Name: クライオ軟X線断層撮影による細胞の3D地図作成記述 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 学ぶ クライオ軟X線断層撮影による細胞の3次元可視化手法。染色や切片不要で25-30nmの分解能でミトコンドリアや核などの細胞小器官を定量的に観察できる。感染症研究や創薬開発への応用に有用である。

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このプロジェクトは、欧州委員会のHorizon 2020 iNEXT-Discoveryプロジェクトと、Marie Skłodowska-Curie助成金契約No 75439に基づく欧州連合のHorizon 2020研究およびイノベーションプログラムから資金提供を受けています。

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<li>Chichón, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo+nano-tomography+of+vaccinia+virus+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryo nano-tomography of vaccinia virus infected cells.</a> Journal of Structural Biology. 177, 202-211 (2012).</li>
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<li>Weiss, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computed+tomography+of+cryogenic+biological+specimens+based+on+X-ray+microscopic+images%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Computed tomography of cryogenic biological specimens based on X-ray microscopic images.</a> Ultramicroscopy. 84, 185-197 (2000).</li>
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<li>Duke, E. M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+endosomes+and+autophagosomes+in+whole+mammalian+cells+using+correlative+cryo-fluorescence+and+cryo-soft+X-ray+microscopy+%28cryo-CLXM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Imaging endosomes and autophagosomes in whole mammalian cells using correlative cryo-fluorescence and cryo-soft X-ray microscopy (cryo-CLXM).</a> Ultramicroscopy. 143, 77-87 (2014).</li>
<li>Cinquin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putting+molecules+in+their+place%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Putting molecules in their place.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 115, 209-216 (2014).</li>
<li>Hagen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+nanoparticles+as+alignment+and+correlation+markers+in+fluorescence%2Fsoft+X-ray+cryo-microscopy%2Ftomography+of+nucleoplasmic+reticulum+and+apoptosis+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Multimodal nanoparticles as alignment and correlation markers in fluorescence/soft X-ray cryo-microscopy/tomography of nucleoplasmic reticulum and apoptosis in mammalian cells.</a> Ultramicroscopy. 146, 46-54 (2014).</li>
<li>Pérez-Berná, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+changes+in+cells+images+by+soft+X-ray+cryo-tomography+during+Hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Structural changes in cells images by soft X-ray cryo-tomography during Hepatitis C virus infection.</a> ACS Nano. 10, 6597-6611 (2016).</li>
<li>Chiappi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-soft+X-ray+tomography+as+a+quantitative+three-dimensional+tool+to+model+nanoparticle%3Acell+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Cryo-soft X-ray tomography as a quantitative three-dimensional tool to model nanoparticle:cell interaction.</a> Journal of Nanobiotechnology. 14, 15(2016).</li>
<li>Varsano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+correlative+cryo-soft+X-ray+tomography+and+stochastic+reconstruction+microscopy.+A+study+of+cholesterol+crystal+early+formation+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Development of correlative cryo-soft X-ray tomography and stochastic reconstruction microscopy. A study of cholesterol crystal early formation in cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 138, 14931-14940 (2016).</li>
<li>Kounatidis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+cryo-structured+illumination+fluorescence+microscopy+and+soft+X-ray+tomography+elucidates+reovirus+intracellular+release+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Correlative cryo-structured illumination fluorescence microscopy and soft X-ray tomography elucidates reovirus intracellular release pathway.</a> Cell. 182, 1-16 (2020).</li>
<li>Kapishnikov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mode+of+action+of+quinoline+antimalarial+drugs+in+red+blood+cells+infected+by+Plasmodium+falciparum+revealed+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Mode of action of quinoline antimalarial drugs in red blood cells infected by Plasmodium falciparum revealed in vivo.</a> PNAS. 116 (46), 22946-22952 (2019).</li>
<li>Conesa, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unambiguous+intracellular+localization+and+quantification+of+a+potent+iridium+anticancer+compound+by+correlative+3D+cryo+X-ray+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Unambiguous intracellular localization and quantification of a potent iridium anticancer compound by correlative 3D cryo X-ray imaging.</a> Angewandte Chemie International Edition. 59, 1270-1278 (2020).</li>
<li>Gal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native-state+imaging+of+calcifying+and+noncalcifying+microalgae+reveals+similarities+in+their+calcium+storage+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Native-state imaging of calcifying and noncalcifying microalgae reveals similarities in their calcium storage organelles.</a> PNAS. 115 (43), 11000-11005 (2018).</li>
<li>Procopio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+fingerprint+of+Zn-hydroxyapatite+in+the+early+stages+of+osteogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">Chemical fingerprint of Zn-hydroxyapatite in the early stages of osteogenic differentiation.</a> ACS Central Science. 5, 1449-1460 (2019).</li>
<li>Kahil, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+pathways+of+calcium+transport+and+concentration+toward+mineral+formation+in+sea+urchin+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Cellular pathways of calcium transport and concentration toward mineral formation in sea urchin larvae.</a> PNAS. 117 (49), 30957-30965 (2020).</li>
<li>Conesa, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+nanoparticles+mass+quantification+by+near-edge+absorption+soft+X-ray+nanotomography%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Intracellular nanoparticles mass quantification by near-edge absorption soft X-ray nanotomography.</a> Scientific Reports. 6, 22354(2016).</li>
<li>Otón, J., Sorzano, C. O. S., Maribini, R., Pereiro, E., Carazo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+the+modulation+transfer+function+of+an+X-ray+microscope+based+on+multiple+Fourier+orders+analysis+of+a+Siemens+star%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Measurement of the modulation transfer function of an X-ray microscope based on multiple Fourier orders analysis of a Siemens star.</a> Optics Express. 23 (8), 9567-9572 (2015).</li>
<li>Otón, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+transfer+function%2C+resolution+and+depth+of+field+of+a+soft+X-ray+microscope+applied+to+tomography+enhancement+by+Wiener+deconvolution%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Characterization of transfer function, resolution and depth of field of a soft X-ray microscope applied to tomography enhancement by Wiener deconvolution.</a> Biomedical Optics Express. 7, 5092-5103 (2016).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).</li>
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<li>Messaoudi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+chemical+mapping+by+EFTEM-TomoJ+including+improvement+of+SNR+by+PCA+and+ART+reconstruction+of+volume+by+noise+supression%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional chemical mapping by EFTEM-TomoJ including improvement of SNR by PCA and ART reconstruction of volume by noise supression.</a> Microscopy Microanalysis. 19, 1669-1677 (2013).</li>
<li>Agulleiro, J. I., Fernández, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+tomographic+reconstruction+on+multicore+computers%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast tomographic reconstruction on multicore computers.</a> Bioinformatics. 27, 582-583 (2011).</li>
<li>Toro-Nahuelpan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+cryo-electron+microscopy+grids+by+photo-micropatterning+for+in-cell+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies.</a> Nature Methods. 17, 50-54 (2020).</li>
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<li>Howells, M., Jacobsen, C., Warwick, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHowells%2C+M+%22Principles+and+Applications+of+Zone+Plate+X-ray.+Microscopes.+Science+of+Microscopy%22">Principles and Applications of Zone Plate X-ray. Microscopes. Science of Microscopy</a>. , Springer. New York. (2007).</li>
<li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Chemistry%22%5BJournal%5D)">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25, 1605-1612 (2004).</li>
<li>Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy+image+browser%3A+a+platform+for+segmentation+and+analysis+of+multidimensional+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Microscopy image browser: a platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets.</a> PLOS Biology. 14 (1), 1002340(2016).</li>
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</ol>

著者らは利益相反がないと宣言しています。

サンプル調製は、高品質の軟X線断層撮影を得るための重要なステップであり、その品質はサンプルガラス化の品質および細胞が埋め込まれた氷層の厚さに直接依存する。信号対雑音比の高い突起は、薄い氷層を有する領域に収集され、可能な限り高い分解能を達成するために必要な放射線量を最小限に抑えることができる。さらに、セルのコンフルエンシーは、回転時に隣接するセルがFoVに入るのを避ける必要があるため、最終的な断層撮影の品質にも影響します。最後に、Au基準マーカーの正しい分散によって投影アライメントの精度が決定され、最終的に最終的な3D再構成ボリュームの品質が決定されます。グリッド上にAu基準が適切に広がると、投影アライメントステップの自動化が可能になり、そのような重要なステップには高い専門知識が必要ないことに注意してください。
本明細書のプロトコルは、1つの可能な試料調製戦略を描写しているにすぎず、これはクライオ電子断層撮影法(cryo−ET)で使用されるものと類似している。どちらの場合も、より再現性を高めるために要求の厳しいサンプル調製を改善するプロトコルは、これらの技術の成功のための基本であり、この目標に向けて努力が払われている29。単離された細胞を画像化することに加えて、セクションを通る伝達信号が高い傾斜角で十分であれば、組織の切片も視覚化できることに言及する価値がある。通常、これは数ミクロン(10μm未満)のセクションを意味します。
セル内の特定の構造またはイベントをイメージするには、この特定の機能がチルトシリーズのFoV内にあることを確認する必要があります。クライオSXTのFoVは、レンズに応じて10 x 10μm2~15 x 15μm2に制限されており、解像度のピクセルオーバーサンプリングを少なくとも2倍にするため、多くの場合、セル全体の拡張よりも小さくなります(図5に示す赤い四角を参照)。したがって、ROIが見つかり、適切にラベル付けされる必要があります。これは通常、蛍光タグと可視光相関アプローチによって行われます。軟X線透過顕微鏡は統合されたオンライン可視光蛍光顕微鏡を備えているため、落射蛍光を組み合わせた2D戦略は簡単ですが、高解像度の2Dまたは3D蛍光シグナルのための他のアプローチも利用可能です4、12、13、15、16.そのような場合、グリッドは、超解像顕微鏡などの特定の機器で最初に画像化する必要があります。最も効率的な相関アプローチは、極低温条件下でのデータ収集を伴うアプローチであることに注意してください。これは、例えば、室温(RT)、可視光蛍光イメージング、およびサンプルガラス化の間の時間経過が、適切な細胞事象を時間通りに捕捉することを妨げるためである。さらに、ガラス化保存手順は、RTで画像化された目的の細胞をグリッドから切り離す可能性がある。たとえほとんどの相関イメージングアプローチが、サンプルグリッドを操作してある機器から別の機器に輸送しなければならないことを意味するとしても、グリッドの汚染や損傷のリスクが高まっているにもかかわらず、その報酬は明らかです:細胞ランドスケープ内の特定のイベントや分子を特定できること。
全細胞イメージングが必要な場合、適用される総線量が放射線損傷限界を超えない限り、異なる断層画像をステッチングすることが可能である。通常、同じ細胞上に少数の断層画像を収集するための堆積線量は、達成可能な分解能(109Gy )で限界をはるかに下回っているため、これはサンプルおよび実験に依存するが、線量を下げるための特定の戦略は必要ない。分光断層撮影などの集中的なデータ収集の場合、線量を最小限に抑えることが実際に必要であり、便利なデータ収集と特定の処理戦略を適用する必要があります。
Cryo-SXTにはいくつかの制限がありますが、ここで言及する必要があります。最初のものはよく知られている欠落ウエッジで、フラットサンプルサポートの使用に固有のものです。180度の回転を可能にするキャピラリーサンプルサポートは過去に使用されており、現在でも一部の施設で使用されていますが、ガラス吸収によるコントラストの低下や懸濁液中の細胞の使用制限などの欠点もあります。欠落したくさびの影響を軽減する方法は、デュアルチルト断層撮影を行うことです。これは確かに今日のミストラルビームラインで可能です。第2の制限は、顕微鏡などに用いられるフレネルゾーンプレートレンズによって設定される。このレンズは、達成可能な究極の解像度と被写界深度(DoF)を設定し、どちらも密接に関連しています。これは、分解能を上げるとDoFが減少し、セルの厚さが大きくなることが多いことを意味します。たとえば、40 nmレンズは理論的には3 μmのDoFと24.4 nmのハーフピッチの分解能を持ちます。したがって、解像度とDoFとの間の妥協は戦略的であり、レンズの選択は、セル30、31のタイプに依存するであろう。最後に、世界中で運用されているTXMは理想的な顕微鏡とはほど遠く、理論的な期待に達するために光学系を改善するための努力が払われています。最後に、再構成されたボリュームの視覚化およびセグメンテーションは、特定のソフトウェアツール25、32、33、34を用いて行うことができる。
要約すると、cryo-SXTは、中程度の分解能(25〜30nmのハーフピッチ)および統計的な数値(1日あたり数十の断層撮影)で細胞を定量的にイメージングすることを可能にする。これにより、特定の条件、例えば病原体の感染または疾患の間、正確な時点または特定の治療後における細胞小器官の組織、分布、および寸法を得ることができる。したがって、これは、より一般的な電子顕微鏡および可視光顕微鏡に有用な補完的な生物学的イメージング技術であり、それぞれが特定の範囲のサンプル寸法および分解能に取り組む。Cryo-SXTは、可視光蛍光を含む相関アプローチで頻繁に使用されますが、他のクライオ相関戦略も可能です。

Cryo-SXTは、水和した全細胞1、2、3、4、5、6の3D媒体分解能(25〜30nmハーフピッチ)ボリュームを提供するため、生物学的イメージング研究において中心的な役割を果たすことができます。水窓エネルギー範囲では、炭素と酸素吸収Kエッジ(4.4-2.3nm)の間に、炭素に富む細胞構造は、それらを浸透して取り囲む酸素に富む媒体の10倍以上を吸収する。このエネルギー範囲では、厚さ10μmまでのガラス化細胞を切片化や染色を必要とせずに画像化することができ、定量的な高吸収コントラスト投影をもたらし、サンプル回転能力と組み合わせることで、細胞構造の断層再構成を可能にする。Cryo-SXTは、他のイメージング技術では容易にアクセスできない試料寸法と空間分解能の点でニッチを埋めます。
簡単に言えば、厚さtの試料を通る光子の減衰は、以下のようにビール・ランバートの法則に従うので、クライオ−SXTの吸収コントラストは定量的である:<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62190/62190eq01.jpg" style="margin:-.4em 0;">ここで、I0は入射強度を表し、μlは波長λおよび試料の屈折率の虚部βに依存する線形吸収係数(<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62190/62190eq02.jpg" style="margin:-.4em 0;">).減衰は、生化学的組成と画像化される構造の厚さの関数であり、各生化学成分は特定のX線線形吸収係数μ1(LAC)を有する。これは、各断層撮影ボクセル値が、そのボクセル7中の化学元素およびそれらの濃度に依存することを意味する。これにより、核、ヌクレオリ、脂質体またはミトコンドリアなどの異なる細胞小器官の自然な識別、または再構成された固有のLAC値のみに基づいてクロマチンの異なる圧縮状態を自然に識別することができます2,8,9。
さらに、クライオSXTはハイスループット技術で、断層撮影は数分で収集されます。これにより、分裂、分化、アポトーシスなどの重要な時点でキャプチャできる細胞集団のメソスケールイメージングが特に可能になりますが、特定の薬物療法への化学的曝露や病原性感染によって誘発されるような異なる応答状態でもキャプチャできます。これらの重要なポイントで収集されたデータは、それらの特定の瞬間における異なる細胞小器官の空間組織の忠実な記録とともに、システムの3D記述を提供する。
通常、クライオ−SXTは、3D細胞環境内の特定の特徴、事象、または巨大分子の位置を特定することを可能にする相関的アプローチに従う他の技術と組み合わせて使用される4、10、11、12、13、14、15、16、またはハード蛍光X線データ17、18.極低温条件下での相関アプローチは、関心のあるシステムの最も完全で価値のある画像を得るために最も重要です。ミストラル(Alba)およびB24(ダイヤモンド)クライオSXTビームラインの典型的なワークフローの簡潔な要約を図1にスケッチします。
また、シンクロトロン設備の波長同調能力を活かして、試料に含まれる特定の元素の特定の微分吸収を利用した構造的な情報に加えて、分光情報も得ることができる。この例は、細胞19、20、21におけるバイオミネラリゼーションプロセスの研究におけるカルシウムの位置であろう。異なる光子エネルギー(スペクトル)または断層図で2D画像を撮影することによって、関心のあるX線吸収端で、選択された元素を含むピクセルまたはボクセルを識別することができる。スペクトルはまた、化学状態の鑑別(すなわち、前のバイオミネラリゼーション例20におけるような非晶質カルシウムのハイドロキシアパタイトへの進化)を可能にする。異なる元素の定量化は2Dと3Dで可能です。ガラス化細胞の分光画像化は、典型的には、水窓で行われるが、含水率が十分に低い場合、または脱水を含む他の試料調製プロトコルが使用される場合、他のエネルギー範囲でも可能である22。ステップバイステップの詳細な分光法プロトコルは、本明細書のプロトコルの焦点を超えている。
以下では、プロトコルは主要なサンプル調製ステップを簡単に要約することに焦点を当てていますが、各システムは個々の改良が必要な場合がありますが、クライオ軟X線断層撮影のための詳細なステップバイステップのデータ収集手順が続きます。

<table><tbody><tr><td>Amira</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Au Holey Carbon Films&nbsp; ファインダーグリッド</td><td>(Quantifoil Micro Tools Gmb</td><td>&nbsp;R 2/2 Au G200F1</td><td>Au Holey カーボンフィルムファインダーグリッド</td></tr><tr><td>Au ナノ粒子</td><td>&nbsp;BBI Group, Cardiff, UK</td><td>Au nanoparticles 100nm</td><td>100nm Au nanoparticles (NPs) at Mistral (Alba)</td></tr><tr><td>Au ナノ粒子</td><td>&nbsp;BBI Group, Cardiff, UK</td><td>Au nanoparticles 250nm</td><td>250 nm Au nanoparticles (NPs) at B24 (Diamond)</td></tr><tr><td>Axio Scope A1</td><td>Zeiss</td><td>430035 9060</td><td>Fluorescence microscope</td></tr><tr><td>Blotting No.1 filter paper</td><td>Whatman</td><td>WHA10010155</td><td>Blotting filter</td></tr><tr><td>Bsoft</td><td></td><td></td><td>投影アライメント、再構成、可視化のためのソフトウェア (Heymann et al., 2008)</td></tr><tr><td>Chimera</td><td></td><td></td><td>セグメンテーション用ソフトウェア (Pettersen et al. 2004)</td></tr><tr><td>Cryo-EM Glow Discharge Set</td><td>PELCO easiGlow</td><td>91000S</td><td>Glow Discharge Cleaning System</td></tr><tr><td>Cu Holey Carbon Films&nbsp; finder grids</td><td>(Quantifoil Micro Tools Gmb</td><td>&nbsp;R 2/2Cu G200F1</td><td>Cu Holey カーボン フィルム ファインダー グリッド</td></tr><tr><td>胎児の子牛血清</td><td>Σ</td><td>F9665</td><td>熱不活性化、滅菌フィルター、細胞培養に適しています</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Javaでの画像処理と分析のためのソフトウェア (NIH &LOCI University of Wisconsin)</td></tr><tr><td>IMOD</td><td></td><td></td><td>Software for projection alignment, reconstruction and visualization (Kremer et al., 1996)</td></tr><tr><td>Leica EM GP Grid Plunger</td><td>Leica</td><td>16706401</td><td>Automatic Plunge Freezer EM</td></tr><tr><td>LINKAM cryo-stage</td><td>Linkam Scientific Instruments</td><td>CMS 196</td><td>Cryo-Correlative Microscopy Stage</td></tr><tr><td>MIB</td><td></td><td></td><td>セグメンテーション用ソフトウェア (Belevich et al. 2016)</td></tr><tr><td>P100 ペトリ皿</td><td></td><td>Sigma P6106</td><td>細胞培養および滅菌処理済み</td></tr><tr><td>P60 ペトリ皿</td><td>Sigma</td><td>D8054</td><td>細胞培養および滅菌処理済み</td></tr><tr><td>ポリリジン</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td>ポリ-L-リジン溶液 0.01%、滅菌フィルター付き</td></tr><tr><td>軟X線顕微鏡 0.25-1.2keV</td><td>Xradia</td><td>NCT-SB</td><td>トランスミッションソフトX線顕微鏡</td></tr><tr><td>SURVOS</td><td></td><td></td><td>セグメンテーション用ソフトウェア&nbsp;(Luengo et al. 2017)</td></tr><tr><td>Tomo3d</td><td></td><td></td><td>再構築ソフトウェア (SIRT, WBP) (Agulleiro et al. 2011)</td></tr><tr><td>TomoJ</td><td></td><td></td><td>再構築ソフトウェア (ART) (Messaoudi et al., 2007)</td></tr><tr><td>XM Data Explorer</td><td>Zeiss</td><td></td><td>TXM ソフトウェア</td></tr></tbody></table>

クライオ軟x線断層撮影による細胞の3d地図作成記述

A 3D Cartographic Description of the Cell by Cryo Soft X-ray Tomography

イメージング技術は、生物学研究および関連分野における細胞組織および機構を理解するための基礎である。これらの技術の中で、クライオ軟X線断層撮影法(SXT)は、炭素構造が本質的に水よりも高い吸収を有する水窓X線エネルギー範囲(284〜543eV)で凍結保存細胞全体をイメージングすることを可能にし、各ボクセルに含まれる材料の線形吸収係数の3D再構成を可能にする。厚さ10μmまでの細胞全体のレベルでの定量的構造情報は、このようにして、25〜30nmのハーフピッチまでの高スループットと空間分解能で達成可能です。Cryo-SXTは、細胞感染プロセス(ウイルス、細菌、寄生虫)、疾患(劣性遺伝性疾患など)による形態学的変化に関する3D情報を提供し、細胞レベルでの薬物作用の理解、または3D細胞環境における特定の構造の特定に関する3D情報を提供し、現在の生物医学研究に関連することが証明されています。さらに、シンクロトロン施設での同調可能な波長を利用して、分光顕微鏡またはその3D対応物である分光断層撮影法は、バイオミネラリゼーションプロセスにおけるカルシウムなどの細胞内の特定の元素を画像化および定量するためにも使用することができる。Cryo-SXTは、電子顕微鏡、蛍光X線、可視光蛍光などの他の生物学的イメージング技術に補完的な情報を提供し、機能、位置、形態をリンクするために極低温条件下での2Dまたは3D相関イメージングのパートナー方法として一般的に使用されています。

クライオ SXT 用のサンプルの準備は困難な場合があります。同じサンプルグリッド内であっても、同じ Au ファインダーグリッドからの 2 つの正方形を示す 図 5 に示すように、理想的な領域と非理想的な領域を持つことができます。理想的なサンプルは、正方形のメッシュの中心に単一の細胞を持ち、薄い氷の層に埋め込まれ、断層撮影再建の前に傾斜突起の位置合わせに使用されるよく分散したAu基準マーカーに囲まれている必要があります。 図5A は、これらの基準の多くに準拠した線維芽細胞様細胞(NIH 3T3)を示す。視野(FoV)を示す赤いボックスでマークされた領域のART27 を使用した3D再構成からの単一のスライスを 図5Bに示す。ミトコンドリア(M)、小胞体(ER)、小胞体(V)、核(N)などの多くの異なる細胞小器官は、LACの定量的再構成のおかげで区別することができる。加えて、再構成の信号対雑音比は非常に高いので、細胞特徴の高いコントラストを達成することを可能にする。一方、 図5C は、より高いセル密度を有する正方形を示す。このため、ブロッティングは通常効率が低く、氷層が厚くなったり、ガラス化の問題が生じたりします。場合によっては、X線イメージングの前に落射蛍光マッピングを使用してグリッドをスクリーニングするときに、これはすでに観察することができ、これらのグリッドはいかなる犠牲を払っても避けるべきである。 図5Cでは、グリッド内の亀裂とガラス化氷がメッシュ正方形全体(赤い矢印でマーク)を通っていることが観察できます。亀裂の近くのイメージングは、ビームにさらされたときのグリッドの不安定性のために避けるべきです。さらに、亀裂は、この地域の場合と同様に、厚い氷の兆候である可能性があります。チルトシリーズは、赤いボックスでマークされた領域に記録されました。 図5Dでは、対応する3D再構成からの単一のスライスが示されている。いくつかの大きな構造は認識できますが、例えば矢印で指し示された上部ミトコンドリアに具体的に見られるように、厚い氷のガラス化品質が悪いため、ノイズやざらざらした質感の中で細かいディテールが失われます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62190/62190fig1v2.jpg"> 図1:ワークフロー クライオ-SXTデータ収集の前に回路図ワークフローが続きました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62190/62190fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62190/62190fig02.jpg"> 図2:グリッド上の細胞の成長。 (A)約80%〜90%の合流点を有するP100ペトリ皿で成長する細胞。(B)細胞を播種した後にいくつかのグリッドを有するP60ペトリ皿。(C) 24 時間後にグリッドの上に成長するセル。スケール バー: 100 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62190/62190fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62190/62190fig03.jpg"> 図3:サンプルホルダーと移送チャンバへのグリッドの積み込み 。(A)シャトルとクライオボックスで液体窒素で満たされたワークステーションは、グリッドをロードする準備ができています。(B)グリッドをロードした状態でローダーに挿入されたサンプルホルダー。(C)カバーなしでサンプルホルダーを位置3にしてシャトル。(D) 移送室が取り付けられたワークステーション。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62190/62190fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62190/62190fig04.jpg"> 図4:TXMへのサンプルの装填(A)移送チャンバをTXMに取り付ける。(B) TXM内のシャトル。(c)サンプルホルダーをサンプルステージに挿入するTXMロボットアーム。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62190/62190fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62190/62190fig05.jpg"> 図5:クライオ軟X線断層撮影の例。上段:理想的なサンプル、(A)中央に孤立したセルを示すグリッド正方形の2Dモザイク図。(B)赤いボックス(A)でマークされた領域を示す再構築された3Dボリュームからの1つのスライス。(D)と比較して、画像ははるかに滑らかで、より多くの詳細が表示されます。下段:理想的でないサンプル、(C)高すぎるセルコンフルエンシーおよび氷およびグリッド箔の亀裂を示すグリッド正方形の2Dモザイク図(赤い矢印)。(D) (C) の赤いボックスでマークされた領域を示す再構築された 3D ボリュームからの 1 つのスライス。ガラス化が悪いか、または最適でないガラス化は、画像の粒状の質感によって識別することができる。N:核;M: ミトコンドリア;ER:小胞体;MV:多胞体;V:液胞;スケールバー:A &amp; C 20 μm;B &amp; D 2 μm.V<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62190/62190fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るにはここをクリックしてください。</a>

ここでは、クライオ軟X線断層撮影法(SXT)で凍結保存細胞全体の超構造を25nmハーフピッチの分解能で画像化するために必要なサンプル調製およびデータ収集ステップを説明するプロトコルを提示する。

クライオ軟X線断層撮影による細胞の3D地図作成記述

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these ...

クライオ軟X線断層撮影法は、スタンドアロンとして、または他のイメージング技術と組み合わせて使用できる細胞レベルで定量的な貴重な情報を提供することができます。凍結した水和状態のセンサ画像は、染色または切片化の必要がある。さらに、各断層撮影がわずか数分で収集されるため、ハイスループットの手法です。軟X線クライオ断層撮影は、単一細胞レベルで感染細胞または欠損細胞の細胞復元プロセスを追跡するための完璧なプラットフォームを提供します。この技術は、編集された表現型の感染を元に戻すための新しい抗ウイルス薬またはおよび遺伝子治療の有効性を報告することができる。透過X線顕微鏡にサンプルをロードするには、移送チャンバを液体窒素で100ケルビン未満になるまで冷却します。ワークステーションに追加の液体窒素を満たし、ワークステーションリムのヒーターをオンにします。ワークステーションのリムが沸騰しなくなったら、グリッドを入れたクライオボックスをクライオ条件下でワークステーション内の適切な場所に置き、グリッドを以前に冷却したサンプルホルダーにロードします。ホルダーをシャトルに積み込み、カバーで保護します。シャトルを100ケルビン未満で移送チャンバにロードし、チャンバを低真空にポンプで送ります。移送チャンバを顕微鏡に取り付け、スクリーン上の真空手順に従って移送チャンバシャトルを顕微鏡にロードします。シャトルがサンプルとともに顕微鏡に入ったら、顕微鏡ロボットアームを使用して、1つのサンプルホルダーをサンプルステージに移します。オンライン可視光顕微鏡でグリッドの明視野イメージングを行うには、可視光顕微鏡カメラを選択し、明視野イメージング用の可視光顕微鏡LEDソースをオンにします。「モーション」、「コントロール」、「サンプル」、および「サンプルシータ」をクリックしてサンプルを可視光顕微鏡の対物レンズに向くようにマイナス 60 度に回転させ、「モーションコントロール」と「サンプル」を選択し、サンプル X とサンプル Y を変更してサンプルを予期される中心位置に移動します。顕微鏡、集録、集録設定、集録モード、連続、および開始を選択し、[モーションコントロール]と[サンプル]をクリックしてサンプルZを選択し、細胞および/または炭素支持フィルムの穴に焦点が合うまで5ミクロンまで小さなステップで焦点を絞り込みます。次に、[顕微鏡]、[取得]、[取得設定]、[取得モード]、[モザイク]、[開始]を選択して、モザイクの既定値を使用して、明視野モードでグリッドの完全なモザイクマップの取得を開始します。蛍光モードモザイクイメージングの場合は、明視野イメージング用の可視光顕微鏡LED光源をオフにし、セットアップで目的の励起波長に対応するLED光源と対応する光学フィルタを手動で選択します。顕微鏡、集録、集録設定、集録モード、連続、および開始を選択し、「モーションコントロール」と「サンプル」をクリックしてサンプルZを選択し、蛍光画像に焦点を合わせます。次に、[顕微鏡]、[取得]、[取得設定]、[取得モード]、[モザイク]、[開始]をクリックして、明視野モザイクからの位置 X パラメーターと Y パラメーターを保持するモザイク マップの取得を開始します。その後、LED光源の電源を切ります。X線モザイク取得の場合は、出口スリットを5ミクロンに変更し、MISTRALで1秒間露光します。「顕微鏡」、「集録」、「集録設定」、「カメラ設定」、および「ビニング」を選択して、サンプルの Z 変換を使用してフォーカスを調整します。モーションコントロールとサンプルを選択してサンプルZを選択します。5ミクロンのステップから始めて、セルまたはカーボンホイルホールに焦点が合うまでフォーカスを0.5ミクロンのステップまで絞り込みます。メッシュ正方形のモザイクマップを取得するには、「顕微鏡」、「取得」、「取得設定」、「取得モード」、「モザイク」、および「開始」をクリックします。マップが取得されたら、「モーションコントロール」と「サンプル」をクリックし、サンプル X とサンプル Y を変更して、サンプルを平坦なフィールド位置に移動します。MISTRAL での露出時間を 1 秒に設定します。そして、取得したモザイクをフラットフィールド画像で正規化し、正規化したモザイクを保存して送信を得る。回転軸上のサンプルを 0 度の回転に合わせるには、「モーションコントロール」と「サンプル」を選択し、サンプル X、サンプル Y、およびサンプル Z を変更して、回転軸に配置するセルの特徴に焦点を合わせます。サンプルを正のシータ位置に回転させるには、「モーションコントロール」と「サンプル」を選択し、「サンプルシータ」を正のシータに変更します。線ツールを使用して、回転軸に配置するセルの特徴に線を描画します。サンプルを負のシータ位置に回転させるには、「モーションコントロール」と「サンプル」を選択し、「サンプルシータ」を負のシータに変更します。線ツールを使用して、回転軸に配置するセルの特徴に線を描画します。正または負のθ位置にいる間、サンプル Z 平行移動を使用して、選択したフィーチャを両方のライン間の中心位置に移動し、最小ライン間距離が得られるまでサンプルの回転を繰り返します。サンプルシータがゼロに等しい場合は、選択したフィーチャを視野の中心に配置するのに必要な距離の 2 倍の距離でサンプル X を移動し、ゾーン プレート X を移動してフィーチャを視野の中心に戻します。新しい回転軸に対するゾーンプレートの Z 位置を再最適化するには、[顕微鏡]、[集録]、[集録設定]、[集録モード]、および [焦点系列] を選択し、[開始] をクリックしてゾーンプレート Z 焦点系列を記録します。次に、「モーションコントロール」と「ゾーンプレート」をクリックし、ゾーンプレートZを選択して、サンプルに焦点が合っている位置にゾーンプレートZを移動します。断層撮影を取得するには、「モーションコントロール」と「サンプル」をクリックし、「サンプルシータ」を選択して、負の最大角度をプラス 0.1 に移動します。顕微鏡、集録、集録設定、集録モード、断層撮影の順にクリックし、角度ゼロの画像と角度範囲を考慮して、画像の数を角度の合計数として設定し、画像の数を設定します。「角度の開始」と「角度の終了」を選択し、「顕微鏡」、「取得」、「取得設定」、「カメラ設定」をクリックして、露出時間を設定します。「開始」をクリックして、断層撮影チルトシリーズの取得を開始します。理想的なサンプルは、薄い氷の層に埋め込まれた正方形のメッシュの中心に単一の細胞を持ち、よく分散した金の基準マーカーに囲まれている必要があります。ミトコンドリア、小胞体、液胞体、核などの多くの異なる細胞小器官は、線形吸収係数の定量的再構成のおかげで、最終的な再構成断層図で区別できるはずです。この画像では、セル密度の高い正方形が観察できます。この例では、ブロッティングの効率が低く、亀裂のある氷層が厚くなりました。この調製ではいくつかの大きな構造を認識することができるが、厚い氷のガラス化品質が悪いため、ノイズとざらざらした質感の中で細かいディテールが失われていた。クライオ保存されたサンプルは、この段階のサンプルが生成されるとほとんどのアーティファクトが誘発されるため、最小限に抑える必要があります。通常、相関クライオ可視光顕微鏡は、クライオ基板断層撮影に先立って使用する。さらに、スペクトル顕微鏡は、関連する化学元素で行うことができます。このプロトコルは、他の直接イメージング技術では容易にアクセスできない試料および分解能レジームで動作することによってニッチを埋め、数ミクロンおよび30ナノメートルのハーフピッチ分解能を可能にします。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ネイティブに近い状態の細菌細胞の超微細構造を研究するために電子cryotomography（ECT）を使用する方法を私たちは、"高分子"（〜4...

細菌細胞の電子Cryotomography

我々は高速3D生細胞の蛍光顕微鏡および高分解能低温電子断層撮影法を組み合わせた相関顕微鏡法を記載している。我々はダイナミックイメージング、宿主HeLa細胞との相互作用小HIV-1粒子による相関法の能力を実証する。...

ダイナミックな相互作用の3次元構造解析のための相関顕微鏡

超微細構造解析のための神経突起を維持するために、我々は、ガラス質氷の層に懸濁したサンプルを得瞬間冷凍に続く電子顕微鏡グリッド上に、一次ニューロンのメッキのためのプロトコルを記述します。これらのサンプルは、ナノメートルスケールでの構造を可視化するために低温電子顕微鏡で調べることができる。...

低温電子断層撮影法を用いて凍結 - 和状態で神経突起を可視化するための一次ニューロンの調製

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電子クラ​​イオトモグラフィーによるミトコンドリアにおけるATP合成酵素二量体の可視化

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高圧低温電子トモグラフィー法によるシアノ バクテリアの DNA 締固めの可視化

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全細胞クライオ電子断層撮影ワークフロー内での細胞位置のダイレクト位置を測定するマイクロパターン化透過電子顕微鏡グリッド

本プロトコルは、Tomo5を用いた高分解能クライオ電子線トモグラフィー遠隔データ収集と、その後のデータ処理およびemClarityを用いたサブトモグラム平均化について記述する。アポフェリチンは、2.86...

クライオ電子線トモグラフィー遠隔データ収集とサブトモグラム平均化

クライオSTEMトモグラフィーは、埋め込み、切片作成、またはその他の侵襲的な調製物なしで、無傷の細胞の細胞小器官を視覚化する手段を提供します。得られた3D解像度は現在、数ナノメートルの範囲であり、数マイクロメートルの視野および1μmのオーダーのアクセス可能な厚さを有する。...

クライオSTEMトモグラフィーによるオルガネラのin situ 可視化

クライオ電子線トモグラフィー(クライオET)は、ナノメートルの分解能で細胞の超微細構造を3D可視化することを可能にしますが、手作業によるセグメンテーションは依然として時間がかかり、複雑です。クライオET断層撮影のための高度なバーチャルリアリティソフトウェアを統合した新しいワークフローを提示し、哺乳類細胞のミトコンドリアのセグメンテーションを通じてその有効性を示します。...

バーチャルリアリティを活用したクライオ電子線トモグラフィーデータの没入型セグメンテーションと解析

学ぶ クライオ軟X線断層撮影による細胞の3次元可視化手法。染色や切片不要で25-30nmの分解能でミトコンドリアや核などの細胞小器官を定量的に観察できる。感染症研究や創薬開発への応用に有用である。

クライオ軟X線断層撮影による細胞の3D地図作成記述

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