Name: 顔の発達を評価するための鳥類前脳キメラの作成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 10 s
Description: 学ぶ、鳥類前脳キメラ作成法により、基底前脳と顔面の組織相互作用を評価する技術。神経堤細胞の汚染を防ぎ、顔面発達における脳のシグナル伝達を正確に解析できる。

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この出版物で報告された研究は、国立衛生研究所の国立歯科頭蓋顔面研究所によって、賞番号R01DE019648、R01DE018234、およびR01DE019638でサポートされました。

白いペキンアヒル(アナスプラティリンコス)、白いレグホンチキン(ガルスガルス)、および日本のウズラ(Cortunix coturnix japonica)は、HH7/817でステージマッチングされるまで、加湿チャンバー内で37°Cでインキュベートされます。
1.ドナー組織の準備
注:試薬とツールの準備、および実験的操作のために卵を開く方法が説明されています6。
<ol><li>ニュートラルレッド、ガラストランスファーピペット、鋭利なタングステン針でDMEMメディアを準備します。</li>
	<li>胚を露出させます(6に示すように)。</li>
	<li>ステージ7/8の胚の基底前脳の左側から組織移植片を採取します。湾曲した鋭利なタングステン針6 を使用して、長さ~0.3 mm、幅0.2 mmの前脳の一部をそっと切開し、針が神経管の軸と平行になるように前脳の下に針をスライドさせて、下にある内胚葉を含めないようにします。</li>
	<li>ガラストランスファーピペットを使用して、ドナー胚から移植片をピックアップします。</li>
	<li>移植片をニュートラルレッドを含むDMEM(PBSで0.01%、23°C)に2分間移して染色し、染色したグラフトを生着の準備ができるまでニュートラルレッドを含まないDMEMに入れます。</li>
</ol>2. ホストの準備
<ol><li>白いレグホンチキン(Gallus gallus)の受精卵を加湿チャンバー内で37°CでHH7/8 17までインキュベートします。</li>
	<li>胚を露出させます(6に示すように)。</li>
	<li>鋭利なタングステン針を使用して、ドナー組織を分離するために行われたように、移植片を収容するために左側から0.3 mm x 0.2 mmの基底前脳片を静かに切断し、次に除去することによって移植部位を準備します。</li>
	<li>卵黄顆粒が作られた裂け目から漏れ始めるので明らかになるであろう、基礎となる内胚葉の過度の破壊を避けるように注意してください。これには練習が必要であり、すべての試行が成功するわけではありません。</li>
	<li>宿主6に移した後、宿主の摘出された基底前脳を置換するように移植片を配置する。</li>
	<li>穴にテープをしっかりと貼り、胚を37°Cのインキュベーターに戻し、分析に適した時間待ちます。</li>
</ol>

<ol><li>Waddington, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+Mechanics+of+Chicken+and+Duck+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental Mechanics of Chicken and Duck Embryos.</a> Nature. 125, 924-925 (1930).</li>
<li>Noden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+neural+crest+in+patterning+of+avian+cranial+skeletal%2C+connective%2C+and+muscle+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of the neural crest in patterning of avian cranial skeletal, connective, and muscle tissues.</a> Developmental Biology. 96 (1), 144-165 (1983).</li>
<li>Borue, X., Noden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+and+aberrant+craniofacial+myogenesis+by+grafted+trunk+somitic+and+segmental+plate+mesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Normal and aberrant craniofacial myogenesis by grafted trunk somitic and segmental plate mesoderm.</a> Development. 131 (16), 3967-3980 (2004).</li>
<li>Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quail-chick+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quail-chick chimeras.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 337-350 (2008).</li>
<li>Hu, D., Marcucio, R. S., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zone+of+frontonasal+ectoderm+regulates+patterning+and+growth+in+the+face%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face.</a> Development. 130 (9), 1749-1758 (2003).</li>
<li>Hu, D., Marcucio, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+signaling+properties+of+ectodermal+epithelia+during+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Assessing signaling properties of ectodermal epithelia during craniofacial development.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).</li>
<li>Hu, D., Marcucio, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+organization+of+the+frontonasal+ectodermal+zone+in+birds+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals.</a> Developmental Biology. 325 (1), 200-210 (2009).</li>
<li>Griffin, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf8+dosage+determines+midfacial+integration+and+polarity+within+the+nasal+and+optic+capsules%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Fgf8 dosage determines midfacial integration and polarity within the nasal and optic capsules.</a> Developmental Biology. 374 (1), 185-197 (2013).</li>
<li>Schneider, R. A., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+and+molecular+origins+of+beak+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The cellular and molecular origins of beak morphology.</a> Science. 299 (5606), 565-568 (2003).</li>
<li>Tucker, A. S., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+cells+provide+species-specific+patterning+information+in+the+developing+branchial+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Neural crest cells provide species-specific patterning information in the developing branchial skeleton.</a> Evolution & Development. 6 (1), 32-40 (2004).</li>
<li>Fish, J. L., Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+species-specific+contributions+to+craniofacial+development+using+quail-duck+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras.</a> Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).</li>
<li>Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+and+the+origin+of+species-specific+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Neural crest and the origin of species-specific pattern.</a> Genesis. 56 (6-7), 23219(2018).</li>
<li>Sohal, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+reciprocal+forebrain+transplantation+on+motility+and+hatching+in+chick+and+duck+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of reciprocal forebrain transplantation on motility and hatching in chick and duck embryos.</a> Brain Research. 113 (1), 35-43 (1976).</li>
<li>Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+avian+brain+chimeras+reveal+that+large+brain+size+differences+are+influenced+by+cell-interdependent+processes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Interspecies avian brain chimeras reveal that large brain size differences are influenced by cell-interdependent processes.</a> PLoS One. 7 (7), 42477(2012).</li>
<li>Hu, D., Marcucio, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+cells+pattern+the+surface+cephalic+ectoderm+during+FEZ+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Neural crest cells pattern the surface cephalic ectoderm during FEZ formation.</a> Developmental Dynamics. 241 (4), 732-740 (2012).</li>
<li>Hu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+from+the+brain+induce+variation+in+avian+facial+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Signals from the brain induce variation in avian facial shape.</a> Developmental Dynamics. 244 (9), 1133-1143 (2015).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li>
<li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlations+Between+the+Morphology+of+Sonic+Hedgehog+Expression+Domains+and+Embryonic+Craniofacial+Shape%5BTitle%5D)+AND+%22Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Correlations Between the Morphology of Sonic Hedgehog Expression Domains and Embryonic Craniofacial Shape.</a> Evolutionary Biology. 42 (3), 379-386 (2015).</li>
<li>Eames, B. F., Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genesis+of+cartilage+size+and+shape+during+development+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The genesis of cartilage size and shape during development and evolution.</a> Development. 135 (23), 3947-3958 (2008).</li>
<li>Merrill, A. E., Eames, B. F., Weston, S. J., Heath, T., Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchyme-dependent+BMP+signaling+directs+the+timing+of+mandibular+osteogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mesenchyme-dependent BMP signaling directs the timing of mandibular osteogenesis.</a> Development. 135 (7), 1223-1234 (2008).</li>
</ol>

すべての著者は開示するものは何もありません。

記載された方法は、基底前脳と隣接する外胚葉との間の組織相互作用の検査を可能にする。このアプローチは、ドナー組織が腹側前脳に限定されていたため、以前の前脳移植方法とは異なります。これにより、顔面形態のパターン化に関与することが示されている神経堤細胞の移植が排除されます9,10。したがって、移植片を基底前脳に制限することは、計画された実験結果を評価するために不可欠でした。
前脳移植を採用した以前の研究では13,14、神経外組織の存在は、結果が行動的であるか、または全体的な脳発達に関する宿主とドナーの環境を具体的にテストしたため、計画された結果測定値の解釈を妨げませんでした。これは、これらの発生学的アプローチを使用して実験を設計する際の重要な考慮事項であり、実現可能性は厳密さとバランスをとる必要があります。たとえば、推定神経堤細胞を除外するという要件は、克...

発生生物学における現代の研究の多くは、胚の形成における遺伝子の役割に焦点を当てています。遺伝的観点から発生メカニズムを調べるための優れたツールがあります。しかしながら、胚は組み立てられ、組織相互作用に応答して形態形成を受ける。鳥類系は、発生学がよく理解されていること、胚に容易にアクセスできること、鳥類系の分析のためのツールが十分に発達していること、胚が安価であることなどの理由で発生を調節するさまざまな組織相互作用を評価するために使用される古典的なツールです。
鳥類移植システムは、系統の追跡や発生中の組織相互作用の評価に、ほぼ1世紀にわたって広く採用されてきました1,2,3,4。このシステムは、上顎の形態形成を制御するシグナル伝達中枢である前鼻外胚葉帯(FEZ)を調べるために使用され5、以前にその技術を説明するビデオが公開されました6。ウズラのひよこに加えて、他の種も組織相互作用の分析のためのキメラを生産するために使用されてきました。例えば、野生型7および変異マウス8から移植されたマウスFEZおよびその他は、顔の骨格をパターン化する際の神経堤の役割を評価するためにアヒル、ウズラおよびニワトリ系を使用した9、10、11、12。
本研究では、ウズラ、アヒル、ヒナの胚の間で腹側前脳を相互に移植することにより、FEZにおける遺伝子発現パターンを制御する前脳の役割を評価した。前脳移植はこの分野では珍しいことではありません。これらの移植は、ウズラおよびアヒルの胚13における運動性の発達を評価するために使用されたが、これらの実験では、非神経誘導体に寄与する組織も移植された。他の研究では、鳥の聴覚回路は前脳移植14によって評価されていますが、これらの移植には、顔の形9,10に寄与し、FEZ15のSHH発現の調節に関与する推定神経堤細胞が含まれていました。そこで、神経管を閉じる前に、ある鳥種から別の鳥類に腹側前脳だけを移植するシステムを考案し、顔の形における脳の役割を評価しました16(図1A、B)。この方法は、移植片の神経堤汚染を欠いていた。本稿では、その方法を示し、期待される結果について説明し、直面する課題について説明します。

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>TEK</td><td>TEKZR114</td><td></td></tr><tr><td>35x10 mm シャー</td>レ <td>ファルコン</td><td>1008</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>サーモフィッシャー</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td>ニードルホルダー</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>ニュートラルレッド</td><td>シグマ</td><td>553-24-2</td><td></td></tr><tr><td>No. 5 デュモン鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペットサー</td><td>モフィ</td><td>ッシャー13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>QCPN抗体</td><td>発達研究ハイブリドーマバンク、アイオワ大学、アイオワ</td>州、米国 <td></td><td></td></tr><tr><td>はさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>タングステンニードル</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>26000</td><td></td></tr></tbody></table>

顔の発達を評価するための鳥類前脳キメラの作成

Creating Avian Forebrain Chimeras to Assess Facial Development

鳥類の胚は1世紀以上にわたってモデルシステムとして使用されており、脊椎動物の発生に関する基本的な理解につながっています。このモデルシステムの強みの1つは、キメラ胚における組織の効果と組織間の相互作用を直接評価できることです。我々はこれまでに、前脳からのシグナルが前鼻外胚葉帯(FEZ)におけるソニックハリネズミ(SHH)の発現ドメインの形状を制御することによって顔面形態形成に寄与することを示した。本稿では、前脳キメラの生成方法と、これらの実験の結果の実例について説明します。

キメラと移植汚染の評価 キメラを評価するために、キメラの程度および他の細胞型による移植片の汚染に対処するべきである。ウズラの組織をニワトリの胚に移植することによってキメラを作成することは、この種の分析を可能にする。QCPN抗体を用いてウズラ細胞を視覚化し、宿主組織と区別することができる(図1C、D)。この場合、腹側前脳に由来する組織のみを、移植片が神経堤を含む他の細胞型で汚染されていないことを示す抗体で染色した。キメラの程度は、ステレオロジーを使用して宿主細胞とドナー細胞をカウントするか、ドナー組織と宿主組織が占める領域を評価することによって、これらのセクションから推定できます。
形態学的および分子的転帰の評価 目的は、FEZの顔の形態と SHH 発現に対する腹側前脳の影響を評価することでした。最初に、上記のようにキメラ性を評価するためにQC...

この記事では、頭蓋顔面発達中の基底前脳のシグナル伝達とパターン化の特性をテストするために設計された組織移植技術について説明します。

The avian embryo has been used as a model system for more than a century and has led to fundamental understanding of vertebrate development. One of the ...

この方法により、研究者は基底前脳と顔の間の組織相互作用を評価することができます。この技術の主な利点は、評価のために基底前脳を分離し、分析を混乱させる神経堤細胞による汚染を防ぐことです。この技術の難しい部分は、宿主から前脳を取り除き、ドナー組織で置き換えることです。手順を実演するのは、ラルフ・マルクシオ博士の研究室の研究科学者であるダイアン・フーです。まず、ニュートラルレッド、ガラストランスファーピペット、鋭利なタングステンを含むDMEMメディアを準備します。10ミリリットルの注射器と18ゲージの針を使用して、卵殻の先のとがった端から0.5ミリリットルのアルブミンを取り除きます。はさみの先を使ってシェルの上に小さな穴を開けます。次に、穴の上にテープを置き、円形の開口部を切り取って胚を露出させます。胚をニュートラルレッドで染色します。ステージ7または8の胚の基底前脳の左側から組織移植片を採取します。湾曲した鋭利なタングステン針を使用して、前脳の一部をそっと切開します。下にある内胚葉を含めないようにするには、針を前脳の下、神経管の軸と平行にスライドさせます。ガラストランスファーピペットを使用してドナー胚から移植片をピックアップし、ニュートラルレッドを含むDMEMに2分間移して染色します。次に、染色した移植片を、生着の準備ができるまでニュートラルレッドを含まないDMEMに入れます。白いレグホンチキンの受精卵を加湿チャンバーで摂氏37度でハンバーガーハミルトンステージ7〜8までインキュベートします。前に示したように胚を露出させます。鋭利なタングステン針を使用して、移植片を収容するために0.3 x 0.2ミリメートルの基底前脳片を切断して除去することにより、移植部位を準備します。卵黄顆粒が作られた裂け目から漏れ始めるので明らかになるであろう、下にある内胚葉の過度の破壊を避けてください。移植片を宿主に移した後、移植片を配置して、宿主の摘出された基底前脳を置き換えます。穴の上にテープをしっかりと置き、分析の準備ができるまで胚を摂氏37度のインキュベーターに戻します。当初、キメラはウズラの組織をニワトリの胚に移植することによって作られました。QCPN抗体を用いて、ウズラ細胞を可視化し、宿主組織と区別した。ウズラ-ひよこシステムは、すべての移植片が神経組織のみで構成され、他の細胞型で汚染されていないことを確認しました。ウズラ組織のアヒル胚への移植は、ウズラの脳の発達が速いため、キメラをひどく変形させました。そのため、アヒル組織のニワトリ胚への移植が行われた。結果として生じるアヒルとひよこのキメラは、脳が形態の調節に関与していることを示唆しています。全山C2ハイブリダイゼーションを用いて、キメラにおけるソニックハリネズミの発現を評価した。形態と同様に、キメラのアヒル側のソニックハリネズミの表情はよりアヒルのように見えました。ホストサイトの準備には練習が必要です。多数の胚は生き残れないため、多数のキメラを作成することで、分析に適したサンプルを確保できます。この方法により、脳からの信号が前鼻外胚葉帯のソニックヘッジホッグ発現ドメインをどのように形成するかを評価することが可能になりました。

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JoVE Journal

Developmental Biology

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この記事では、頭蓋顔面の開発に神経堤および/または他の組織の種特異的な貢献をテストするために設計されたキメラ胚を生成する方法を説明します。...

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胚性メッケル軟骨でZebrabowクローン細胞分析によって軟骨細胞のインターカレーションと方向性増殖の可視化

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ここでは、組織相互作用、4Dイメージング、タイムラプス動画(3Dプラス時間)、分子機能のグローバルまたはローカル摂動、およびシステム生物学の特性評価を調べるために使用できる3種類の鳥類胚性皮膚外植片培養のプロトコルについて説明します。...

鳥類の皮膚外植片を用いた組織パターン形成と器官形成の研究

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顔の発達を評価するための鳥類前脳キメラの作成

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