内在的に発現したヒトRYR1変異体の機能特性評価

ここでは、エプスタインバーウイルスで内因的に発現するRYR1変異の機能的効果を研究するために用いられる方法について、ヒトBリンパ球および筋生検由来衛星細胞をミオチューブに分化した不死生のヒトリンパ球が説明されている。

このプロトコルは患者材料を使用するため重要です。患者が病気を持っている場合、細胞を使用すると、患者の生物学的応答をより正確に反映する必要があります。このテクニックは、実行が簡単で、簡単で、洗練された機器を必要としません。

これらの方法は、診断に使用することができ、例えば、RYR1突然変異が機能的にカルシウム恒常性を変化させる、ならびに化合物の潜在的な治療機能を試験することを証明する。個々の研究者の知識と技術力に応じて、実際の患者サンプルを使用する前にテスト実験を行う必要があります。EBV形質転換Bリンパ球の細胞内カルシウム濃度の変化を監視するために、クレブスリンガー溶液およびFura-2 AMの1ミリリットル濃度当たりの7番目の細胞に10倍の不死化されたB細胞を摂氏37度で30分のインキュベートのために5ミクロモルの最終濃度に再懸濁させる。

インキュベーションの終わりに、遠心分離によって細胞を収集し、新鮮なクレブスリンガー溶液中のペレットをミリリットル濃度当たり6番目の細胞に2倍10〜6番目の細胞で再懸濁する。実験を開始する直前に、細胞を再び遠心分離し、0.5ミリモルEGTAを添加したクレブスリンガー溶液の1.5ミリリットルの細胞を迅速に再懸濁させるが、カルシウムは添加しなかった。細胞をガラス、3ミリリットル分光蛍光計キュベットに移し、最大速度と37°Cに設定された磁気攪拌機を約30秒間備えた分光蛍光計の蛍光比を記録します。

単一細胞のカルシウム放出応答を評価するには、クレブスリンガー溶液の1ミリリットルに1ミリリットルのFura-2 AMを装填した細胞を個々のポリLリジンコーティングガラスカバースリップに1回1回プレートし、加湿細胞培養器で37°Cでカバースリップを37°Cでインキュベートします。細胞が付着したら、カバースリップを灌流チャンバーに入れ、毎分1ミリモルのカルシウムを補ったクレブスリンガーの溶液の2ミリリットルで細胞を浸透させ始める。40倍の油浸し目的と適切なフィルターを備えた反転蛍光顕微鏡を使用して、ソフトウェア制御の充電結合デバイスカメラ取り付けで、固定露光時間でオンライン測定を記録します。

細胞刺激を達成するために、アゴニストの異なる濃度を追加するために12バルブと細胞灌流刺激剤を使用してください。ヒトの筋肉生検からミオチューブを分離するには、まず生殖不能PBSで生検をすすいで余分な血液を取り除き、組織を0.5~1ミリメートルの断片に細分化する。1.5ミリリットルのヒト筋肉成長培地を含む6ウェル組織培養プレートの各ウェルに2〜3個の断片を挿入し、1回の挿入物につき500マイクロリットルの培地を各ウェルに挿入し、プレートを細胞培養インキュベーターに入れる。

ヒトミオチューブにおけるカルシウム発現の変化を測定するために、多核化ミオチューブが観察される場合、ミオチューブ培養上清を、1ミリモルFura-2 AMの10マイクロリットルを添加した新鮮な分化培地に置き換えて、細胞培養インキュベーターで30分間インキュベートする。インキュベーションの最後に、1つのガラスカバースリップ培養液を灌流チャンバーに移し、2ミリモル塩化カルシウムを補ったクレブスリンガーの溶液で細胞をすすいすります。次に、20倍の水浸し目的を使用して実証されたオンラインカルシウム測定を行います。

この代表的な分析では、長期にわたって徐々に安静レベルに戻ったアゴニストの添加後、EBV不死化Bリンパ球でカルシウムの急激な増加が観察された。同様の実験では、400ナノモルタプシガーギンを添加すると、2.4個の任意の単位のピーク蛍光値に達する大きなカルシウム過渡期を引き起こした。この蛍光値は、対応する用量応答曲線が構築された場合に100%であると考えられた。

この分析では、不死化B細胞を5ミリモルカフェインで20秒間刺激し、340および380ナノメートルの蛍光比を即座に増加させた。各カフェイン濃度試験について、蛍光の340×380ナノメートルの比でカフェイン誘発ピークを計算し、用量応答曲線を構築するために使用した。分化されたミオチューブからのカルシウム放出は、塩化カリウムによるフラッシング、アゴニストの異なる濃度、および/またはカフェイン、および正常な用量応答曲線を生成することに応答して評価することもできる。

細胞がFura-2で正しくロードされていること、そして340ナノメートルと380ナノメートルの両方の波長がアゴニストの添加に反応することを確認することが重要です。蛍光カルシウム指標を用いた細胞内カルシウム測定は、ほとんどの哺乳動物細胞で調べることができ、異なる刺激に応答して細胞内カルシウムの変化の研究に応用することができます。