カルシウム蛍光色素標識とナノ粒子追跡解析を用いたヒトの尿中ナノ結晶の推定

このプロトコルは、ヒト尿中のカルシウム含有ナノ結晶を特異的に検出することができる。この技術は、腎臓結石の形成の初期段階だけでなく、結晶尿素に関連する他の疾患を予測するのに役立つ可能性があります。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の研究者IVであるパルヴィーン・クマール博士です。

参加者に3日間の低シュウ酸塩食餌食を摂取させ、一晩で速く食べさせる。その後、参加者から24時間尿サンプルを採取してから、シュウ酸塩負荷を摂取させます。約8ミリモルのシュウ酸塩負荷を有する果物や野菜を含むスムージーを参加者に与えます。

参加者に24時間の尿を摂取させ、翌日に戻してもらいます。すべての尿サンプルは、処理前に室温で維持してください。尿のpHと尿サンプルの体積を測定し、記録します。

十分に混合し、ラベル付けされた無菌50ミリリットル円錐形チューブに尿の50ミリリットルを追加します。ベンチトップ遠心分離機を用いて室温で10分間1、200倍Gで試料を遠心する。上清を捨て、100%エタノールの5ミリリットルでペレットを再び洗浄し、再中断します。

ベンチトップ遠心分離機を用いて室温で10分間1、200倍Gで試料を遠心する。上清を捨て、100%エタノールの1ミリリットルでペレットを再懸濁します。後で処理するためにマイナス20°Cでサンプルを保存するか、すぐにサンプルの染色を進めます。

100ナノメートルサイズの金ナノ粒子を超純水に1:1,000の比で希釈し、機器の設定を最適化するために使用します。尿サンプルを水中で20回希釈してから、5ミリモルFluo-4 AMで暗い状態で30分間染色し、NTAを用いてサンプルを分析します。NTA分析の前に、テキスト原稿に記載されているように、シュウ酸カルシウムおよびリン酸カルシウム結晶を調製する。

コンピュータと機器の電源を入れ、ソフトウェアを開いてカメラの電源を入れます。ウィンドウの左上隅にあるキャプチャ アイコンをクリックして、キャプチャ モードを開始します。プラットフォームがきれいに見えるまで、最初に1ミリリットルのシリンジを使用して空気を送り込み、プラットフォームをきれいにします。

装置に水を2~3回静かに加え、もう1ミリリットルのシリンジを使用して気泡を取り除きます。プラットフォームがクリーンになったら、水を加えて、カメラを見て表面に汚染がないか確認し、サンプルローディングポンプインジェクタにコントロールとして金ナノ粒子を追加して機器をセットアップします。画像が色付きピクセルを表示し始めるまで、画面上またはノブのカメラレベルをインストゥルメントの右側に調整し、カメラレベルを下げます。

次に、画面を調整して画像を最適化します。ビデオ画像上でマウスボタンを左クリックします。マウスの左ボタンを押したまま、画像を上下にドラッグして、ビュー全体を表示します。

注入速度を設定し、カメラの画面に金ナノ粒子が表示されるようにカメラをフォーカスします。初期セットアップの場合は注入速度を高く設定し、金ナノ粒子が確実に検出されるようにします。検出されたら、金ナノ粒子を可視化するために、毎分50マイクロリットルに速度を下げます。

カメラレベルを調整してパーティクルを視覚化します。染色されていないサンプルの場合は、レベル 5 で画面ゲインを調整してカメラのフォーカスを得て、カメラレベルを 8 に設定します。フォーカスが設定されたら、サンプルを記録します。

最適化後、他のサンプルを評価する前に装置を再度水で洗浄し、チューブがきれいで粒子が存在しないことを確認します。染色されたサンプルを分析するには、適切な蛍光フィルターを含むフィルター位置にカメラを調整し、サンプルを希釈して染色したサンプルをサンプルローディングポンプインジェクタにロードし、分析のために1分あたり20マイクロリットルの速度に下げます。画面のゲインを 5 に、カメラ レベルを 13 に調整します。

各測定後にデータを保存します。各サンプルの5つの測定値すべてについてナノ粒子の平均数を計算し、平均の標準偏差または標準偏差を使用してデータを分析します。ペア分析には T 検定を使用します。

Fluo-4 AMは、50〜270ナノメートルの大きさで、1ミリリットル当たり1,2億6,000万粒子の平均濃度を有するシュウ酸カルシウム結晶と、30〜225ナノメートルの平均濃度を有するリン酸カルシウム結晶と、1ミリリットル当たり平均濃度2,2億2,000万粒子に結合することができました。シュウ酸塩負荷の前に採取された24時間尿サンプルには、110〜300ナノメートルの間のいくつかの尿ナノ結晶が含まれていました。これに対し、シュウ酸後のサンプルに存在する尿中ナノ結晶が有意に増加した。

この方法の再現性を確認するために、サンプルを3回測定し、技術的複製に有意な変動はなかった。このプロトコルを試みると、気泡のないサンプルをマシンに追加するのが難しい場合があります。これを防ぐには、機械に空気と水を加え、サンプルをゆっくりと追加します。

また、サンプルを継続的に監視し、気泡がないことを確認してください。この新しい方法は、病気の進行を監視し、腎臓結石のリスクを予測するために、シュウ酸カルシウム腎臓結石病の個人でテストされます。