Name: プレフォームマイクロバブルからの膜濾過相シフトデカフルオロブタンナノ液滴の製造 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: 学ぶ、デカフルオロブタンを用いた脂質安定化相シフトナノ液滴の均一製造法。超音波処理、冷却凝縮、200ナノメートル膜濾過により単分散性を向上させ、生体医工学イメージングと薬物送達に応用可能です。

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気化可能な位相シフトナノドロップレットのTRSP分析を提供してくれたケン・ホイト博士の研究室のドミニク・ジェームズに感謝したいと思います。

1. 脂質フィルムの作成
<ol><li>以下の方向を使用して正しい比率で脂質を混合することにより、90%DSPCおよび10%DSPE-PEG2Kを使用してマイクロバブル生成用の脂質膜を調製する:<ol>
<li>クロロホルムでDSPCとDSPE-PEG2Kのストック脂質を作ります.各脂質粉末の50mgを別々のバイアルで秤量する。1 mL ガラスシリンジを使用して、各バイアルにクロロホルム 1 mL を加えます。</li>
		<li>ガラスシリンジを使用して20 mLシンチレーションバイアルにDSPCストック287 μLとDSPE-PEG2Kストック113 μL(両方とも50 mg/mL)を加えます。</li>
		<li>混合脂質を乾燥させて、窒素を用いてクロロホルムを除去する。ハウス窒素に接続されたチューブの適切な長さを使用して、混合しながらバイアルのヘッドスペース上に窒素ガスを軽く流します。クロロホルムが見られないまで続け、残りの脂質膜が白色に変わり始める。ポリプロピレンスクリューキャップを使用し、ヘッドスペースに窒素を導入しながらサンプルをカバーします。</li>
		<li>真空デシケータを使用して一晩真空下にバイアルを置き、残留クロロホルムを除去します。薄い半透明のフィルムは、バイアルの底をコーティングしたままになります。</li>
		<li>必要になるまで-20°Cでバイアルを保管してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>脂質膜からのマイクロバブルの発生
<ol><li>マイクロバブルを作るために、20%v/vプロピレングリコールを含む1xリン酸緩衝塩水(PBS)の10 mLと20%v/vグリセロール(最終pH 7.2-7.4)を乾燥した脂質フィルムに加えます。</li>
	<li>サンプルと温かいサンプルを65°Cに再キャップし、加熱ブロック(または温水バス)で30分間加熱します。</li>
	<li>試料が温まる間、浴温を65°Cに上げることで浴用超音波処理器を準備する。 注:このプロセスは、水がバス超音波処理器に入れる前に電子レンジまたはホットプレートで予熱されている場合は、より高速です。</li>
	<li>温めたサンプルを含むシンチレーションバイアルを浴用超音波処理器に入れ、脂質溶液を含むバイアルの部分のみが水浴中に沈むようにする。</li>
	<li>最低15分間、暖かい脂質溶液を超音波処理します。水温が65°Cのままであることを確認してください。 溶液が完全に明確になるまで、10〜15分の間隔で超音波処理を続けます(図2)。 注:バスソニエーターが利用できない場合、解決策は、クリアするまで10%の電力で超音波処理することができます。しかし、マイクロチップはより速く摩耗し、交換する方が高価です。</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62203/62203fig02.jpg"> 図2:水和脂質フィルムの例 水和脂質フィルム(A)前及び(B)浴超音波処理後の例は、ユニラメラ小胞を形成する。浴超音波処理に続いて、脂質溶液はより不透明から半透明の溶液に移行する必要があります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62203/62203fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<ol start="6"><li>まだ暖かい間に、キャップを取り外し、超音波装置のマイクロチップアタッチメントが空気/液体インターフェイスのすぐ下に沈むように、バイアルを超音波処理器の防音エンクロージャにクランプします(図3)。</li>
	<li>超音波装置の防音エンクロージャの隣にデカフルオロブタンのタンクを置きます。</li>
	<li>氷浴を準備し、防音エンクロージャの隣に置きます。これは、ステップ 2.14 の後半で使用されます。</li>
	<li>超音波処理器の電源スイッチをオンにします。</li>
	<li>システムの起動後、電力レベルを 70% に設定します。マイクロチップアタッチメントで70%の振幅を超えないようにしてください。この時点でソニッカレーターを起動しないでください。</li>
	<li>DFBタンク出口からエンクロージャに保持されている暖かい脂質溶液にガスを導くために、チューブの適切な長さを取り付けます。チューブは、超音波処理中にヘッドスペースにガスが流れ込むように、バイアルの首にちょうど置く必要があります(図3)。</li>
	<li>ガスが脂質溶液の上を流れるのが見えるまで、タンクバルブをゆっくりと開きます。これは、液体の表面にわずかな波紋を引き起こすでしょう。ガスの流れが高すぎると、マイクロバブル製剤中に溶液が溢れます。</li>
	<li>超音波処理器を起動し、マイクロバブルを生成するために連続して10 sのために実行します。バブル溶液が超音波処理中にオーバーフローし始めた場合は、すぐに超音波処理を停止します。</li>
	<li>超音波処理器をオフにし、すぐにDFBタンクバルブを閉じます。</li>
	<li>マイクロバブル溶液を素早くキャップし、氷浴にバイアルを浸し、サンプルを55°C以下に冷却する(DSPCのガラス転移温度)</li>
	<li>必要になるまで氷浴にマイクロバブルサンプルを残します。</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62203/62203fig03.jpg"> 図3:マイクロバブル形成を最適化するための脂質溶液へのプローブ先端の配置 プローブの先端がガラスに触れないように注意してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62203/62203fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
3. マイクロバブル凝縮のための押出機の準備
<ol><li>200 nmのセラミックフィルター(メーカーから供給)を使用して、ユーザーズマニュアルに詳述されているように高圧押出機を組み立てます。</li>
	<li>押出機を水密容器の中央に置き、サンプル出口管が側面に押し付けたり圧着したりしないようにします。</li>
	<li>メーカーから供給されたアダプターを使用して、押出機を窒素ガスタンクに結合します。</li>
	<li>400mLの水と10gの塩化ナトリウムを使用して、押出機の周りの水密容器に-2°Cの塩漬け氷浴を作ります。</li>
	<li>押し出されたサンプルを集めるために、シンチレーションバイアルに出口管の端部を置きます。 注:チューブが平らに置かれていない場合やバイアル内に留まらない場合は、テープで容器にチューブを固定します。</li>
</ol>マイクロバブル凝縮のための押出機のプライミング
<ol><li>押出機内に圧力がないことを確認するために、リリースバルブを開閉します。</li>
	<li>チャンバー蓋を取り外し、1x PBSの5mLを押出機室に加えます。</li>
	<li>蓋を取り替え、しっかりとクリックして元の場所に戻します。</li>
	<li>圧力計が250 psiを読み取るように窒素ガスタンクを開きます。圧力制御バルブが閉じた位置に位置していることを確認します。</li>
	<li>ガスタンクを閉じ、押出機室の入口バルブを開きます。PBS溶液は、システムを介して、シンチレーションバイアルにサンプル出口チューブを押し出されます。</li>
	<li>ガスだけがチューブから出るとき、解放弁を開き、圧力が0 psiに落ちるようにしなさい。</li>
	<li>シンチレーションバイアルを取り外します。</li>
</ol>5. 押出し用のマイクロバブルを冷却する前
<ol><li>押出機内に圧力がないことを確認するために、リリースバルブを開閉します。出口管の端に新しいシンチレーションバイアルを置く。</li>
	<li>鋼容器に2-メチルブタンを充填し、ドライアイスを加え、温度を-18 °Cまで下げる。</li>
	<li>冷却された2-メチルブタンにマイクロバブル溶液を挿入し、サンプルを2分間水没させます。2分を通してシンチレーションバイアルを動かして、気泡を軽く混ぜます。必要に応じてドライアイスを加え、-15~-18 °Cの間の温度を維持します。 -20°Cを超えないように注意するか、または賦形液が凍結し、気泡サンプルを破壊します。 注: ステップ 5.2 および 5.3 は、より長期間にわたって実験室の冷凍庫で泡サンプルを冷却することによっても行うことができます。ただし、冷凍庫の温度を注意深く監視し、サンプルを凍結しないように注意してください。</li>
	<li>2分後、冷やした2-メチルブタンからマイクロバブルを取り出し、バイアルを軽く振ってマイクロバブルを混ぜ、冷やした10 mLシリンジを使用して溶液を押出機に移します。</li>
	<li>押出機室の蓋を取り外し、シリンジのプランジャーをゆっくりと押してマイクロバブル溶液をチャンバーに加えます。押出機のキャップを交換して、確実に所定の位置に戻ってクリックします。</li>
	<li>押出機の圧力制御弁と解放弁が閉じた位置にあるか確認します。</li>
	<li>圧力計が250 psiを読み取るまで窒素ガスタンクを開き、ガスタンクを閉じて、圧力制御バルブを開いた位置に回します。</li>
	<li>溶液が出口管でシンチレーションバイアルを満たし、ガスだけがチューブを出るとき、圧力解放弁をゆっくりと開き、圧力が0 psiに落ちるようにする。</li>
	<li>シンチレーションバイアルを氷浴または冷蔵庫に入れて保管します。</li>
	<li>長期保存と自然気化を最小限に抑えるために、サンプルを標準の冷凍庫に保管してください。サンプルの凍結を避けるために温度が-20°C以上であることを確認してください(20%PPGと20%グリセロールの賦形液は、ほとんどの実験室の冷凍庫で凍結からサンプルを保ちます)。</li>
</ol>6. 遠心分離によるリポソームからの液滴の分離
<ol><li>押し出された液滴溶液の10mLを15mL遠心分離管に移す。</li>
	<li>押し出しサンプルを1,500xgで4°Cで10分間遠心する。 DFBナノ液滴から構成されるペレットは、チューブの底部に明らかになります(図4)。自然気化した液滴は溶液の上部に現れ、廃棄されるべきである。</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62203/62203fig04.jpg"> 図4:遠心分離後にペレット化された位相シフトDFB液滴の例。 DFBナノ液滴はリポソームよりも密度が高く、ペレット(赤いボックス)の遠心管の底に集まりるでしょう。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62203/62203fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<ol start="3"><li>上清を取り除き、20%グリセロールと20%プロピレングリコールで1x PBSの2 mLでペレットを再懸濁します。</li>
	<li>チューブを軽く混ぜて均質な溶液を得て、液滴を小さい2 mL遠心管に移します。</li>
	<li>サンプルを2 mL遠心分離管でさらに2回洗浄します。</li>
	<li>最後の洗浄後、20%グリセロールと20%プロピレングリコールで1x PBSの100 μLでペレットを再懸濁し、必要になるまで氷の上または冷凍庫に保管します。</li>
</ol>7. 液滴気化の顕微鏡検証
<ol start="1"><li>濃縮液滴2.5μlを1x PBSの7.5 μlに加えて希釈液溶液を作ります。</li>
	<li>希釈サンプル10 μlで顕微鏡スライドを準備します。40xの目的を使用して、サンプルを観察し、画像を保存します。</li>
	<li>顕微鏡からスライドを取り出し、65°Cのヒートプレートに1分間置き、ナノ液滴をマイクロバブルに気化させます。</li>
	<li>加熱後にサンプルを観察し、液滴気化を確認するために、同じ40x目的を使用してください。</li>
</ol>

<ol><li>Sirsi, S., Borden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbubble+compositions%2C+properties+and+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Bubble+Science+Engineering+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Microbubble compositions, properties and biomedical applications.</a> Bubble Science Engineering and Technology. 1 (1-2), 3-17 (2009).</li>
<li>Sheeran, P. S., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase-change+contrast+agents+for+imaging+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Phase-change contrast agents for imaging and therapy.</a> Current Pharmaceutical Design. 18 (15), 2152-2165 (2012).</li>
<li>Mountford, P. A., Smith, W. S., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorocarbon+nanodrops+as+acoustic+temperature+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%3A+The+ACS+Journal+of+Surfaces+and+Colloids%22%5BJournal%5D)">Fluorocarbon nanodrops as acoustic temperature probes.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (39), 10656-10663 (2015).</li>
<li>Mountford, P. A., Thomas, A. N., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+activation+of+superheated+lipid-coated+perfluorocarbon+drops%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%3A+The+ACS+Journal+of+Surfaces+and+Colloids%22%5BJournal%5D)">Thermal activation of superheated lipid-coated perfluorocarbon drops.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (16), 4627-4634 (2015).</li>
<li>Sheeran, P. S., Luois, S., Dayton, P. A., Matsunaga, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formulation+and+acoustic+studies+of+a+new+phase-shift+agent+for+diagnostic+and+therapeutic+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%3A+The+ACS+Journal+of+Surfaces+and+Colloids%22%5BJournal%5D)">Formulation and acoustic studies of a new phase-shift agent for diagnostic and therapeutic ultrasound.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 27 (17), 10412-10420 (2011).</li>
<li>Sheeran, P. S., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+performance+of+phase-change+perfluorocarbon+droplets+for+medical+ultrasonography%3A+current+progress%2C+challenges%2C+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Scientifica%22%5BJournal%5D)">Improving the performance of phase-change perfluorocarbon droplets for medical ultrasonography: current progress, challenges, and prospects.</a> Scientifica. 2014, 579684(2014).</li>
<li>Sheeran, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+generating+submicrometer+phase-shift+perfluorocarbon+droplets+for+applications+in+medical+ultrasonography%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Ultrasonics%2C+Ferroelectrics%2C+and+Frequency+Control%22%5BJournal%5D)">Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography.</a> IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2017).</li>
<li>Sheeran, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decafluorobutane+as+a+phase-change+contrast+agent+for+low-energy+extravascular+ultrasonic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Decafluorobutane as a phase-change contrast agent for low-energy extravascular ultrasonic imaging.</a> Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (9), 1518-1530 (2011).</li>
<li>de Gracia Lux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+for+the+formation+of+monodisperse+superheated+perfluorocarbon+nanodroplets+as+activatable+ultrasound+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Novel method for the formation of monodisperse superheated perfluorocarbon nanodroplets as activatable ultrasound contrast agents.</a> RSC Advances. 7 (77), 48561-48568 (2017).</li>
<li>Mountford, P. A., Sirsi, S. R., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Condensation+phase+diagrams+for+lipid-coated+perfluorobutane+microbubbles%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%3A+The+ACS+Journal+of+Surfaces+and+Colloids%22%5BJournal%5D)">Condensation phase diagrams for lipid-coated perfluorobutane microbubbles.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 30 (21), 6209-6218 (2014).</li>
<li>Feshitan, J. A., Chen, C. C., Kwan, J. J., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbubble+size+isolation+by+differential+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Microbubble size isolation by differential centrifugation.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).</li>
<li>Wu, S. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ultrasound-facilitated+brain+drug+delivery+using+optimized+nanodroplets%3A+vaporization+efficiency+dictates+large+molecular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Focused ultrasound-facilitated brain drug delivery using optimized nanodroplets: vaporization efficiency dictates large molecular delivery.</a> Physics in Medicine and Biology. 63 (3), 035002(2018).</li>
<li>Li, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+Nucleation+of+stable+perfluorocarbon+emulsions+for+ultrasound+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Spontaneous Nucleation of stable perfluorocarbon emulsions for ultrasound contrast agents.</a> Nano Letters. 19 (1), 173-181 (2019).</li>
<li>Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+ultrasonically-activatable+nanoparticles+using+low+boiling+point+perfluorocarbons%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons.</a> Biomaterials. 33 (11), 3262-3269 (2012).</li>
<li>Kawabata, K., Sugita, N., Yoshikawa, H., Azuma, T., Umemura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+with+multiple+perfluorocarbons+for+controllable+ultrasonically+induced+phase+shifting%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles with multiple perfluorocarbons for controllable ultrasonically induced phase shifting.</a> Japanese Journal of Applied Physics. 44 (6), 4548-4552 (2005).</li>
<li>Shakya, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaporizable+endoskeletal+droplets+via+tunable+interfacial+melting+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Vaporizable endoskeletal droplets via tunable interfacial melting transitions.</a> Science Advances. 6 (14), 7188(2020).</li>
<li>Kopechek, J. A., Zhang, P., Burgess, M. T., Porter, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+phase-shift+nanoemulsions+with+narrow+size+distributions+for+acoustic+droplet+vaporization+and+bubble-enhanced+ultrasound-mediated+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Synthesis of phase-shift nanoemulsions with narrow size distributions for acoustic droplet vaporization and bubble-enhanced ultrasound-mediated ablation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e4308(2012).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

インビボイメージングと治療のためのマイクロバブルと位相シフト液滴の処方、物理学、および潜在的な用途を議論する包括的な文献体が利用可能です。この議論は、脂質マイクロバブルを生成し、低沸点DFBガスと高圧押出を使用してサブミクロン位相シフト液滴に変換することに明示的に関連しています。ここで概説する方法は、従来のマイクロバブル凝縮法と液滴押出法を一回のステップで組み合わせることにより、大量の脂質マイクロバブルとDFB位相シフト液滴を生成する比較的簡単な方法を提供することを意味する。この方法は、フィルタ選択に基づいて狭いサイズ分布を有するDFB液滴を形成するために使用される高濃度の気泡を生成する利点を有する。狭いサイズの分布は結果的に一貫したサンプル気化のしきい値に起因する有意である。この方法は、狭いサイズの分布を生成するために使用される他の一般的な方法よりも簡単でコストが低くなります。さらに、ソリューションの潜在的な量は、他の同等の方法よりも大きいです。このプロトコルは、(1)脂質微小気泡の生成、(2)微小気泡の凝縮と押出、(3)遠心分離によるリポソームからの位相シフト液滴の分離の3つの主要なカテゴリに分けることができる。
<p cl...

超音波造影剤(UCA)は、画像および治療用途で急速に人気が高まっています。マイクロバブルは、元のUCAであり、現在臨床診断アプリケーションで使用される主流の薬剤です。マイクロバブルは、ガスで満たされた球体で、通常は直径1~10μmで、脂質、タンパク質、ポリマーシェル1で囲まれています。ただし、そのサイズと生体内での安定性は、多くのアプリケーションで機能を制限することができます。過熱した液体コアを含む位相シフトナノドロップレットは、サイズが小さく、循環寿命が改善されたため、これらの制限のいくつかを克服することができます。熱または音響エネルギーにさらされると、過熱した液体コアが気化して気体マイクロバブル2,3,4,5を形成します。気化閾値は液滴サイズ5,6に直接関係するため、一貫した活性化閾値を達成するために、一様なサイズの液滴懸濁液を処方することが非常に望ましいであろう。均一な液滴サイズを生成する配合方法は、しばしば複雑でコストがかかり、より費用対効果の高いアプローチは多分散溶液7をもたらす。もう一つの制限は、低沸点パーフルオロカーボン(PFC)ガスで安定な位相シフト液滴を生成する能力であり、これはvivo8での効率的な活性化に不可欠です。本稿では、生体内イメージングおよび治療用途のための安定したろ過低沸点気化可能な位相シフト液滴を生成するためのプロトコルが記載されている。
単分散サブミクロン位相シフト液滴7を製造する方法は多い。サイズを制御する最も堅牢な方法の1つは、マイクロ流体デバイスの使用です。これらのデバイスは、コストがかかり、液滴の生産速度が遅く(〜104-106液滴/s)7であり、広範なトレーニングが必要です。マイクロ流体デバイスは、一般に、システム7の自発的な気化や目詰まりを避けるために、高沸点ガスを必要とします。しかし、de Gracia Luxら.9の最近の研究では、マイクロフルダイザーを冷却して、低沸点デカフルオロブタン(DFB)またはオクターフルオロプロパン(OFP)を使用して高濃度のサブミクロン位相シフト(1010-1012/mL)を生成する方法を示しています。
一般に、DFBやOFPなどの低沸点ガスは、あらかじめ形成された気泡を使用して扱いやすくなっています。気化可能な液滴は、低温および上昇圧5,10を用いてガスを凝縮することにより、前駆体脂質安定化気泡から生成することができる。この方法を用いて生成される液滴の濃度は、前駆体マイクロバブル濃度と気泡から液滴への変換の効率に依存する。濃縮されたマイクロバブルは、1010 MB/mL11&gt;近づく先端超音波処理から報告されているが、別の研究では、凝縮されたOFPおよびDFP気泡12から〜1〜3 x1011液滴/mLに及ぶ液滴濃度が報告されている。単分散液滴が懸念されない場合、凝縮方法は、低沸点PFCを使用して脂質安定化位相シフト液滴を生成する最も簡単で最も低コストの方法です。しかし、単分散前駆体気泡の発生も困難であり、マイクロ流体や繰り返し微分遠心分離技術などのより高価なアプローチを必要とする11。DFBおよびOFBナノ液滴を産生するための別のアプローチは、最近、リポソーム13における液滴の自発的核形成を用いて発表された。この方法は、「Ouzo」効果を利用して、気泡を凝縮することなく低沸点PFC液滴を生成する簡単な方法である。PFC液滴のサイズ分布は、液滴の核形成を開始するために使用されるPFC、脂質、およびエタノール成分を繊細な滴定および混合することによって制御することができる。また、パーフルオロカーボンの混合は、ナノ液滴14,15の安定性および活性化閾値を制御するために使用できることも注目に値する。Shakyaらの最近の研究は、炭化水素内の高沸点PFCsを炭化水素内の高沸点PfFCを乳化して、液滴コア16内の異種核形成を容易にすることによってナノドロップレット活性化を調整する方法を示している。
いったん形成されると、位相シフト液滴を形成後に押し出して、より多くの単分散集団を作り出すことができる。実際、ここで説明する方法と同様のプロトコルは、高沸点ドデデオフルオルペンタン(DDFP)を液滴コアとして使用してKopechekら17 によって以前に公開されている。高沸点パーフルオロカーボン(室温で安定)を有する位相シフト液滴を使用しようとする読者は、代わりに上記の記事を参照する必要があります。DFBやOFPなどの低沸点ガスを含む液滴の発生と押出は、より複雑であり、あらかじめ形成された気泡を凝縮させることで最もアプローチが可能です。
このプロトコルでは、プローブ先端超音波処理を用いてDFBガスコアを用いて事前に形成された脂質微小気泡を生成する一般的な方法が記載されている。次に、市販の押出機を使用して、プレフォームされたマイクロバブルをサブミクロン位相シフトナノ液滴に凝縮します(図1)。得られた液滴は、熱と超音波によって活性化可能である。この方法は、高価なマイクロ流体デバイスを必要とせずに、より狭いサイズ分布を有する従来の凝縮法よりも大量のナノ液滴溶液を生成することができる。狭いサイズ分布を持つナノドロップレット溶液の製造は、より均一な気化閾値を生成する可能性が高い。これは、画像処理、アブレーション、薬物送達、塞栓術1、3、4、6などの多数のアプリケーションの可能性を最大限に引き出します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62203/62203fig01.jpg"> 図1:予知されたマイクロバブルを位相シフトナノ液滴に凝縮するための高圧押出セットアップの概略図。 マイクロバブル溶液は押出機室に添加され、収容され、250psiは、窒素タンクから、チャンバー入口弁を通して適用される。窒素ガスは、マイクロバブル溶液をチャンバの基部のフィルターを通して押し出し、サンプルをナノ液滴に凝縮させる。溶液は最終的にサンプル出口管を通して押出機から押し出され、収集される。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62203/62203fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>15 mL遠心分離チューブ</td><td>ファルコン</td><td>352095</td><td>液滴の収集と遠心分離</td></tr><tr><td>200 nmポリカーボネートフィルター</td><td>Whatman</td><td>110606</td><td>押出機フィルター</td></tr><tr><td>2-メチルブタン</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>03551-4</td><td>押出前のマイクロバブル溶液の急速予冷</td></tr><tr><td>3プロングクランプ X2</td><td>フィッシャー</td><td>02-217-002</td><td>シンチレーションバイアルを所定の位置に保持プローブチップの超音波処理用</td></tr><tr><td>400Wアナログプローブチップソニケーターとホー</td><td>ンブランソン</td><td>101-063-198R</td>脂質<td>溶液から脂質マイクロバブルを生成するために使用されます</td></tr><tr><td>バスソニケーター</td><td>フィッシャー科学</td><td>15337402</td><td>リポソームを単層小胞に分解するのを助けるために使用されます</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>C298-4</td><td>マイクロバブル調製</td></tr><tr><td>用の脂質フィルムを作るために使用されますデカフルオロブタン(パーフルオロブタン)ガス</td><td>FluoroMed L.P.</td><td>プローブ先端の超音波処理によるマイクロバブル発生</td><td>1kg</td></tr>ドライ<tr><td>アイス</td><td>-</td><td>押出</td><td>し前のマイクロバブル溶液の急速予冷</td></tr><tr><td>DSPC脂質粉末</td><td>NOF America</td><td>COATSOME MC-8080</td><td>脂質フィルムの成分</td></tr><tr><td>DSPE-PEG-2K 脂質粉末</td><td>NOF America</td><td>サンブライト DSPE-020CN</td><td>脂質フィルムの成分</td></tr><tr><td>一般温度計</td><td></td><td></td> <td>-氷浴温度と2-メチルブタン温度の測定に使用されます(-20°Cの温度に対応する必要があります)</td></tr><tr><td>ガラスシリンジ</td><td>ハミルトン</td><td>81139</td>クロ<td>ロホルム</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP229-1</td>の脂質を混合するために使用されます<td>PBS溶液の凍結温度を下げる</td></tr><tr><td>加熱ブロックVWR</td><td>サイエンティフィックプロダクツ</td><td></td><td>脂質フィルムと気化液</td></tr><tr><td>滴Lipex 10mL押出機</td><td>エボニック</td><td></td><td>商業高圧押出システム</td></tr><tr><td>ミニボルテックスミキサー</td>フィ<td>ッシャーブランド</td><td>14-955-151</td>脂質<td>フィルムから余分なクロロホルムを除去するために使用されます</td></tr><tr><td>窒素タンク</td><td>-</td><td></td><td>押出機</td></tr>の<tr><td>リン酸塩緩衝液</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td><td></td><td>ックハイドレート脂質フィルムと洗浄液滴</td></tr>ポリエステル<tr><td>ドレンディスク</td><td>を操作するために使用されますWhatman</td><td>230600</td><td>ポリカーボネートフィルターのサポートを提供</td></tr><tr><td>ポリプロピレンキャップ</td><td>フィッシャー科学</td><td>298417</td><td>溶液貯蔵に使用</td></tr><tr><td>プロピレングリコール</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>P355-1</td><td>PBS溶液の凍結温度を下げる</td></tr><tr><td>シンチレーションバイアル</td><td>DWKライフサイエンス ウィートン</td><td>986532</td><td>脂質フィルムやマイクロバブル生成に使用</td></tr><tr><td>小ハンマー</td><td>-</td><td>-</td><td>メチルブタン冷却のための乾燥氷を分解するために使用</td></tr><tr><td>Sonicator Microtipの付属品</td><td>ブランソン</td><td>101148070</td><td>脂質溶液からマイクロバブルを発生させるために使用される</td></tr><tr><td>鋼鉄容器</td><td>Medegen</td><td>79310</td><td>放出の前のマイクロバブル解決の急速な予冷(-20Cに評価される任意の容器が機能します)</td></tr><tr><td>真空Desicator</td><td>Bel-Art SP Scienceware</td><td>08-648-100</td><td>脂質フィルムから余分なクロロホルムを除去</td></tr><tr><td>2mL 遠心分離チューブ</td><td>フィッシャー</td><td>02682004</td><td>ナノ液滴の濃縮に使用 </td></tr></tbody></table>

プレフォームマイクロバブルからの膜濾過相シフトデカフルオロブタンナノ液滴の製造

Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles

画像処理および治療のための気化可能な位相シフト液滴の製造に使用できる多くの方法があります。各方法は、さまざまな技術を利用し、価格、材料、目的が異なります。これらの製造方法の多くは、不均一な活性化閾値を有する多分散集団をもたらす。さらに、液滴サイズを制御するには、通常、生体内で実用的ではない高い活性化閾値を有する安定したパーフルオロカーボン液体が必要です。低沸点ガスを用いて均一な液滴サイズを作製することは、インビボイメージングおよび治療実験に有益であろう。本稿では、低沸点デカフルオロブタン(DFB)を用いたサイズフィルター脂質安定化位相シフトナノ液滴の形成のための、簡便で経済的な方法について述べている。脂質マイクロバブルを生成する一般的な方法は、一回のステップで高圧押出でそれらを凝縮する新しい方法に加えて、記載されている。この方法は、多くの生物学的実験室で見られる一般的な実験装置を使用して、時間を節約し、効率を最大化し、マイクロバブルおよびナノドロップレットソリューションの大量を生成するように設計されています。

サイズ分布の代表的な結果は、動的光散乱(DLS)および調整可能な抵抗パルスセンシング(TRSP)分析を用いて含まれる。図5は、押出しの有無にかかわらず、凝縮された気泡溶液のサイズ分布を示しています。押し出しがない場合、プロトコルはステップ 5.3 で終了します。冷たい気泡は、冷たい間に大気圧にサンプルを通すことによって凝縮される。凝縮されたサンプルだけは400 nmの近くでずっと広い分布を有する。押出されたサンプルは、200nmに中心となるより狭い分布を有する。両方のサンプルには、DLSを使用して識別できないリポソームと液滴の両方が含まれます。図6は、過剰なリポソームを除去するために遠心分離によって洗浄された後の位相シフト液滴の代表的なサンプルを示す(ステップ6.7)。TRPSは、この分析のために、サイズ分布と液滴単独の濃度の両方を評価するために使用された。DLSと同様に、TRPSは200 nm付近の液滴サイズを示しています。濃度は、最終液滴溶液の100 μLすべてを1mLで再懸濁した後、mL当た...

このプロトコルは、プローブチップ超音波処理を使用して大量の脂質カプセル化デカフルオロブタンマイクロバブルを生成し、その後、高圧押出および機械的濾過を使用してフェーズシフトナノ液滴に凝縮する方法を記述する。

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different ...

このプロトコルは、生物医学の用途で使用するための低沸点気化可能な液滴の多分散性を低減する容易な方法である。この技術は、事前に形成された気体マイクロバブルを凝縮し、制御可能でスケーラブルで比較的費用対効果の高い方法で、得られた液体液滴をサイズ別にフィルタリングします。この方法は、異なるフィルターを使用して異なるシェルおよびガス材料を持つ様々な脂質マイクロバブルに適用して、最終的な液滴サイズを制御することができます。この手順を実証することは、Dr.Sirsiの研究室の学部研究者であるダラ・メリラットです。超音波装置の電源スイッチをオンにし、マイクロチップアタッチメントを使用して最大許容に振幅を設定し、超音波処理時間を10秒に設定します。温和化した脂質溶液を、表面のすぐ下にマイクロチップを付けたサウンドエンクロージャに入れます。DFBタンク出口からエンクロージャに保持されている暖かい脂質溶液にガスを導くために、バイアルの首にチューブの適切な長さを取り付けます。液体の表面にわずかな波紋を引き起こし、ガスが脂質溶液の上を流れるのが見えるまで、タンクバルブをゆっくりと開きます。ガスの流れが高すぎると、マイクロバブル形成時に溶液が溢れます。超音波処理器を起動し、マイクロバブルを生成するために連続して10秒間実行します。超音波処理が終わったら、すぐにDFBタンクバルブを閉じます。マイクロバブル溶液を素早くキャップし、バイアルを氷浴に沈め、サンプルを摂氏55度以下に冷却します。200ナノメートルのセラミックフィルターを使用して、ユーザーズマニュアルに従って高圧押出機を組み立て、水密容器の中央に置き、サンプル出口管が側面に押し付けられたり、圧着したりしないようにします。メーカーから供給されたアダプターを使用して、押出機を窒素ガスタンクに結合します。出口管の端部をシンチレーションバイアルに入れて押出されたサンプルを集め、チューブをテープで容器に固定してバイアル内に留まる。押出機内に圧力がないことを確認するために、リリースバルブを開閉します。チャンバーの蓋を取り外します。そして、押出機室にPBSの5ミリリットルを追加します。蓋を取り替え、しっかりとクリックして元の場所に戻します。窒素ガスタンクを開き、圧力計が250 PSIを読み取るようにして、圧力制御弁が閉じた位置に位置していることを確認します。ガスタンクを閉じ、押出機室の入口バルブを開き、PBS溶液をシステムに押し込み、サンプル出口チューブをシンチレーションバイアルに出します。ガスだけがチューブから出るとき、解放弁を開き、圧力がゼロPSIに落ちるようにしなさい。その後、シンチレーションバイアルを除去します。リリースバルブを開閉して押出機内に圧力がないことを確認し、出口管の端に新しいシンチレーションバイアルを配置します。鋼容器に2-メチルブタンを充填し、ドライアイスを加え、温度をマイナス18度まで下げます。冷却された2-メチルブタンにマイクロバブル溶液を挿入し、サンプルを2分間水没させます。2分間にわたってシンチレーションバイアルを動かして、気泡を軽く混ぜます。必要に応じてドライアイスを加え、マイナス15度からマイナス18度の温度を維持します。2分後、冷やした2-メチルブタンからマイクロバブルを取り出します。バイアルをそっと渦巻いてマイクロバブルを混ぜ、冷やした10ミリリットルのシリンジに泡を移します。押出機室の蓋を取り外し、シリンジのプランジャーをゆっくりと押してマイクロバブル溶液をチャンバーに加えます。押出機のキャップを交換し、しっかりとクリックします。押出機の圧力制御弁と解放弁が閉じた位置にあるか確認します。圧力計が250 PSIを読み取るまで窒素ガスタンクを開きます。ガスタンクを閉じ、圧力制御バルブを開いた位置に回します。溶液が出口管でシンチレーションバイアルを満たし、ガスだけがチューブを出るとき、圧力解放弁をゆっくりと開き、圧力がゼロPSIに落ちるようにする。押し出された液滴溶液の10ミリリットルを15ミリリットルの遠心分離管に移す。押し出されたサンプルを摂氏4度で10分間1,500倍Gで遠心する。溶液の上部に現れる上清と自然気化した液滴を捨てます。DFPナノドロップレットを含むペレットを20%グリセロールと20%プロピレングリコールを用いたPBSの10ミリリットルで再懸濁する。押出しの有無にかかわらず凝縮された気泡溶液のサイズ分布は、凝縮されたサンプルが400ナノメートル付近を中心としたはるかに広い分布を有するのに対し、押し出されたサンプルは200ナノメートルを中心としたより狭い分布を有することを示している。過剰なリポソームを除去するために遠心分離によって洗浄された位相シフト液滴を分析するために使用される調整可能な抵抗パルスセンシング分析は、液滴サイズが200ナノメートル近くであることを示しています。加熱するとナノドロップレット気化の顕微鏡データは、加熱前の視野で自然に気化した微小気泡が見え、加熱後に多くの気体マイクロバブルが観測されることを示しています。事前冷却せずに押出機に直接挿入されたナノ液滴の顕微鏡画像を、摂氏ゼロ度で、マイナス18°Cで凝縮して示しています。気化前後の凝縮されたオクタフルオロプロパン液滴の代表的な画像は、DFB液滴と同様に、加熱後のガスマイクロバブルの数も多いことを示しています。この手順で覚えておくべきことは、液滴の収率が結露時の温度と圧力に大きく依存し、わずかな変動が結果に影響を与えるということです。気化可能な液滴を生成した後、それらは超音波だけでなく、他のin vivoおよびex vivoアプリケーションを使用して生体内イメージングおよび薬物送達を最適化するために使用することができる。この技術を開発した後、ナノドロップレットサイズとガスコア含有量が生体内気化閾値に及ぼす影響は、このプロトコルにわずかな変更を用いて検討されてきた。

production-membrane-filtered-phase-shift-decafluorobutane

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

位相シフトナノエマルジョン（PSNE）は局所的な加熱を強化し、腫瘍内の熱焼灼を向上させるために高強度集束超音波を用いて蒸発させることができる。本報告では、狭いサイズ分布を有する安定したPSNEの調製が記載されている。さらに、超音波媒介アブレーションで気化PSNEの影響は組織模倣ファントムに示されています。...

アコースティック液滴蒸発とバブルが強化された超音波媒介アブレーションのための狭いサイズ分布を有する位相シフトナノエマルジョンの合成

プロトコルの全体的な目標は、無細胞タンパク質合成に使用できる1cm2平面基板上に100万個以上の順序付け、均一、安定した、生体適合性のフェムトリットル液滴を準備することです。...

単一DNA分子からの超並列タンパク質合成のためのフェムトリットルドロップレットアレイ

提示されたプロトコルは、超音波誘発薬物送達用途のために設計された蛍光標識マイクロバブルの応答を特徴付けるために使用することができ、その活性化メカニズムとその生物効果を含む。本論文では、関連する長さとタイムスケールを捉えるために実施されるイン ビトロ および インビボ...

超音波誘発薬物放出のための蛍光標識マイクロバブルの特性評価のためのマルチタイムスケール顕微鏡法

本プロトコルでは、マルチモーダル位相変化ポルフィリン滴を合成および特徴付けする方法を概説する。...

マルチモーダル相変化ポルフィリン滴の合成と特性解析

光学的に活性化されたパーフルオロカーボンナノ液滴は、血管系外のイメージングアプリケーションで有望です。この記事では、これらの粒子を合成し、ポリアクリルアミドファントムを架橋し、液滴を音響的に変調して信号を強化する方法を示します。...

光気化したパーフルオロカーボンナノ液滴の定式化と音響変調

このプロトコルでは、脂質マイクロバブルの作製と、マイクロバブルの物理化学的特性を保存する精製フリーの&gt;95%のラベリング効率を備えた互換性のあるワンポットマイクロバブル放射性標識法の概要を説明します。この方法は、多様な脂質マイクロバブル製剤に有効であり、放射性および/または蛍光マイクロバブルを生成するように調整できます。...

蛍光および放射性トレーサーによるマイクロバブルの作製と標識

クモの糸の傑出した機械的および生化学的特性にもかかわらず、この材料は、従来の手段によって大量にで収穫されたすることはできません。ここで我々は次世代の生体材料としてクモの糸生産とその使用方法を勉強し調査官するための重要なプロセスである人工的なクモの糸繊維をスピンするための効率的なの戦略を、について説明します。...

実験室規模の合成クモの糸生産

我々は、市販のマイクロウェルプレートを使用して、均一なサイズや組成制御の腫瘍スフェロイドの大量（数十万、何千）の生成のためのプロトコルを紹介する。...

マイクロウェルプレートを用いてサイズ制御の腫瘍球、多数の生産

私たちは、定義された長さのホスホロチオエートDNAから一価の標的量子ドット(mQD)を調製するための詳細な指示を提供します。DNAラッピングは高収率で行われるため、製品の精製は必要ありません。私たちは、生細胞イメージングアプリケーションのために、mQDを細胞表面受容体に標的とするSNAPタグの使用を実証しています。...

生産と一価量子ドットの標的

竹粉をNaOHで前処理し、酵素加水分解した。竹の加水分解物は、 Klebsiella pneumoniaeによる2,3-ブタンジオール、 R-アセトイン、2-ケトグルコン酸およびキシロン酸生産のための原料として用いられた。...

化学薬品の製造<em&gt;クレブシエラ・ニューモニエ</em&gt; Bamboo加水分解物を原料として使用する

学ぶ、デカフルオロブタンを用いた脂質安定化相シフトナノ液滴の均一製造法。超音波処理、冷却凝縮、200ナノメートル膜濾過により単分散性を向上させ、生体医工学イメージングと薬物送達に応用可能です。

プレフォームマイクロバブルからの膜濾過相シフトデカフルオロブタンナノ液滴の製造

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