Name: 代謝標識と薄層クロマトグラフィーによる サッカロミセス・セレビシエ における中性脂質合成の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 学ぶ ¹⁴C酢酸代謝標識と薄層クロマトグラフィーによるSaccharomyces cerevisiaeの中性脂質合成解析法。遺伝的背景を問わず脂質代謝酵素の調節機構を定量的に評価できます。

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著者らは、この研究の完了に関するヘルプと概念的なアドバイスをヘンネ研究所のメンバーに感謝したいと考えています。W.M.H.は、ウェルチ財団(I-1873)、NIH NIGMS(GM119768)、アラパレスギアン医学研究基金、UT南西部寄付奨学生プログラムからの資金によって支えられています。S.R は T32 プログラム交付 (5T32GM008297) によってサポートされています。

1. 14C-酢酸を用いて酵母細胞の増殖と標識
<ol><li>プレートからコロニーを摘み取り、2%デキストロースを含む合成完全(SC)培地の20mLに分配して酵母培養を接種する(SC培地のレシピについては 補足ファイル を参照)。200rpmで振盪して一晩30°Cでインキュベートする。 注:成長条件、サンプル量、および治療は、対象の脂質に基づいて異なります。完全な実験を実行する前に、最適な成長条件と培養量を経験的に決定する必要があります。このプロトコルは、生体膜および細胞増殖が遅くなるとの成長段階、およびNL合成が非常に活発である、静止期に成長した酵母培養物の放射性標識について議論する。</li>
	<li>分光光度計を用いた一晩培養中のOD600 を測定し、2%デキストロースを含む新鮮なSC培地中の0.2の最終OD600 に酵母細胞培養を希釈した。細胞を24時間成長させるか、または静止期に達するまで(これは一般的に細胞倍増OD600 測定の平らな内層によって定義される)。</li>
	<li>セルを収集する前に、クエンチバッファを作成します(詳細は 補足ファイル を参照)。各サンプルに対して20 mLのクエンチン化バッファーのアリコートを2つ作り(すなわち、各サンプルに対して40 mLの焼入れバッファー)、2つの50 mL円錐形チューブに均等に分割します。今後使用するために、クエンチバッファーアリコートを-80 °Cに保管してください。</li>
	<li>培養物が所望のODまたは増殖段階に達したら、4,100xgで10分間遠心して細胞を採取する。サンプルが遠心分離機にある間、最終濃度10μCi/mLのデキストロースフリーSC培地に[1-14C]酢酸ナトリウム塩を添加して、放射性標識媒体を調製します。 注意:放射性物質を扱う際には、適切な個人用保護具(PPE)を常に着用する必要があります。放射性物質の適切な保管、使用、廃棄については、常に現地のガイドラインに従ってください。 注:標識媒体中の 14C-酢酸の濃度と放射性標識インキュベーション時間の両方を、目的の代謝産物に応じて調整する必要があります。ここでは、20分の放射標識パルスインキュベーションが使用され、これは豊富な範囲のNL種を標識するのに十分である。</li>
	<li>ペレット化した細胞から上清を取り出し、ペレットをピペットで再懸濁して20mLのデキストロースフリーSC培地で細胞ペレットを1回洗浄する。5分間4,100 x g で遠心分離機を使用して細胞を再び回収します。</li>
	<li>デキストロースフリーSC培地中の細胞を1mLに再懸濁し、細胞を標識した2mLマイクロ遠心分離管に移す。2分間4,100 x g で遠心分離して細胞を再び回収します。</li>
	<li>デキストロースフリーSC培地の500μLで細胞を再懸濁します。50 mL円錐形チューブ用の遠心分離機を-10°Cまたは最低温度設定で事前に冷却します。</li>
	<li>500 μLの細胞懸濁液(最終 14C-酢酸濃度= 5 μCi/mL)に500μLの放射性標識媒体を素早く添加することで、放射標識期間を開始します。ラベリング期間の終了前に30°Cの回転インキュベーターでチューブを20分間インキュベートし、各サンプルの20 mLアリコートを-80°C冷凍庫から氷のバケツに移します。</li>
	<li>放射標識の期間が終了したら、ピペットを使用して、1 mL サンプル全体を 20 mL のコールドクエンチング バッファーに突き落とします。5-10 s用の円錐管をボルテックスし、試料が焼入れバッファーと完全に混合されていることを確認する。氷上で2分間、焼入れバッファーにサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>-10 °Cまたは最低温度設定で3分の5,000 x g で遠心分離機で回転させて細胞ペレットを収集します。サンプルチューブが回転している間に、-80°C冷凍庫から氷で満たされたバケツ(すなわち、サンプルごとに20 mLチューブの1つ)に焼入れバッファーアリコートの別のセットを移します。</li>
	<li>細胞ペレットから焼入れバッファー上清を取り出し、20 mL 新鮮な、冷たい、焼入れバッファーに交換します。渦を振り、ペレットが円錐管の底部から外れ、焼入れバッファーに完全に再懸濁されるまでサンプルを振る。サンプルを5,000 x g で-10°Cで3分間再び遠心分離し、細胞を採取する。</li>
	<li>細胞がペレット化されたら、上清を注ぎ出し、ピペットで余分なものを取り除くことによって、サンプルからすべての焼入れバッファーを完全に除去します。さらに処理するために-80°Cでチューブを保管してください。</li>
</ol>2. 酵母からの総脂質の分離
注:脂質の分離のための次のプロトコルは、効率的に最も中立脂質種17、18を抽出する確立され、頻繁に使用される方法に基づいています。 注意:有機溶剤を使用する場合は、常に適切なPPEを着用し、可能な限りヒュームフードの内側で作業してください。脂質抽出の際は、有機溶剤と相性のないプラスチックを使用しないでください。ポリプロピレンチューブは、次のプロトコルに適しています。
<ol><li>各サンプルに対して0.3gの酸洗浄ガラスビーズの重量を量り、氷の上の2 mLマイクロ遠心分離チューブに保管してください。-80°C冷凍庫から細胞ペレットを取り出し、氷の上に保管します。各サンプルに350 μLメタノールと700 μLクロロホルムを加え、再懸濁し、あらかじめ計量したガラスビーズを含むマイクロ遠心チューブに移します。</li>
	<li>渦3x上のチューブを1分間攪拌し、攪拌の間に氷の上に30 sのインキュベーションを行い、細胞をリーゼする。あるいは、細胞は3つの1分周期のためのミニビーズビーターを使用して、lysedすることができる。25~30 μLの全細胞ライセートを別のチューブに保存して、シンチレーションカウントを行います。 注:保存されたリセートは、TLCプレートにロードされる各サンプルの量に影響を与えるパルス期間中に各サンプルによって取り込まれる放射性同位元素の相対的な量を決定するために使用されます。これについては、ステップ 3.2 でさらに説明します。</li>
	<li>2 mL マイクロ遠心分離チューブの内容物を 15 mL ガラス遠心管に注ぎます[チューブA]。2 mL マイクロ遠心分離チューブを、1 mLのメタノールとボルテックスを 10~15 s に加えて洗浄します。1 mLメタノール洗浄をチューブAに移し、2 mLのクロロホルムをチューブAに加え、400 μLの水を加え、最終サンプル量4.45mLを得ます。</li>
	<li>1分間の渦サンプルの後に1,000 x gで5分の遠心が続 く.遠心分離後、水相(上側)と有機(下)相は、界面に横たわる細胞デブリと視覚的に明確に分離する必要があります。</li>
	<li>ガラスパスツールピペットを使用して、チューブAから有機相を収集し、新しい15 mLガラス遠心管(チューブB)に移動します。チューブBに1M KClの1 mLを加えます。チューブAに、メタノール1mLとクロロホルム2mL、及び200μLミリQ水を加える。チューブAで渦と遠心のステップを繰り返します。</li>
	<li>チューブAから有機相を回収し、チューブBに加え、適切な容器にチューブAを入れます。ボルテックスチューブBは1分間、1,000 x gで5分遠心分離が続 きます。</li>
	<li>上層水層をチューブBから取り出し、処分する。1 mLの新鮮な1 M KClをチューブBに加え、ボルテックス/遠心分離ステップを繰り返します。層が分離されたら、慎重にラベル付けされた4 mLガラスバイアルに底の有機層全体を収集します。 注:このステップでは、脂質抽出物は-80°Cで保存することができ、またはプロトコルは、脂質のTLC分離のために継続することができます。</li>
</ol>3. 薄層クロマトグラフィーによる放射性同位元素標識のNLの分離と定量化
<ol><li>脂質抽出物を-80°Cにした場合、氷上でのインキュベートを行い、その後ベンチトップに置いて室温にゆっくりと持ち込む。真空乾燥または不活性ガス(例えば、アルゴンまたは窒素)の穏やかな流れを使用して、脂質抽出物から溶媒を完全に蒸発させます。一方、オーブンを145°Cに予熱してTLCプレートを加熱します。</li>
	<li>サンプルを TLC プレートにロードする前に、細胞が取り込んだ放射性ラベルの相対量を決定します。ステップ2.2から6mLガラスシンチレーションバイアルに全細胞ライセートのピペット10 μL、6 mLのシンチレーション液を加え、バイアルをラックに入れます。1 分のカウント時間に設定された カウント 1 ラック オプションを使用して各サンプルの cpm または dpm を測定するには、シンチレーション カウンターを使用します。各サンプルの平均を得るために、各細胞全体のライセートを重複して測定します。野生の種類または参照サンプルに応じて負荷量を調整する 注: TLC プレートにロードする各サンプルの量は、(平均サンプル数)/(平均参照カウント) x 所望の荷重量の式を使用して決定できます。例えば、参照サンプルの20 μLをTLCプレートに積み込み、平均カウントが1,000の場合、平均カウント2,000の実験サンプルはTLCプレートに10 μLをロードします。</li>
	<li>サンプル脂質を1:1(v/v%)クロロホルム:メタノールの40~50 μLで5分間ボルテックスして再構成します。ガラスの段階的なシリンダーで移動相溶媒の101 mLを調製します(主要なNL種分離の例については 、代表結果 セクションを参照してください(50:40:10:10:1)ヘキサン:石油エーテル:ジエチルエーテル:酢酸溶媒。</li>
	<li>20 x 20 TLC 飽和パッドと密閉蓋を含むガラスTLCチャンバーに溶剤を注ぎます。鉛筆を使用してプレートの底面から1.5cm上に線をそっとマーキングして、チャネリングされた20 x 20シリカゲル60Gプレートを準備します。ラインは、脂質がロードされる原点と場所を指定します。ラインの下で、各レーンにロードされるサンプルに優しくラベルを付けます。TLCプレートを準備したら、145°Cのオーブンでプレートを少なくとも30分間インキュベートし、プレートを予熱し、余分な水分を取り除きます。</li>
	<li>プレートが十分に加熱されたら、TLC飽和パッドを溶媒で飽和させ、オーブンからTLCプレートを取り出し、すぐにTLCプレートをロードします。暖かいうちにプレートを積み込むことで、迅速な溶剤蒸発が保証されます。対象となる各脂質種について、精製された脂質標準の5~20 μgをTLCプレートのレーンに負荷し、分離と予想される移動距離を追跡します。ピペットを使用して、TLCプレートの底部の1.5cm上にある各レーンの原点にサンプルの5μLをスポットします。20~40 μLのサンプルが各レーンに積み込まれるまで、5 μL スポットの繰り返しローディングを行います。 注:5-20 μgの非標識精製脂質を、TLCの脂質分離後に染色し可視化できるトレーサーとして各サンプルレーンに添加することができます。染色された標準の存在は、その後のシンチレーションカウントのための放射標識脂質バンドの容易な追跡および切除を可能にする。どの精製された標準がプレートにロードされるかは、関心のあるNL種によって決定されます。オレイン酸(FFA)、1,2ジオレオロイルグリセロール(DG)、トリオレイン(TG)、コレステロール(Chol)、コレステリルリノオレ酸(SE)、およびスクアレンをサンプルレーンに隣接するレーンで分離する例については、 代表結果セクションを参照してください。</li>
	<li>標準サンプルと実験サンプルがロードされたら、現像室にプレートを置き、溶剤がプレートの上部(40〜60分)に達するまで待ちます。プレートが完全に開発されたら、チャンバーから取り出し、フュームフードで20分間乾燥させます。</li>
	<li>プレートを乾燥させた後、プラスチックフィルムで覆い、自動ラジオグラフィースクリーン付きの現像カセットに入れます。プレートが24-48時間の画面で発達するようにします。</li>
</ol>4. TLC分離脂質の可視化と定量化
<ol><li>現像カセットからスクリーンを取り外し、蛍光体のイメージャーの内部に置きます。[蛍光体イメージング]オプションを選択し、800-1000 Vで開発します。 注: 蛍光体イメージング は、TLCプレート上の放射状脂質の質的なビューを提供します。しかしながら、放射性標識脂質の定量は、後述するシンチレーションカウントによって最もよく達成される。</li>
	<li>p-アニアルデヒド試薬を100 mL混合し( 補足ファイルを参照)、ガラススプレーボトルに付着します。TLCプレートにp-アニアルデヒド試薬をスプレーして、シリカを飽和させます。145°Cのオーブンでプレートを5分間、またはバンドが現れるまで焼きます。</li>
	<li>放射性シンチレーションカウントを使用して個々の脂質種を定量化するには、カミソリの刃を使用してガラスTLCプレートからシリカゲルを削ります。単一の放射性標識脂質種に対応する各シリカゲルバンドをガラスシンチレーションバイアルに移し、6 mLのシンチレーション液を加える。シリカバンドが小片に縮小されるまで激しく渦を流す。<ol>
<li>あるいは、脂質は、セクション3の脂質抽出プロトコルを用いてシリカゲルバンドから抽出することができる。シリカゲルから脂質を抽出する場合は、ステップ3.1のように溶媒を完全に蒸発させ、乾燥した脂質に6mLのシンチレーション液を加える。シンチレーションバイアルを含むラックをシンチレーションカウンターに入れます。 [単一ラックをカウント ] オプションを選択し、カウント時間をバイアルあたり 2 分に調整します。シンチレーションカウンターからの結果は印刷され、棒グラフとして視覚化することができる。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者らは、この原稿の作成に競合する利益はないと宣言している。

ここでは、酵母におけるNL種の合成を定量的に監視する多目的な放射標識プロトコルが提示される。このプロトコルは非常にモジュラーで、3-6日以内に手続きを終わらせることができます。さらに、脂質種と代謝産物を分離するためのTLCの使用に関する豊富な文献が存在し、これはユーザーがTLC溶媒系16,19の単純な変化で関心のあるいくつかの脂質種を検出することを可能にするべきである。このプロトコルは、放射性標識脂質の分離、検出、および定量化を助長します。また、ラベル付けされたNLのターンオーバー時間を検出するために、非ラベル付きメディアの追跡期間と組み合わすことができます。
HPLC、GC-MS、UPLC-MS などの他の方法では、脂質の分離と定量の分解能が高くなります。しかし、安定同位体を使用することで克服できますが、通常はMSを介して放射性標識されたサンプルを実行することは最適ではありません。それにもかかわらず、この放射性標識法は、多くの脂質種に高い検出感度と汎用性を提供しま...

アセチルCoAは、膜を構築し、ATPを生成し、細胞シグナル伝達を調節するための汎用性の高い生体分子通貨として機能する中性脂質(NLs)を含む多様な生体分子の基本的なビルディングブロックである1,2。これらのそれぞれの経路のいずれかにシャントされるLSの可用性は、部分的には、その貯蔵によって調節される。脂質滴(LD)は、トリグリセリド(TG)およびステロールエステル(SE)の疎水性コアからなる細胞質小器官であり、ほとんどの細胞のヌルの主な貯蔵室である。したがって、DLは、分解し、その後生化学的および代謝プロセス3、4に利用することができるDLを隔離し、調節する。NLおよびLD関連タンパク質の誤調節は、リポジストロフィーおよびメタボリックシンドローム5,6を含む病理の発症と相関することが知られている。このため、現在のLD研究は、NL合成が空間的、時間的、および多細胞生物の異なる組織にわたってどのように調節されているかに重点を置いて行われています。NLsのユビキタスな細胞の役割のために、DLの合成と調節を担当する多くの酵素は真核生物全体で保存される7.実際、一部の原核生物でさえ、DL 8にDLを保管しています。したがって、サッカロミセス・セレビシエ(出芽酵母)などの遺伝的に難解なモデル生物は、NLの合成および調節の研究に有用であった。
細胞抽出物からのNLの分離と定量は、ガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、超高性能液体クロマトグラフィー質量分析(UPLC-MS)9、10、11など、無数の方法で達成できます。おそらく、最も簡単な方法は、薄層クロマトグラフィー(TLC)を介して、標準曲線12、13からのその後の密度定量を可能にする。TLC は、NLs のコース粒度の分離のみを提供しますが、コストが安価で、複数のサンプルから同時に NL を迅速に分離できるため、強力な手法です。TLCを介してのNLの研究が直面している最もかなりの課題の2つは、1)NL種とその中間体の細胞豊富の広い範囲、および2)NL合成経路内の脂質中間体の親水性/疎水性の範囲である。その結果、TLCを介したNL種の定量は、典型的には最も豊富な種に限定される。しかし、14C-酢酸放射標識の導入は、NL経路内の低存在性中間体の検出を有意に高めることができる。酢酸はアセチルCoA合成酵素ACS214によってアセチルCoAに急速に変換され、これは14C-酢酸を酵母15において適切な放射性標識基質にする。さらに、疎水性のNLsとNの親水性中間体の両方の分離は、複数の溶媒システム16を使用することにより、TLCによって達成することができる。ここでは、酵母における14のC-酢酸代謝標識を用いたNLsの分離方法を提示する。パルス期間中に標識された脂質は、その後、十分に確立された全脂質単離プロトコル17によって単離され、続いてTLCによるNL種の分離が続く。標識脂質を可視化するオートラジオグラフィーと、全脂質を可視化する化学スプレーの両方によるTLCプレートの開発は、複数の定量方法を可能にする。個々の脂質バンドはまた、カミソリの刃を使用してTLCプレートから容易に抽出することができ、およびシンチレーションカウントは、バンド内の放射性標識材料の量を定量するために使用することができる。

<table><tbody><tr><td>[1-C14] 酢酸ナトリウム塩比活性: 45-60mCi</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC084H001MC</td><td></td></tr><tr><td>18:1 1,2 ジオレオイル-sn-グリセロール</td><td>Avanti</td><td>800811O</td><td></td></tr><tr><td>200 プルーフ 無水エタノール</td><td>シグマ</td><td>459836</td><td></td></tr><tr><td>酸洗浄ガラスビーズ 425-600um</td><td>シグマ</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>パスチュアーピペット用琥珀色の電球</td> フィ<td>ッシャー</td><td>03-448-24</td><td></td></tr><tr><td>硫酸アンモニウム >99%</td> <td>シグマ</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>ベックマン LS6500 シンチレーションカウンター</td><td>パーキンエルマー</td><td>A481000</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム (HPLC グレード)</td> <td>フィッシャー</td><td>C607SK</td><td></td></tr><tr><td>コレステロール >99%</td> <td>シグマ</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>コレステリノール酸 >98%</td> <td>シグマ</td><td>C0289</td><td></td></tr><tr><td>濃硫酸</td><td>シグマ</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>コーニング 50mL コニカルチューブ、ポリプロピレン、セントラスターキャップ付き</td><td>シグマ</td><td>CLS430829</td><td></td></tr><tr><td>デキストロース、無水グレード</td><td>シグマ</td><td>D9434</td><td></td></tr><tr><td>ジエチルエーテル無水グレード</td><td>シグマ</td><td>296082</td><td></td></tr><tr><td>乾燥オーブン</td><td>フィッシャー</td><td>11-475-155</td><td></td></tr><tr><td>エコルームシンチレーション液</td><td>VWR</td><td>IC88247001</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ 5424R 遠心分離機</td><td>フィッシャー</td><td>05-401-205</td><td></td></tr><tr><td>GE 貯蔵蛍光体スクリーン</td><td>シグマ</td><td>GE28-9564-75</td><td></td></tr><tr><td>GE タイフーン FLA9500 イメージャー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氷酢酸、ACS グレード</td><td>シグマ</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>ガラス 6mL シンチレーションバイアル</td><td>シグマ</td><td>M1901</td><td></td></tr><tr><td>ガラス遠心分離管キャップ</td><td>フィッシャー</td><td>14-595-36A</td><td></td></tr><tr><td>ガラス遠心分離管</td><td>フィッシャー</td><td>14-595-35A</td><td></td></tr><tr><td>ガラス パスツールピペット</td><td>フィッシャー</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>ヘキサン、無水グレード</td><td>シグマ</td><td>296090</td><td></td></tr><tr><td>L-アデニン >99%</td><td>シグマ</td><td>A8626</td><td></td></tr><tr><td>L-アラニン >98%</td><td>シグマ</td><td>A7627</td><td></td></tr><tr><td>L-アルギニン >99%</td><td>シグマ</td><td>A1270000</td><td></td></tr><tr><td>L-アスパラギン >98%)</td> <td>シグマ</td><td>A0884</td><td></td></tr><tr><td>L-アスパラギン酸 >98%)</td> <td>シグマ</td><td>A9256</td><td></td></tr><tr><td>L-システイン >97%</td><td>シグマ</td><td>W326305</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン一ナトリウム塩一水和物 >98%)</td> <td>シグマ</td><td>49621</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン >99%</td><td>シグマ</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>L-グリシン >99%)</td> <td>シグマ</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>L-ヒスチジン >99%)</td> <td>シグマ</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>L-イソロイシン >98%</td> <td>シグマ</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>L-ロイシン >98%)</td> <td>シグマ</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>L-リジン >98%</td> <td>シグマ</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>L-メチオニン、HPLC グレード</td> シ<td>グマ</td><td>M9625</td><td></td></tr><tr><td>L-フェニルアラニン、試薬グレード</td><td>Sigma</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>L-プロリン >99%</td><td>Sigma</td><td>P0380</td><td></td></tr><tr><td>L-セリン >99%</td><td>Sigma</td><td>S4500</td><td></td></tr><tr><td>L-セロニン、試薬グレード</td><td></td><td>Sigma T8625</td><td></td></tr><tr><td>L-トリプトファン >98%</td><td>Sigma</td><td>T0254</td><td></td></tr><tr><td>L-チロシン >98%)</td><td></td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>L-ウラシル >99%</td> <td>シグマ</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>L-バリン >98%</td> <td>シグマ</td><td>V0500</td><td></td></tr><tr><td>メタノール、ACS グレード</td><td>フィッシャー</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>オレイン酸 >99%</td> <td>シグマ</td><td>O1008</td><td></td></tr><tr><td>p-アニスアルデヒド</td><td>シグマ</td><td>A88107</td><td></td></tr><tr><td>石油エーテル、ACS グレード</td><td>シグマ</td><td>184519</td><td></td></tr><tr><td>ホスファチジルコリン、ジパルミトイル>99%</td><td>シグマ</td><td>P1652</td><td></td></tr><tr><td>ピペットエ</td><td>ッペンドルフ</td><td>2231000713</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム、ACSグレード</td><td>シグマ</td><td>P3911水</td><td></td></tr><tr><td>酸化ナトリウムペレット、認定ACS</td><td>フィ</td><td>ッシャーS318-100</td><td></td></tr><tr><td>スクワレン>98%</td><td>シグマ</td><td>S3626</td><td></td></tr><tr><td>コハク酸結晶性/認定</td><td>フィ</td><td>ッシャー110-15-6TLC</td><td></td></tr><tr><td>飽和パッド</td><td>シグマ</td><td>Z265225</td><td></td></tr><tr><td>TLCシリカゲル60Gガラスチャネリングプレート</td><td>フィッシャー</td><td>NC9825743</td><td>蛍光インジケーターなし</td></tr><tr><td>透明プラスチックフィルム</td>ア<td>ポロ</td><td>829903</td><td></td></tr><tr><td>トリシン</td><td>シグマ</td><td>T0377</td><td></td></tr>トリ<tr><td>オレイン>99%</td><td>シグマ</td><td>T7140</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>フィッシャー02-215-414</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ワットマン露出カセット</td><td>シグマ</td><td>WHA29175523</td><td></td></tr><tr><td>硫酸アンモニウムとアミノ酸を含まない酵母窒素塩基シ</td><td>グマ</td><td>Y1251</td><td></td></tr></tbody></table>

代謝標識と薄層クロマトグラフィーによる サッカロミセス・セレビシエ における中性脂質合成の解析

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

中性脂質(ヌル)は、エネルギーおよび脂質恒常性において重要な役割を果たす疎水性、無用な生体分子のクラスです。NLsはアセチルCoAからデノボを合成し、主にトリグリセリド(TG)およびステロールエステル(SE)の形で真核生物に存在する。ネルの合成を担う酵素は 、サッカロミセス・セレビシエ (酵母)からヒトまで高度に保存されており、酵母はNL代謝酵素の機能と調節を解剖するのに有用なモデル生物となっています。アセチルCoAがNL種の多様なセットに変換される方法については多くのことが知られていますが、NL代謝酵素を調節するメカニズム、および誤調節が細胞病理にどのように寄与できるかはまだ発見されています。NL種の分離と特性評価のための数多くの方法が開発され、研究の数十年にわたって使用されています。しかし、主要なNL種の包括的な特性評価のための定量的かつ単純なプロトコルは議論されていない。ここでは、酵母における主要なNL種のデノボ合成を定量化する簡便かつ適応可能な方法が提示される。薄層クロマトグラフィーと組み合わせた 14のC-酢酸代謝標識を適用して、生理学的に重要なNLの多様な範囲を分離し定量化します。

このプロトコルでは、14C-酢酸代謝標識によってNL種の標識、検出、定量化が可能であることを実証しました。主なNL種は、50:40:10:10:1(v/v/v/v)ヘキサン:石油エーテル:ジエチルエーテル:酢酸(図1A、B)の溶媒系で分離することができます。蛍光体イメージングは、標識遊離脂肪酸(FFA)、トリアシルグリセロール(TG)、ジアシルグリセロール(DG)、コレステロール(Chol)、およびスクアレン(SQ)の可視化を可能にする(図1A)。この溶媒では他のNL種から分離できるが、20分間のパルスに続くオートラジオグラムでは何も検出されない。これは、酵母の成長の静止段階の間にSE合成を遅くすることに起因する可能性があります。また、この方法で精製脂質種を分離し、続いてTLCプレートをp-アニアルデヒド試薬で散布して可視化できることも実証されている(図1B)。NL種はこの溶媒で十分に分離されているが、ホ...

ここでは 、14C-酢酸を用いた酵母の代謝標識に関するプロトコルが提示され、これは中性脂質の分離のための薄層クロマトグラフィーと結合される。

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

この技術は、ほとんどの実験室環境で一般的に見られる機器を使用し、同時にいくつかのサンプルの分析を可能にします。この方法は、脂質代謝酵素が細胞の文脈および異なる遺伝的背景でどのように調節されるかについての重要な洞察を提供することができる。酵母培養プレートからコロニーを2%デキストロースを含むSC培地20ミリリットルに接種し、200rpmで一晩振ると摂氏30度でインキュベートする。翌日、培養液を50ミリリットルの新鮮な培地で0.2の最終ODに希釈し、定常相に達するまで24時間培養します。各サンプルに対して20ミリリットルのクエンチンジバッファーを2つ用意し、マイナス80°Cで保存します。同時に、1ミリリットル当たり10マイクロキュリーの最終濃度でデキストロースフリーSC培地に酢酸ナトリウム塩を添加して放射性標識媒体を調製する。4,100xgで10分間遠心分離して細胞を回収する。上清を取り除き、20ミリリットルのデキストロースフリーSC培地で細胞ペレットを1回洗います。5分間4,100xgで遠心分離機を行い、デキストロスフリー培地を用いて標識された2ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移して細胞を回収します。さらに2分間細胞を遠心分離します。デキストロースフリーSC培地の500マイクロリットルで細胞を再懸濁し、各細胞懸濁液に500マイクロリットルの放射性標識媒体を素早く添加して、放射標識期間を開始する。回転インキュベーターでチューブを摂氏30度で20分間インキュベートします。一方、50ミリリットルの円錐管をマイナス10°Cに装備した遠心分離機を予め冷却し、焼入れバッファーの1つの20ミリリットルのアリコートを解凍します。放射標識期間が終了したら、ピペットを使用して、1ミリリットルのサンプル全体を氷上の解凍された消光バッファーに突っ込みます。5,000 x g で冷却した遠心分離機を 3 分間回転させて細胞ペレットを回収し、20 ミリリットルの新鮮な冷急冷バッファーを加えます。渦を振ってサンプルを振って完全に焼入れバッファーに再懸濁し、再び遠心分離して細胞を収集します。細胞がペレット化されたら、上清を注ぎ出し、ピペットで余分なものを取り除くことによって、サンプルからすべての焼入れバッファーを完全に除去します。さらに処理するためにマイナス80°Cでチューブを保管してください。各サンプルの酸洗浄ガラスビーズの0.3グラムの重量を量り、氷の上の2ミリリットルマイクロ遠心チューブに保管してください。マイナス80度冷凍庫から細胞ペレットを取り出し、氷の上に置きます。次に、各サンプルに350マイクロリットルのメタノールと700マイクロリットルのクロロホルムを加え、細胞を再懸濁します。あらかじめ計量したガラスビーズを含むマイクロ遠心チューブに移します。1分間3回、攪拌の間の氷の上に30秒のインキュベーションを行い、細胞を1分間3回渦液化する。細胞を15ミリリットルのガラス遠心分離管に注ぎ、チューブA.マイクロ遠心チューブを1ミリリットルのメタノールで洗い、ボルテックスし、メタノールをチューブAに注ぎ、400マイクロリットルのクロロホルムを加え、その後400マイクロリットルの水をチューブAに加え、最終サンプル量4.45ミリリットルの最終サンプル量をチューブAにします。1分間の渦のサンプルの後に1000 x gで5分間の遠心分離を行い、界面に横たわる細胞デブリで水相と有機相を明確に分離します。ガラスの牧草地のピペットを使用して、有機相をBとラベル付けした新しいガラス遠心分離管に集め、塩化モルカリウム1ミリリットルを加えます。1ミリリットルのメタノールと2ミリリットルのクロロホルムをチューブAに加え、ボルテックスと遠心分離のステップを繰り返します。ボルテックスと遠心管Bは、水相と有機相を分離する。上層水層を取り除き、底の有機層全体を4ミリリットルのガラスバイアルに集めます。不活性ガスで乾燥することにより脂質抽出物から溶媒を完全に蒸発させ、オーブンを145°Cに予熱してTLCプレートを加熱します。TLCプレートにロードする前に、細胞によって取り込まれた放射ラベルの相対的な量を決定します。クロロホルムとメタノールの40~50マイクロリットルでサンプル脂質を再構成し、5分間ボルテックスで1対1の比率で混合した。ガラスの段階的なシリンダーで移動相溶媒の101ミリリットルを調製します。次に、20%20 TLC飽和パッドとタイトな蓋を含むガラスTLCチャンバーに溶剤を注ぎます。20×20シリカゲル60Gプレートをチャネリングし、鉛筆を使用してプレートの底面の1.5センチメートル上のラインをマークします。プレートが十分に加熱され、TLC飽和パッドが溶剤で飽和したら、オーブンからTLCプレートを取り出し、すぐにそれをロードするに進みます。ピペットを使用して、TLCプレートの底面から1.5センチメートル上に位置する各レーンの原点に5マイクロリットルのサンプルをスポットし、サンプルの20〜40マイクロリットルまで繰り返し負荷が各レーンにロードされています。標準とサンプルがロードされたら、現像室にプレートを置き、溶剤がプレートの上部に到達するまで待ちます。プレートが完全に開発されたら、チャンバーから取り出し、フュームフードで20分間乾燥させます。プレートを乾燥させた後、プラスチックフィルムで覆い、自動ラジオグラフィースクリーン付きの現像カセットに入れます。現像カセットからスクリーンを取り出し、それを蛍光体イメージャーの中に置きます。TLCプレートにp-アニアルデヒド試薬をスプレーし、シリカが飽和するまで145度のオーブンで5分間、またはバンドが現れるまで焼きます。脂質種を定量するには、個々の脂質種を含むシリカゲルを削り取り、それらをガラスシンチレーションバイアルに移します。シリカバンドが小片に減るまで、6ミリリットルのシンチレーション液と渦を激しく加えます。シンチレーションバイアルを備えたラックをシンチレーションカウンターに置き、カウント時間をバイアルあたり2分に調整してカウントします。蛍光体イメージングは、ラベルフリー脂肪酸、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、コレステロール、スクワランのオートラジオグラムの可視化を可能にします。この方法では精製脂質種を分離し、続いてP-アニアルデヒド試薬をTLCプレートにスプレーして可視化できることが実証された。可視化された種は、滅菌エステルに加えて、これまでに述べたすべての脂質を含む。パルスに続くラジオラベルフリーメディアに10分間の追跡期間を適用することにより、スクワランの主要プールで観察され、総コレステロールが上昇した。同様に、チェイス期間におけるジアシルグリセロールの出現は、遊離脂肪酸シグナルの減少と相関していた。完全なプロトコルを実行する前に、細胞が目的の成長条件および遺伝的背景において酢酸放射性標識を取り込むかどうかを決定することが重要である。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

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学ぶ ¹⁴C酢酸代謝標識と薄層クロマトグラフィーによるSaccharomyces cerevisiaeの中性脂質合成解析法。遺伝的背景を問わず脂質代謝酵素の調節機構を定量的に評価できます。

代謝標識と薄層クロマトグラフィーによるサッカロミセス・セレビシエにおける中性脂質合成の解析

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