間評価することができる。表皮組織形成および再めっきアッセイは、表皮組織再生の様々な相をモデル化する(図1B)。図2は、3D培養における表皮スフェロイド形成能についてアッセイした各種NHKc株の高解像度画像を示す。これは自発的な回転楕円体形成の特徴であるため、細胞の密な球体凝集を調べることが重要です。我々は、適切な自発的な凝集を確実にするために2 x 104以上の細胞を使用する必要があることがわかった。株2Aに見られるような非球形細胞凝集は、十分な表皮形成とは考えられない。2D単層培養で非スフェロイド形成細胞懸濁液をめっきすると、生じるNH...

ここでは、3D懸濁液培養における表皮スフェロイドの系統的培養のためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは、様々な上皮組織タイプで使用し、いくつかのヒト疾患および状態のモデリングのための幅広い用途を有する。

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human ...

このプロトコルは、表皮球培養の培養と維持のための新しい方法と、スフェロイド再めっきアッセイを用いてそれらを綿密に調査する戦略を提示する。まず、テキスト原稿に記載されている洗剤を準備します。ラミナーフローフードで、新生児包皮を5ミリリットルの円錐状チューブで5ミリリットルの洗浄媒体で2回洗浄し、洗浄した包皮を滅菌ペトリ皿に移します。メスと鉗子を使用して、脂肪組織を掻き取り、真皮層から緩い結合組織を削り取り、包皮を洗浄媒体で再洗浄する。包皮表皮側を、洗浄媒体で希釈した2ミリリットルのディスパス酵素を含む6ウェルプレートに上に置きます。プレートをインキュベーターに4時間移します。インキュベーション後、包皮をペトリ皿に移し、細かい先端鉗子を使用して表皮を真皮層から分離する。0.25%トリプシン-EDTAの2ミリリットルを含む15ミリリットルの円錐状のチューブに表皮を入れる。5ミリリットルの血清ピペットを使用して浮遊表皮を粉砕し、5分ごとに5秒間周期的な渦を定めて摂氏37度で15分間インキュベートします。インキュベーション後、2ミリリットルの大豆トリプシン阻害剤を加え、ピペット処理してトリプシンを中和し、細胞懸濁液を遠心分離して混合する。完全なKSFM-SCM培地の12ミリリットルにペレットを再懸濁し、セルを10センチメートル皿にプレートし、摂氏37度と二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。翌日、吸引ピペットを使用して培地を取り出し、完全なKSFM-SCMの12ミリリットルに交換してください。4日目と7日目にこれを繰り返します。100ミリリットルのガラス瓶に50ミリリットルのPBSに2.5グラムのアガロースを加えて5%アガロース混合物を調製する。ボトルを液体サイクルにオートクレーブし、室温まで冷却させます。プレートを準備するには、200ミリリットルの脱イオン水を充填した1リットルのビーカーにアガロース溶液を含む冷却ガラスを入れます。研究用マイクロ波でアガロース混合物を最大2分間溶かし、ボトルを左右に軽く傾けて60秒ごとにアガロースを混合します。溶かした5%アガロースの3ミリリットルを摂氏42度で12ミリリットルのプリウォームKSFM-SCMに加え、1%アガロースの最終濃度を得る。マルチチャンネルピペッタを使用して、96ウェルプレートの各ウェルに1%寒天ミックスの200マイクロリットルを追加します。その後、4時間摂氏25度で無菌環境にプレートを残します。パスススフェロイド形成正常ヒト角化細胞は、PBSの2ミリリットルで媒体および洗浄細胞を吸引する。PBSを吸引し、洗浄した細胞に0.25%トリプシン-EDTAの2ミリリットルを加える。その後、摂氏37度で5分間インキュベートします。インキュベーション後、2ミリリットルの大豆トリプシン阻害剤をプレートに加え、プレートから15ミリリットルのチューブに細胞を洗浄します。250回Gで5分間遠心分離機。PBSの1ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁し、トリパンブルー染色を使用して細胞を定量化する。アリコート20,000正常ヒトケラチノサイトは100マイクロリットルのKSFM-SCMで、前に調製した96ウェルプレートの各ウェルに細胞を播種する。その後、プレートを一晩インキュベートします。逆相対照顕微鏡を使用して、シードされたウェルを表皮球形成のために分析します。3D表皮球形成から24~48時間後、摂氏37度で4ミリリットルのプリウォームKSFM-SCMを6センチメートルの皿に加える。広いボア1ミリリットルピペットチップを使用して、プレートに単一のスフェロイドを転送し、一晩プレートをインキュベートします。反転相コントラスト顕微鏡を使用して、細胞を結合または伝播するためのシードされたスフェロイドを分析します。培地を取り出し、新鮮なKSFM-SCM培地を2ミリリットルずつプレートに添加することで、96時間ごとに細胞を供給します。従来に示したように、70〜80%コンフルエントスフェロイド由来正常ヒトケラチノサイトおよび2D単層培養物を通過する。次に、Trypan Blueと自動セルカウンターを使用して細胞の生存率を定量化します。アリコート100マイクロリットルは、100、000〜400万個の正常なヒトケラチノサイトを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに含む。薄層フード内の明るいライトをオフにして、暗い環境で氷の上にチューブを置きます。FITCコンジュゲート抗インテグリンα6と2マイクロリットルのPE結合抗EGFRをチューブに2マイクロリットル加えて、1~50希釈を達成します。未染色制御として機能する抗体を添加しないチューブを準備します。暗闇の中で氷の上のチューブを30分間インキュベートします。適切なレーザーでフローサイトメトリー解析を行います。負と正のコントロールを使用して、ゲートを確立します。表皮幹細胞画分の亜集団を並べ替え、増殖前駆細胞画分、及びプロゲニター細胞画分をコミットした。PBS内の細胞の10倍の体積を含む15ミリリットルの円錐管に各並べ替えチューブの含有量を移すことによって、細胞亜集団の増殖能力を試験する。チューブを250回Gで5分間遠心分離する。上清を取り除き、KSFM-SCMの4ミリリットルでペレットを再懸濁します。再懸濁した細胞を6センチメートルのプレートに移し、湿度95%の5%の二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、プレートから培地を取り出し、70~80%の合流度に達するまで3日に37度で4ミリリットルのプリウォームKSFM-SCMを加えます。3D培養における正常ヒトケラチノサイトの自律表皮スフェロイド形成能は、皮膚表皮球アッセイを用いて評価した。非球状細胞凝集は、十分な表皮球形成とは考えられてはいなかった。緻密な球状の凝集は、自発的な回転楕円体形成の特徴と考えられた。適切な自発的な凝集を確実にするために、4つの細胞に2倍以上の10を使用する必要がありました。2D培養における表皮球の植え付けは、小さな生き生きとした正常なヒト角化細胞の増殖をもたらした。これらの培養物は、培養中の増殖や幹細胞状態を著しく損なう可能性がありますので、これらの培養物を100%以下に保つ必要があります。表皮スフェロイド形成の過程を、蛍光レポーターを用いたトランスフェクト細胞により、単一細胞レベルで機能的に追跡した。スフェロイド由来正常ヒト角化細胞は、インテグリンα6高、EGFは低い細胞である。細胞は一般的に約25%の培養を構成する。このステム様ケラチノサイト亜集団の特徴は、基底サイトケラチン14および腫瘍タンパク質63の免疫染色解析によって達成された。スフェロイド再めっきアッセイは、新生児ヒト皮膚からの表皮幹細胞の濃縮に有効な戦略です。このシステムは、創傷治癒や癌などの皮疾患を調査するハイスループット細胞系モデルとして採用することができる。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

人間の皮膚から実行可能な成人上皮幹細胞を単離の迅速、確実な方法が記載されている。方法は、毛包と細胞培養のための単一の細胞懸濁液または組織断片の分離の摘採が続く皮膚のコラーゲンマトリックスの酵素消化を、利用しています。...

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このプロトコルの目的は、分子生物学、生化学、蛍光活性化細胞選別、一次インビトロ用途(例えば、クロノジェニック)などの様々な下流アプリケーションのために、成体マウスの後皮から表皮ケラチノサイトを分離することです。ケラチノサイト)。...

マウス表皮ケラチノサイトの単離とインビトロクロノジェニック培養

このプロトコルは、再現性と堅牢な方法で三次元再構成ヒト表皮を栽培するための簡単な方法を記述する。さらに、表皮バリアモデルの構造機能関係を特徴付けます。炎症促進刺激の際に再構成されたヒト表皮の生物学的応答も提示される。...

3次元の再構築されたヒト表皮を大規模に育成

このプロトコールは、生細胞イメージングで使用するための新たに得られた(継代0)ケラチノサイトの培養を概説しています。...

ケラチノサイト生細胞イメージングのための初代培養物の生成

ここでは、継代0のケラチノサイトの系統を手動で追跡するために使用できるライブセルイメージング解析の方法を提供し、細胞分裂の運命や細胞周期の持続時間などの増殖指標を収集できるようにします。...

表皮ケラチノサイト増殖動態を研究するためのタイムラプス写真によるライブセルイメージング

このプロトコルは、皮膚の構造と機能を複製するために、平面の生理学的に関連する気液界面培養システムを使用して、ヒト人工多能性幹細胞から毛包を含む皮膚オルガノイドを製造する方法を概説します。...

気液界面培養システムを用いたヒト人工多能性幹細胞由来平面毛髪皮膚オルガノイドの作製

学ぶ 3D浮遊培養による表皮球体の作製と維持法。Dispase処理とスフェロイドリプレーティングアッセイを用いて、ケラチノサイト幹細胞の可塑性を高スループットで解析する革新的な細胞培養システムです。

ケラチノサイト幹細胞の可塑性をモデル化する高スループット表皮球面培養システムの確立

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