TGF β媒介性間葉転移(EndMT)およびCRISPR/Cas9遺伝子編集を用いたEndMTエフェクターの機能評価
February 26th, 2021
細胞形態変化を観察し、免疫蛍光染色を用いたEndMT関連マーカー変化の発現を調べることにより、内皮細胞におけるTGF-β2誘導EndMTを調べる方法について述べる。CRISPR/Cas9遺伝子編集は、TGF-β2誘導EndMTにおけるその役割を調査するためにカタツムリをコードする遺伝子を枯渇させるために記述され、使用された。
内皮間葉転移は、内皮細胞が石畳の形態を線維芽細胞様表現型に変える細胞過程である。サイトカインTGF-βと、成長因子ベータを転換すると、この移行の主な原動力である。細胞形態の変化と内皮および間葉マーカーの発現レベルを解析することで、内皮間葉転移の発生を評価することができます。
新しいデータは、癌、心血管疾患、線維症を含む様々な疾患に間葉間間質移行プロセスに内皮をリンクします。そして、データは、介入が治療上の利益である可能性があることを示唆しています。胚発生や臓器の発達中に起こる間葉間転移過程に内皮を刺激することで、軟骨、骨、筋肉などの間葉由来組織を再生できる可能性があります。
免疫白色染色により細胞内タンパク質を検出するためには、0.1%Triton X-100を用いた細胞透過化は、抗体が細胞膜を通過できるようにするために必要である。このビデオデモンストレーションでは、研究者は間葉間質移行への内皮的なTGF-βのようなサイトカインの役割を調べる方法を把握するでしょう。まず、DMEMの膵島膵臓膵臓MS1細胞を10%FBSと1ミリリットルペニシリンおよびストレプトマイシンを0.1%ゼラチンコーティング培養プレートに補充した。
細胞培養インキュベーターで一晩培養した後、0.25%トリプシン、0.02%EDTA溶液を摂氏37度で2分間処理する前にPBSで細胞を洗浄します。細胞が剥離し始めると、5ミリリットルの完全な培養培地で反応を焼き付け、得られた細胞懸濁液を遠心分離のために15ミリリットルのチューブに移す。カウント用の新鮮な完全な媒体の4ミリリットルにペレットを再中断します。
そして、新しい細胞培養容器に1立方センチメートル当たり1 X 10^3細胞を播種する。一晩培養した後、5つのマイクロモルTGF-β受容体キナーゼ阻害剤SB-431542とDMSO溶媒制御を有する2つのウェルを用いて2つのウェルを治療する。細胞培養インキュベーターに30分間細胞を入れる。
インキュベーションの最後に、2つのウェルを車両制御で扱い、TGF-β2で2つの井戸を扱います。3日後、反転顕微鏡を用いて、明視野イメージング下の各細胞処理群の細胞形態を調べる。免疫蛍光染色によるendMT関連マーカーの変化を評価するには、示されるように適切なMS1細胞培養物から細胞を取り外します。
そして、24ウェルプレートの個々のウェル内に置かれた0.1%ゼラチンコーティング12ミリメートル丸カバーグラスに1.9 X 10^3細胞濃度で細胞を播種します。一晩培養した後、TGF-β2の1ナノグラムミリリットルで細胞を3日間処理する。インキュベーションの終わりに、PBSで細胞を洗浄し、室温で10分間、ウェルあたり4%ホルムアルデヒドの300マイクロリットルで処理培養物を固定します。
固定の終了時に、細胞をPBSで3回洗浄してから、300マイクロリットルの0.1%トリトンX-100とPBSあたり10分間、室温で10分間透過させます。インキュベーションの終了時に、細胞をPBSで3回洗浄し、PBSで3%BSAで細胞をブロックします。室温で45分後、細胞に一次PECAM-1およびSM22-α抗体を室温で45分間ラベルし、続いてPBSで3回の洗剤を使用します。
最後の洗浄後、適切な二次抗体を用いて細胞を室温で45分間インキュベートし、PBSで細胞を3回洗浄してから、DAPI補充付き装着媒体とカバースリップで細胞を装着します。次に、カバースリップの縁部をクリアマニキュアで密封し、標準的なイメージングプロトコルに従って適切なフィルタを使用して蛍光共焦点顕微鏡による細胞マーカー発現を画像化します。TGF-β2で3日間の治療を行った後、内皮MS1細胞は石畳のような構造を失い、紡錘状の間葉様細胞に分化する。
このTGF-β2誘導分化は、細胞がTGF-β受容体キナーゼ阻害剤SB-431542に曝露されると抑制される。内皮タンパク質PECAM-1の発現は、間葉因子SM-22αが深くアップレギュレートされている間葉因子SM-22αの間葉因子間でTGF-β2刺激後に強く減少する。さらに、スラグ発現は影響を受けない間、カタツムリはTGF-β2曝露によって著しくアップレギュレートされる。
CRISPR-Cas9遺伝子編集が観察されるように、2つの独立したカタツムリ単一ガイドRNAをCas9発現MS1細胞に導入してカタツムリ発現を破壊するのを容易にすることができる。Snailのノックアウトは、MS1細胞におけるTGF-β2によって駆動される線維芽細胞様細胞形態を阻害し、TGF-β2媒介したPECAM-1の低下およびSM-22アルファ増強を阻止するのに十分である。蛍光免疫による細胞形態の変化と内皮および間葉マーカーの発現の評価は、ウエスタンブロット分析における定量PCRに対するこれらのマーカーの発現を測定することによってさらに検証することができる。
間葉転移に対する内皮的な発見のこの技術は、研究者が複数の疾患で起こる生理学的プロセスとしてこの新たな意義を調査することを可能にした。
概要
この研究は、形態学的変化とマーカー発現に焦点を当て、内皮細胞におけるTGF-β2誘導エンドセリュラーから間葉系への移行（EndMT）を調査します。これらのプロセスへの寄与を評価するために、CRISPR/Cas9遺伝子編集を使用してSnail遺伝子の役割が検討されます。
主要な研究要素
研究分野
- エンドセリュラーから間葉系への移行
- がんや線維症などの疾患への影響
- EndMTの調節の治療的可能性
背景
- EndMTは、エンドセリュラーを間葉系様の状態に変換するプロセスです。
- TGF-β2はこの移行を促進する主要なサイトカインです。
- 様々な疾患や再生医療におけるEndMTの重要性が強調されています。
使用した方法
- 細胞の形態とマーカー発現を評価するための免疫蛍光染色
- MS1エンドセリュラーモデル
- Snail発現を阻害するためのCRISPR/Cas9遺伝子編集
主要な結果
- 分析により、TGF-β2処理後のMS1エンドセリュラーの形態学的変化が示されました。
- PECAM-1発現は減少し、SM-22 alphaは増加し、EndMTの発生を示しました。
- Snailノックアウトは形態学的変化を阻害し、TGF-β2誘導EndMTにおけるその役割を確認しました。
結論
- この研究は、TGF-β2誘導EndMTのメカニズムとSnailの役割を解明しました。
- 結果は、様々な疾患におけるEndMTを標的とする潜在的な治療戦略を示唆しています。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Understanding TGF-β2-induced endothelial to mesenchymal transition (EndMT) provides mechanistic insight into disease pathways relevant to fibrosis, cancer, and cardiovascular disorders. Genetic interrogation of EndMT effectors using CRISPR/Cas9 enables target validation and de-risking of therapeutic hypotheses in early discovery. This approach supports predictive confidence in identifying novel regulators of endothelial plasticity for translational applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the role of specific transcription factors like Snail in TGF-β2-driven phenotypic conversion.
- Operational Value: Enables functional validation of putative EndMT modulators through genetic knockout in a relevant endothelial model.
- Predictive Value: Supports target de-risking by establishing causal links between gene expression and mesenchymal transition phenotypes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Establishes a quantitative immunofluorescence-based readout for EndMT using endothelial (PECAM-1) and mesenchymal (SM-22-alpha) markers.
- Operational Value: Provides a standardized, reproducible assay format for monitoring TGF-β2-induced phenotypic changes in MS1 cells.
- Scalability Value: Compatible with genetic and pharmacological screening formats to identify novel EndMT regulators.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Links EndMT modulation to potential therapeutic strategies in fibrosis and cancer where endothelial plasticity contributes to pathogenesis.
- Preclinical Relevance: Uses a murine pancreatic microvascular endothelial cell model to study conserved mechanisms of TGF-β2 signaling.
- Mechanistic De-risking: Validates Snail as a necessary effector of TGF-β2-induced EndMT, supporting target confidence in pathway inhibition strategies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, enabling mechanistic de-risking before compound screening or in vivo validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of cytokine-driven transcriptional programs in endothelial cells using genetic perturbation.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative morphological and biomarker readouts suitable for high-content screening adaptation.
- Analytics: Generates multiplexed protein expression and localization data via immunofluorescence to assess pathway modulation.
- Translational Research: Connects endothelial phenotype changes to disease-relevant processes like fibrosis and tumor stroma formation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying endothelial plasticity across multiple disease contexts and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic clarity on EndMT regulation, reducing ambiguity in target selection for anti-fibrotic or anti-cancer strategies.
- Operational Value: Delivers a standardized, reproducible system for assessing endothelial phenotype transitions with built-in controls (e.g., TGF-β receptor inhibition).
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by validating target necessity in a disease-relevant cellular context prior to investment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of EndMT-modulating targets based on genetic validation evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in endothelial cell culture, CRISPR/Cas9 gene editing, and immunofluorescence microscopy.
- Dependent on access to fluorescence confocal microscopy and standardized imaging protocols for marker quantification.
- Necessitates optimization of guide RNA efficiency and validation of knockout efficiency across clonal populations.
- Requires standardization of TGF-β2 dosing and timing to ensure reproducible EndMT induction across experiments.
- Limited to in vitro models; findings require validation in physiologically relevant systems such as co-cultures or animal models of disease.
