顔の発達を評価するための鳥類前脳キメラの作成
2021年2月18日
この記事では、頭蓋顔面発達中の基底前脳のシグナル伝達とパターン化の特性をテストするために設計された組織移植技術について説明します。
この方法により、研究者は基底前脳と顔の間の組織相互作用を評価することができます。この技術の主な利点は、評価のために基底前脳を分離し、分析を混乱させる神経堤細胞による汚染を防ぐことです。この技術の難しい部分は、宿主から前脳を取り除き、ドナー組織で置き換えることです。
手順を実演するのは、ラルフ・マルクシオ博士の研究室の研究科学者であるダイアン・フーです。まず、ニュートラルレッド、ガラストランスファーピペット、鋭利なタングステンを含むDMEMメディアを準備します。10ミリリットルの注射器と18ゲージの針を使用して、卵殻の先のとがった端から0.5ミリリットルのアルブミンを取り除きます。
はさみの先を使ってシェルの上に小さな穴を開けます。次に、穴の上にテープを置き、円形の開口部を切り取って胚を露出させます。胚をニュートラルレッドで染色します。
ステージ7または8の胚の基底前脳の左側から組織移植片を採取します。湾曲した鋭利なタングステン針を使用して、前脳の一部をそっと切開します。下にある内胚葉を含めないようにするには、針を前脳の下、神経管の軸と平行にスライドさせます。
ガラストランスファーピペットを使用してドナー胚から移植片をピックアップし、ニュートラルレッドを含むDMEMに2分間移して染色します。次に、染色した移植片を、生着の準備ができるまでニュートラルレッドを含まないDMEMに入れます。白いレグホンチキンの受精卵を加湿チャンバーで摂氏37度でハンバーガーハミルトンステージ7〜8までインキュベートします。
前に示したように胚を露出させます。鋭利なタングステン針を使用して、移植片を収容するために0.3 x 0.2ミリメートルの基底前脳片を切断して除去することにより、移植部位を準備します。卵黄顆粒が作られた裂け目から漏れ始めるので明らかになるであろう、下にある内胚葉の過度の破壊を避けてください。
移植片を宿主に移した後、移植片を配置して、宿主の摘出された基底前脳を置き換えます。穴の上にテープをしっかりと置き、分析の準備ができるまで胚を摂氏37度のインキュベーターに戻します。当初、キメラはウズラの組織をニワトリの胚に移植することによって作られました。
QCPN抗体を用いて、ウズラ細胞を可視化し、宿主組織と区別した。ウズラ-ひよこシステムは、すべての移植片が神経組織のみで構成され、他の細胞型で汚染されていないことを確認しました。ウズラ組織のアヒル胚への移植は、ウズラの脳の発達が速いため、キメラをひどく変形させました。
そのため、アヒル組織のニワトリ胚への移植が行われた。結果として生じるアヒルとひよこのキメラは、脳が形態の調節に関与していることを示唆しています。全山C2ハイブリダイゼーションを用いて、キメラにおけるソニックハリネズミの発現を評価した。
形態と同様に、キメラのアヒル側のソニックハリネズミの表情はよりアヒルのように見えました。ホストサイトの準備には練習が必要です。多数の胚は生き残れないため、多数のキメラを作成することで、分析に適したサンプルを確保できます。
この方法により、脳からの信号が前鼻外胚葉帯のソニックヘッジホッグ発現ドメインをどのように形成するかを評価することが可能になりました。
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概要
本記事では、頭顔面の発達過程において、基底前脳と顔面の間の組織相互作用を評価することを可能にする組織移植法について解説します。この手法では、基底前脳を単離して評価するため、神経堤細胞による混入を防ぐことができます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 頭蓋顔面発達
- 組織移植技術
背景
- 基底前脳は、頭蓋顔面の発達において重要な役割を果たします。
- 組織間の相互作用を理解することは、発生生物学において不可欠です。
- 神経堤細胞による汚染は、解析を困難にする可能性があります。
- 基底前脳を単離することで、そのシグナル伝達特性をより明確に評価することが可能になります。
研究目的
- 基底前脳のシグナリングおよびパターニング特性を検証すること。
- 信頼性の高い組織移植法を開発すること。
- 頭蓋顔面の発達メカニズムへの理解を深めること。
使用した手法
- ニュートラルレッドを含むDMEM培地の調製。
- ガラス転移ピペットおよび研磨したタングステンの使用。
- 注射器を用いた卵殻先端部のアルブミンの除去。
- ホスト前脳のドナー組織への置換。
主な結果
- この手法により、解析のための前脳基底部を効果的に単離できます。
- 研究科学者による手順の実演。
- コンタミネーションのない、組織間相互作用の正確な評価。
- 頭蓋顔面発達における前脳基底部の役割に関する知見。
結論
- 移植技術は、頭蓋顔面の発達を研究するための有用なツールです。
- 基底前脳を単離することで、発達評価の精度を高めることができます。
- この手法は、発達神経科学におけるさらなる研究に応用可能です。
よくある質問
産業界における重要性
この手法では、神経堤細胞による混在要因を排除して基底部前脳を単離することで、頭蓋顔面発達における組織シグナリングの精密な評価が可能になります。これにより、前鼻外胚葉帯におけるSonic hedgehogなどの形態形成経路を脳由来シグナルがいかに制御しているかが明確になり、ターゲットバリデーションにおけるメカニズム的なリスク低減が促進されます。本アプローチは、初期創薬段階において予測精度の高い信頼性をもって発達経路を評価するための、疾患に関連した系を提供します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 脊椎動物の発達における脳・顔面組織の相互作用に関する治療仮説を検証します。
- 運用の価値： 前脳基底部のシグナル伝達特性を単離することで、機能的なターゲットバリデーションを可能にします。
- 予測的価値： 前脳基底部の操作とSHH発現ドメインの変化を関連付けることで、予測の信頼性を高めます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： モルフォゲン発現の定量評価に適した、検証済みキメラシステムを構築する。
- 実用的価値： 組織移植を標準化し、異なる実験条件下で再現性のあるアッセイ結果を得られるようにする。
- 拡張性： 複数のキメラ作製を容易にし、低い生存率を克服して分析の堅牢性を確保する。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 翻訳的連続性： 基礎研究段階で得られたメカニズムに関する知見を、頭蓋顔面パターニングの前臨床モデルへと結びつけます。
- メカニズムによるリスク低減： 先天性疾患モデルにおける重要な経路であるSHHの上流調節因子を明らかにします。
- 疾患関連システム： 鳥類キメラを用いて、保存された脊椎動物の顔面形成メカニズムを研究します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、リード化合物の同定作業に先立ち、組織相互作用アッセイによってターゲットの信頼性を評価する初期探索ワークフローに適しています。
- 探索生物学：頭蓋顔面形態形成におけるシグナル中心の仮説検証をサポートします。
- アッセイの準備：定量的なSHH発現解析のための標準化された生物学的システムを構築します。
- 分析：主要なアウトカムとして、空間的な遺伝子発現の変化を測定するためのホールマウントin situハイブリダイゼーションを可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：神経組織の移植から顔面表現型の結果に至るまでのメカニズムの一貫性を提供します。
- 企業の再利用：発生経路に対する組織特異的な寄与を評価するための、再利用可能なプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 顔面形成における基底前脳信号を単離することで、メカニズムの曖昧さを軽減する。
- 運用の価値： 標準化された移植およびホスト調製技術により、再現性を確保する。
- 戦略的価値： SHHなどの薬剤標的となる経路の上流レギュレーターを明確にすることで、go/no-go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響： 検証済みの組織相互作用データに基づいた、リスク調整後のターゲット優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- 顕微外科的な組織操作および鳥類胚操作の専門知識が必要です。
- 研磨済みタングステン針やガラス転送ピペットなどの専用器具を使用します。
- ホスト胚およびドナー胚に対して、標準化された培養およびステージングプロトコルが必要です。
- 卵黄の漏出を防ぎ、ホストの生存率を確保するために、移植部位の準備の最適化が含まれます。
- 胚の生存率が低いため、信頼性の高い分析には多数のサンプル数が必要です。
