Name: 患者末梢血単核細胞からのヒト心筋細胞の発生と拡大 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: 学ぼう末梢血単核細胞から患者特異的心筋細胞を発生・拡大する手法。iPSC再プログラミングと指向性分化を用い、心血管疾患モデリングや薬剤毒性試験に応用可能な実験プロトコルを解説します。

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この研究は、米国心臓協会(AHA)キャリア開発賞18CDA34110293(M-T.Z.)、追加ベンチャーズAVIFおよびSVRF賞(M-T.Z.)、国立衛生研究所(NIH NHLBI)が1R01HL1242245、1R01HL1225220およびR010.I096(D010.6)によって支援されました。明タオ・ジャオ博士は、全国小児病院のアビゲイル・ウェクスナー研究所のスタートアップ資金にも支えられてきました。

実験議定書とヒト被験者のインフォームド・コンセントは、全国小児病院の機関審査委員会(IRB)によって承認されました。
1. 細胞培養培地、溶液、試薬の製造
<ol><li>PBMC メディアの準備<ol>
<li>20 mLの基礎PBMC培養培地(1x)と0.52 mLのサプリメントを混ぜます。SCFとFLT3の20 μL(ストック濃度:100 μg/mL)、4 μLのIL3、IL6、EPO(ストック濃度:100 μg/mL)、L-グルタミン代替(100x)を200 μL加えます。それらを徹底的に混ぜます。0.22μmのフィルター単位を使用して無菌フードでフィルター。これを完全な血液メディアと名前を付けます。</li>
		<li>20 mL の基礎 PBMC 培養培地 (1x) と 0.52 mL のサプリメントを混合します。L-グルタミン代替(100x)の200 μLを加えます。それらを徹底的に混ぜます。0.22μmのフィルター単位を使用してフィルター。これを補足血液培地とします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>完全なE8メディアを準備する<ol>
<li>E8基底メディア500mLとE8サプリメント10mL(4°Cで一晩解凍)を混ぜて完全なE8メディアを作ります。使用前に室温(RT)に平衡化します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>iPSCパスジングメディアの準備<ol>
<li>40 μLの Y-27632 ロックインヒビター (1:5,000 希釈、ストック濃度: 10 mM) を完全な E8 媒体の 200 mL に加えます。十分に混ぜます。使用前にRTに平衡化します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>心筋細胞分化培地の準備<ol>
<li>メディアI:500 mLのRPMI1640を10 mLのB27マイナスインスリンサプリメント(50x)と混合する。</li>
		<li>メディアII:メディアI(CHIR99021最終濃度6μM)に適切な量のCHIR99021(GSK3阻害剤)ストックを追加します。よく混ぜます。</li>
		<li>メディアIII:IWR-1(Wnt阻害剤)ストックの適切なボリュームをメディアI(IWR-1最終濃度5μM)に追加します。よく混ぜます。</li>
		<li>メディアIV:B27サプリメント(50x)の10 mLとRPMI1640の500 mLを混合します。よく混ぜます。</li>
		<li>メディアV:混合 500 rpmI1640 (無グルコース) 10 mL の B27 サプリメント (50x).よく混ぜます。</li>
		<li>メディアVI:メディアIV(CHIR99021最終濃度2μM)に適切な量のCHIR99021ストックを追加します。よく混ぜます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>iPSC-CMパッセイメディアの準備<ol>
<li>メディアIV(KSR最終濃度:10%)の90 mLにノックアウト血清交換(KSR)の10 mLを加えます。よく混ぜます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>iPSC-CM凍結メディアの準備<ol>
<li>1 mL の DMSO を KSR の 9 mL (最終濃度: 10% DMSO/90% KSR) に加え、よく混ぜます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>基質膜マトリックス中被覆プレートを準備する<ol>
<li>一晩4°Cで基質膜マトリックス培地を解凍し、1.5 mLチューブでアリコートを行います。この培地の1 mLをDMEM/F12培地(1:250希釈)の250 mLに加え、十分に混ぜます。希釈液2 mLを6ウェルプレートにウェルあたり2 mL塗布し、37°Cで5%CO2 で30分間インキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. PBMCのiPSCリプログラミング
<ol><li>血液サンプルからPBMCsを分離します。<ol>
<li>患者の血液サンプル(〜5 mL)を収集し、血液細胞分離管に移す( 材料表を参照)。10倍反転して混ぜます。</li>
		<li>室温で30分間1,500 x g の遠心分離機。</li>
		<li>慎重にチューブを取り出し、70%エタノールでスプレーします。バイオセーフティフードの下で、単核細胞(バフィー層)を邪魔することなくキャップを取り外します。PBMCはプラズマ層のすぐ下に白っぽい層になります(図1A)。1000 μL ピペットを使用して全体のバフィー層を収集し、15 mL の円錐管に移します。</li>
		<li>自動セル カウンターを使用してセル番号をカウントします。RTで25分間300 x g でチューブを回転させます。</li>
		<li>上清を捨てます。DPBS(Ca2+/Mg2+無料)10 mLで洗浄してください。</li>
		<li>RTで15分間300 x g でチューブを回転させます。</li>
		<li>上清を取り除く。凍結培地の1mL(KSRプラス10%DMSO)で細胞ペレットを再懸濁する。セル密度を調整して、バイアルあたり1 x 106 のセルを作ります。</li>
		<li>PBMCクリオビアルを細胞凍結容器に入れ、一晩で-80°Cに保ちます。翌日に長期保存のために液体窒素タンクに移します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>iPSCのリプログラミング。<ol>
<li>15 mLの円錐形の管に3 mLのサプリメント血液培地を加える。37°Cの水浴でPBMCsを解凍し、円錐形のチューブに移します。RTで7分間300 x g でスピンします。</li>
		<li>上清を捨てます。完全な血液メディアでPBMCを再中断します。24ウェル組織培養プレート(基部膜マトリックスなし)の2つの井戸に播種します。</li>
		<li>一晩で5%CO2を37°Cでインキュベートする。翌日は古いメディアの半分(0.5 ml)をそっと取り除き、0.5 mLの新鮮な完全な血液メディアを加えます。</li>
		<li>古いメディアの半分をリフレッシュして、1日おきにメディアを変更します。</li>
		<li>1週間後、1 mLのサプリメント血液培地でウェルを積極的に洗浄し、細胞を15 mL遠心分離チューブに移します。</li>
		<li>セル番号をカウントします。2 x 105 細胞と遠心分離機を300 x g で7分間服用します。</li>
		<li>上清を捨てます。完全な血液メディアの300 μLの細胞を再懸濁させる。メーカーの指示に従ってセンダイウイルスリプログラミングベクターの適切な量を追加することにより、トランスフェクションを実行します。24ウェルプレート(基部膜マトリックスなし)の1つの井戸にそれらを転送します。一晩で5%CO2を37°Cでインキュベートする。</li>
		<li>翌日は300×gで7分間スピンします。上清を取り除き、完全な血液メディアの2 mLで再中断します。基膜マトリックスであらかじめコーティングされた6ウェルプレートの1つの井戸に移します。これは 1 日目 (D1) です。</li>
		<li>次の日に皿に触れないでください。</li>
		<li>D3 で、古いメディアの 1 mL を取り外します。サプリメント血液培地の1 mLを追加します。</li>
		<li>D5 でステップ 2.2.10 を繰り返します。</li>
		<li>D7 で、古いメディアの 1 mL を取り外します。完全なE8メディアの1 mLを追加します。</li>
		<li>D8 で、ステップ 2.2.12 を繰り返します。</li>
		<li>D9 で、古いメディアを取り外します。完全なE8メディアの2 mLを追加します。完全に再プログラムされた細胞は、コロニーの形成を取り付け、開始することが期待される。</li>
		<li>毎日2mLの完全なE8メディアでリフレッシュしてください。</li>
		<li>仙台ウイルスの感染から約2週間で、大型のiPSCコロニーが出現し、ピッキングの準備が整います。</li>
		<li>フード内の実体顕微鏡下でiPSCコロニーを切断し、0.5 mLのiPSC通過媒体をプリロードした基質膜マトリックスコーティングされた24ウェルプレートに個々のコロニーを移管します。</li>
		<li>iPSCコロニーが新しい基膜マトリックスコーティングされた6ウェルプレートに通過するのに十分な大きさになるまで、毎日0.5 mLの完全なE8培地でリフレッシュしてください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ヒトiPSCのメンテナンスと過渡
<ol><li>ヒトのiPSCが90%以上の合流率に達したら、古いメディアを取り除く。3 mLのDPBSを一度にすすいでください。</li>
	<li>DPBS溶液に0.5 mM EDTAの1 mLを加えます。5-8分間、37°Cで5%CO2 でインキュベートします。</li>
	<li>吸引によってEDTAを取り除く。iPSC通過媒体を1 mL追加します。iPSC を手動で取り外します。</li>
	<li>600-900 μLの単一細胞懸濁液を取り、基質膜マトリックスコーティングされた6ウェルプレート(希釈:1:6〜1:10)に再板します。一晩で5%CO2を37°Cでインキュベートする。</li>
	<li>毎日2mLの完全なE8メディアでリフレッシュしてください。iPSC培養は通常3~4日後に合流する。</li>
</ol>4. 化学的に定義された心筋細胞分化
<ol><li>95%コンフルエント(3-4日)まで完全なE8メディアでヒトiPSCを培養する。</li>
	<li>古いメディアを取り外します。6ウェルプレートの各ウェルにCM分化メディアII(RPMI1640の6 μM CHIRとB27マイナスインスリンサプリメント)を2 mL加えます。これはD0です。D1に触れないでください。</li>
	<li>D2では、CM分化培地I(RPMI1640プラスB27マイナスインスリンサプリメント)の2 mLに置き換えてください。</li>
	<li>D3では、CM分化培地IIIの2 mL(RPMI1640プラスB27マイナスインスリンサプリメントで5μM IWR-1)に交換してください。D4に触れないでください。</li>
	<li>D5 では、CM 分化メディア I の 2 mL に置き換えます。</li>
	<li>D7では、CM分化メディアIV(RPMI1640プラスB27サプリメント)の2 mLに交換してください。その後、1 日おきにメディアを更新します。</li>
	<li>D11上で細胞が収縮する場合、CM分化培地V(無グルコース)の2mLに交換する。</li>
	<li>D13 では、CM 分化メディア V の 2 mL に交換します。</li>
	<li>D15では、CM分化メディアIVの2 mLに交換してください。</li>
	<li>D17-D21 では、CM 分化メディア IV の 2 mL を 1 日おきに交換します。</li>
</ol>5. ヒトiPSC-CMの通路
<ol><li>DPBS の 3 mL で古い培地を取り除き、細胞を一度すすい。</li>
	<li>6ウェルプレートの各ウェルにCM解離解液1 mL( 材料表を参照)を適用します。5-8分間、37°Cで5%CO2 でインキュベートします。</li>
	<li>iPSC-CMを、激しいピペット処理により単一細胞に機械的に解化する。</li>
	<li>細胞を15 mL円錐形チューブに移します。CMの解離の解決を中和するためにCMの通過媒体(RMPI1640とB27の補足の10%KSR)の2 mLを加える。</li>
	<li>RTで5分間300 x g で回転します。</li>
	<li>上清を捨てます。CM通過媒体の所望の容積を有する細胞を再中断する。基部の膜マトリックスコーティングされたプレート/皿に播種します。ヒトiPSC-CMは、通過後1〜3日で殴打を再開します。</li>
</ol>6. ヒトiPSC-CMの拡大
<ol><li>6ウェルプレートのウェルごとに3 mLのDPBSでiPSC-CMを1回打つD10-12をすすいます。CM解離ソリューションを1 mL追加します(ステップ5.2)。37°Cで5%CO2 で7〜10分間インキュベートします。</li>
	<li>iPSC-CMを、激しいピペット処理により単一細胞に機械的に解化する。</li>
	<li>細胞を15 mL円錐形チューブに移します。CMの解離の解決を中和するためにCMの通過媒体の2 mLを加える。</li>
	<li>RTで5分間300 x g で回転します。</li>
	<li>上清を捨てます。適切な量の CM 通過媒体を持つセルを再中断します。ピペットを上下にして単一細胞懸濁液を作ります。100万個のiPSC-CMを基部の膜マトリックスコーティングされた10cm皿に種分します。</li>
	<li>次の日は古いメディアを削除します。10 mLの心筋細胞増殖培地(メディアVI:2 μM CHIR99021)を加えます。1 日おきにメディアを変更します。</li>
	<li>iPSC-CM が 7~9 日培養後にコンフルエントになった場合は、iPSC-CM のさらなる拡張のために、継ぎ手のステップを繰り返します。</li>
</ol>7. 免疫蛍光
<ol><li>免疫蛍光染色の前に、24ウェルプレートに配置された基質膜マトリックスコーティングカバーリップ(シードiPSC-CM:播種密度:0.5-1 x 106 細胞/mL)にシードします。少なくとも 4 日間は、iPSC-CM をカルチャに保持します。</li>
	<li>1 mLのDPBSを使用して細胞を1回洗浄します。</li>
	<li>4%パラホルムアルデヒド(PFA)の0.5 mLを加え、RTで15分間インキュベートします。</li>
	<li>1 mLのDPBSを用いて細胞を洗浄する。1 回繰り返します。</li>
	<li>0.1%トリトンX-100の0.5 mLを加え、RTで20分間インキュベートします。</li>
	<li>1 mL の DPBS を 2 回洗います。</li>
	<li>DPBS(ブロッキング溶液)に0.2%BSAの0.5 mLを加えます。RTで1時間インキュベートする。</li>
	<li>ブロッキング溶液で希釈した一次抗体200μLを加える(希釈:1:400-1:1000)。一晩4°Cでインキュベートします。</li>
	<li>0.5 mLのブロッキング溶液を使用して3分間揺れで細胞を洗浄します。2 回繰り返します。</li>
	<li>ブロッキング溶液に希釈した200μLの二次抗体を添加します。RTで1時間インキュベートする。</li>
	<li>0.5 mLのDPBSで細胞を3回リンスし、それぞれ3分間揺れ動かします。</li>
	<li>カウンターステイン核とDAPI(1:2000希釈)、RTで5分間インキュベートする。</li>
	<li>0.5 mLのDPBSで細胞を3回リンスする。</li>
	<li>5 μlの取り付けメディアを使用して、カバーリップ上のセルを顕微鏡スライドに取り付けます。4°Cで保管し、光から保護します。</li>
</ol>8. フローサイトメトリーサンプル調製
<ol><li>3 mLのDPBSでヒトiPSC-CMを1回洗います。</li>
	<li>CM解離液1 mLを加え、37°Cで5%CO2 で7~10分間インキュベートします。</li>
	<li>1,000 μL ピペットを使用して細胞を取り出します。ストレーナーキャップを通して丸いFACSチューブに細胞懸濁液を移す。FACSチューブは、酵素活性を中和するために1mLのiPSC-CM通過媒体(10%KSR)で予め充填されています。</li>
	<li>300 x g で 5 分間スピンします。</li>
	<li>細胞ペレットを乱さずに上清を除去する。250 μLの固定/透過性解析ソリューションを追加します(資料表を参照)。4°Cで20分間インキュベートします。</li>
	<li>1 mL のペルミ/ウォッシュバッファを追加します。渦は短時間で、300 x g で4分間回転します。</li>
	<li>上清を捨てます。1x Perm/Washバッファーに100 μLの希釈一次抗体(1:200-1:500)を加えます。渦を短時間で4°Cで一晩インキュベートする。</li>
	<li>ペルミ/ウォッシュバッファーの1 mLを加えて細胞を洗浄します。渦は短時間で、300 x g で4分間回転します。</li>
	<li>上清を捨てます。希釈二次抗体を100 μL加えます(1:500-1:1,000)。渦は短時間、RTで1時間インキュベートする。二次抗体が光感受性蛍光と共役する場合は、光から保護します。</li>
	<li>ペルミ/洗浄バッファーの1 mLを加えて細胞を洗浄します。渦は短時間で回転し、300gで4分間回転します。</li>
	<li>上清を捨てます。400 μL の FACS 染色バッファー (PBS/4% FBS) を持つセルを再中断します。FACS機器にロードするまで4°Cで保管してください。</li>
</ol>9. リアルタイムの qPCR
<ol><li>人間のiPSC-CM文化の古いメディアを削除します。500~700 μL のライシスバッファーを細胞のリセートに加えます。RT. スケープ細胞ライセートで3分間インキュベートし、1.5 ml RNaseフリーチューブに移します。RNAの全量抽出を直ちに行うか、-80°Cで保存してください。</li>
	<li>メーカーの指示に従って、RNA抽出キットを使用して全RNAを分離します。</li>
	<li>RNA濃度を測定し、分光光度計で全RNAの品質を評価します。</li>
	<li>cDNA合成キットを用いて逆転写反応を行う。RT反応の総体積は、4 μLの反応ミックス(5x)、1 μLの逆転写酵素、1 μgの全RNAおよびRNaseフリー水を含む20 μLです。</li>
	<li>次のプロトコルを使用してサーマルサイクラーで完全なRT反応ミックスをインキュベート: 25 °C 5分間;46°C 20分間。95°C 1分間。4 °Cで保持します。</li>
	<li>ヌクレアーゼを含まない水を用いてcDNAを1:10で希釈する。1 μLのcDNAテンプレート、プライマー/プローブ1 μL、qPCRマスターミックス10 μL、ヌクレアーゼフリー水8 μLを混合して、リアルタイムqPCR反応を設定します。</li>
	<li>リアルタイム PCR システムで実行します。サイクリングプロトコルは50°C2分(ホールド)、95°C 10分(ホールド)、95°C 15秒、60°C1分、40サイクル繰り返します。</li>
	<li>各サンプル中の各遺伝子のCT 値を収集する。mRNAの相対的存在量は、ハウスキーピング遺伝子のCT 値から標的遺伝子のCT 値を差し引くことによって計算される。相対遺伝子発現は、2-ΔΔCT 法により解析される。</li>
</ol>10. 全セルパッチクランプ記録
<ol><li>前述のようにCM解解を用いてiPSC-CMを単一細胞に解離する。</li>
	<li>基部膜マトリックスコーティングカバーリップ上の低密度で細胞をシード。メディアIVで3〜4日間培養します。</li>
	<li>ホウケイ酸ガラスの毛細血管からピペット(抵抗0.9~1.5 MΩ)を引き出し、水平マイクロ電極プーラーを使用します。</li>
	<li>タイロード溶液中の細胞をインキュベートする(pH=7.35)。</li>
	<li>ピペットに以下の化学物質で構成される電極溶液(pH=7.3)を充填する:120 mMアスパラギン酸、 20 mM KCl、2 mM MgCl2、5mM HEPES、10 mM NaCl、5 mM EGTA、0.3 mM Na-GTP、14 mMホスホクレアチン、4 mM K-ATPおよび2mMクレアチンホスホキナーゼ。</li>
	<li>1 Hz で 1.5-2 拡張期しきい値 5 ms 電流パルスを使用して、現在のクランプ モードにセルを配置します。</li>
	<li>マイクロ電極アンプとソフトウェア駆動型取得ボードを使用して、アクション電位(AP)を記録します。</li>
</ol>

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li>
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<li>Heallen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo+pathway+inhibits+Wnt+signaling+to+restrain+cardiomyocyte+proliferation+and+heart+size%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size.</a> Science. 332 (6028), 458-461 (2011).</li>
</ol>

著者らは、競合する財政的利益を宣言しない。

iPSCリプログラミングの間、明確な核と細胞質で拡大されるまで1週間培養PBMCsに重要です。PBMCsは増殖しないため、iPSCのリプログラミングを成功させるためには、ウイルス導入に適切な細胞数が重要です。PBMCsの細胞数、感染の多重度(MOI)およびウイルスの価動体は、最適なトランスダクション結果に到達するために考慮され、調整されるべきである。心臓分化の場合、初期シード密度は、chiR99021 が投与された日に iPSC が 90% 以上のコンフルエントに到達するために重要です。一方で、心臓分化時にiPSCのコンフルエントが少ない場合、CHIR99021は毒性があり、実質的な細胞死につながります。一方、iPSCがコンフルエントを超えた場合、自発的な分化が起こって、指向性心臓分化の効率が損なわれます。初期のiPSC-CMの拡張については、タイミングと心筋細胞の品質を考慮する必要があります。初期のiPSC-CMは、心筋細胞の純度が十分に高い場合にのみ、強く増殖することができます。培養中の既存の非心筋細胞もCHIR99021治療に応答して増殖し、初期のiPSC-CMの増殖に悪影響を及ぼす可能性がある。さらに、分化の20日目までに心筋細...

ヒト人工多能性幹細胞の発見は、現代の心臓血管医学1,2に革命を起こしました。ヒトのiPSCは、心筋細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、心臓線維芽細胞を含む、心臓内のすべての細胞タイプを自己再生し、生成することができます。iPSC由来心筋細胞(iPSC-CM)は、遺伝的に遺伝性心血管疾患(CVD)をモデル化し、新薬の心の安全性をテストするための無期限のリソースとして役立つことができる3。特に、iPSC-CMは、長いQT症候群4および拡張型心筋症(DCM)5のような心筋細胞の欠陥に由来するCVDの遺伝的および分子的病因を調査する準備が整っている。CRISPR/Cas9媒介ゲノム編集と組み合わせることで、患者iPSC-CMは先天性心不全(CHD)6、7、8を含むCVDの複雑な遺伝的基盤を理解するための前例のない道を開いた。ヒトiPSC-CMは、心臓発作9の間に損傷した心筋を補充するための自己細胞源として役立つ可能性を示している。近年、心臓再生および薬物検査10に対して、定義されたサブタイプ(心房、心室および節状)を有する高品質のヒトiPSC-CMを生成することが最も重要になっている。
ヒトiPSCとの心臓分化は、過去10年間で大きく進歩してきました。分化方法は、胚体(EB)ベースの自発的分化から化学的に定義され、指示された心臓分化11に行った。Wnt、BMP、Nodal、FGFなどの胚性心臓の発達に不可欠な主要なシグナル伝達分子は、ヒトiPSC10,12からの心筋細胞分化を増強するために操作される。顕著な進歩は、ヒトiPSC13,14から心筋細胞の堅牢な生成のためのWntシグナル伝達(活性化後の阻害)の順次変調を含む。化学的に定義された心臓分化のレシピは、産業および臨床レベルの生産にアップグレードされる可能性を有する拍動心筋細胞15、16の大規模な生産を容易にするために探求されてきた。また、初期ヒトiPSC-CMの堅牢な拡張は、小型化学物質(CHIR99021)17を用いた構成的なWnt活性化への曝露によって達成される。最近では、ヒトiPSC18、19、20、21、22からの心筋細胞系統のコミットメント中に特定の分化窓におけるレチノイン酸(RA)およびWntシグナル伝達経路の操作を介してサブタイプ特異的な心筋細胞が生成される。
本プロトコルでは、患者末梢血単核細胞由来のヒトCMの堅牢な生成と増殖のための作業手順を詳述する。1)ヒトPBMCをiPSCにリプログラミングするプロトコル、2)ヒトiPSCからの打ち負拍起動細胞の堅牢な生成、3)初期iPSC-CMの急速な拡大、4)ヒトiPSC-CMの分子特性化、および5)パッチクランプによる単一細胞レベルでのヒトiPSC-CMの電気生理学的測定のためのプロトコルを提示する。このプロトコルは、患者の血液細胞を拍動心筋細胞に変換する詳細な実験手順をカバーしています。

<table><tbody><tr><td>ABI 7300 高速リアルタイム PCR システム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axon Axopatch 200B マイクロ電極アンプ</td><td>モレキュラーデバイス</td><td></td><td>マイクロ電極アンプ</td></tr><tr><td>B27 サプリメント</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>B27 サプリメント マイナスインスリン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm固定・透過キット</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>554714</td><td>固定・透過処理液・パーマ/ウォッシュバッファー</td></tr><tr><td>BDバキュテイナーCPTチューブ</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>362753</td><td>血球分離チューブ</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>セレック・ケミカルズ</td><td>S2924</td><td></td></tr><tr><td>CytoTune-iPS 2.0 仙台リプログラミングキット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A16517</td><td>仙台ウイルスリプログラミングキット</td></tr><tr><td>Digidata 1200B</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>アクイジションボード</td></tr><tr><td>ダイレクトゾール RNA Miniprep キット</td><td>Zymo Research</td><td>R2050</td><td>RNA 抽出キット</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>エッセンシャル 8 メディウム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A1517001</td><td>iPSC 培養用 E8 培地</td></tr><tr><td>GlutaMAX サプリメント</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>35050061</td><td>L-グルタミンの代替品</td></tr><tr><td>成長因子の減少 マトリゲル</td><td>コーニング</td><td>356231</td><td>基底膜マトリックス</td></tr><tr><td>iScript cDNA Snythesis Kit</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1708891</td><td>cDNA 合成</td></tr><tr><td>IWR-1-endo</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S7086</td><td></td></tr><tr><td>ノックアウト血清補充 (KSR)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック サイエンティフィ</td><td>ック 10828028</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 7.0</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>電気生理学データ収集・解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>組換えヒト EPO</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>PHC9631</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト FLT3</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>PHC9414</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトIL3</td><td>Peprotech</td><td>200-03</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトIL6</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td>PHC0065</tr><tr><td>組換えヒト SCF</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培地</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培地、グルコースなし</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11879020</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade Gold 退色防止 封入剤</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>S36936</td><td>封入剤</td></tr><tr><td>StemPro-34 SFM</td><td>サーモFisher Scientific</td><td>10639011</td><td>PBMC 培養培地</td></tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4444964</td><td>qPCR マスターミックス</td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1217703</td><td>CM dissociation solution</td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td>iPSC dissociation solution</td></tr><tr><td>Y-27632 2HCl</td><td>セレックケミカルズ</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

患者末梢血単核細胞からのヒト心筋細胞の発生と拡大

Generation and Expansion of Human Cardiomyocytes from Patient Peripheral Blood Mononuclear Cells

単一の血液引き分けから患者固有の心筋細胞を生成することは、心血管疾患の精密医療に大きな関心を集めています。ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)からの心臓分化は、胚性心臓の発達に不可欠なシグナル伝達経路によって調節される。2次元および3次元プラットホーム上の多数の心臓分化方法は、様々な効率および心筋細胞収率と開発された。これらの方法の多様性は従うのが難しい可能性があり、これは現場外の調査官を困惑させた。ここでは、末梢血単核細胞(PBMC)からの患者特異的心筋細胞の堅牢な生成と拡大を詳述した包括的なプロトコルを提示する。まず、非集積センダイウイルスベクターを用いた患者の血液サンプルからの高効率iPSCリプログラミングプロトコルについて説明する。次に、ほとんどのヒトiPSCラインから打ち負かす心筋細胞を堅牢に生成できる、小分子媒介単層分化法を詳述する。さらに、スケーラブルな心筋細胞拡張プロトコルは、産業および臨床グレードのアプリケーションのために患者由来の心筋細胞を急速に拡大することができる低分子(CHIR99021)を使用して導入されています。最後に、これらのiPSC-CMの分子同定と電気生理学的特徴付けのための詳細なプロトコルが描かれています。このプロトコルは、心血管の発達と幹細胞生物学に関する限られた知識を持つ初心者にとって実用的なものになることを期待しています。

PBMCからのヒトiPSCリプログラミング 完全な血液培地を7日間用いて培養した後、PBMCsは可視核と細胞質(図1B)で大きくなり、ウイルストランスフェクションの準備ができていることを示す。センダイウイルスのリプログラミング因子によるトランスフェクションの後、PBMCはエピジェネティックなリプログラミングプロセスを1週間受ける。一般的に、1 x 10 5 PBMCのトランスフェクションから30〜50 個のiPSCコロニーを得て、リプログラミング効率は0.03%-0.05%です。完全に再プログラムされた細胞は、完全なE8メディアに導入されるとコロニーを付着し、形成を開始します(図1C)。これらの初期のiPSCコロニーはさらに7日間拡張され、その後機械的に切断され、個別に拾われます。各iPSCコロニーは、個々のiPSCラインを確立するために、6ウェルプレートの1つのウェルに転送されます。4-5の...

ここでは、患者末梢血単核細胞からヒト心筋細胞を強固に生成・拡張するプロトコルを提示する。

Generating patient-specific cardiomyocytes from a single blood draw has attracted tremendous interest in precision medicine on cardiovascular disease. ...

これは、包括的なプロトコル施設であり、生のブースト生成、および末梢血単核細胞からの患者固有の培養物の使用を使用する。この戦術は再現性があり、初心者のために特に、従うのは簡単です。そして、幹細胞バラード、または心血管医学を専門とする、必要ありません。私たちのプロトコルは、心血管疾患のモデリングおよび新薬の心臓毒性のテストに使用できる単一の血液引き出しから患者固有の心筋細胞を生成するために使用することができます。このプロトコルは、幹細胞の再プログラミングのメンテナンスと指示分化に長い時間のコミットメントを必要とします。しかし、あなたは本当にあなたの努力に感謝しています。あなたが皿の中で心筋細胞を打つのを見たとき。ヒトiPSCコロニーが90%以上の合流度に達したら、37°CでDPBSで1ミリリットルのDPBSで細胞を処理する前に、DPBSの3ミリリットルで各々をよくすすいだ。5~8分後、iPSC通過培地を1ミリリットルずつ各ウェルに加え、細胞を手動で取り外します。細胞の600〜900マイクロリットルを個々のウェルズに移し、37°Cおよび5%二酸化炭素で一晩インキュベーションのための6つのウェルプレートをコーティングした基質膜を有する。その後、3〜4日間、毎日完全なE8培地の2ミリリットルで培養物をリフレッシュします。培養物が合流性に達したら、培地を心筋細胞分化培地2ミリリットル、ウェルあたり2ミリリットルに置き換える。2日目には、上清を心筋細胞分化培地1の2ミリリットルに置き換えます。3日目に、上清を心筋細胞分化培地3の2ミリリットルに置き換える。5日目。上清を心筋細胞分化培地1の2ミリリットルに置き換えます。7日目から10日目に、上清を心筋細胞分化培地4の2ミリリットルに置き換えます。11日目と13日目。収縮細胞が観察される場合は、上清を心筋細胞分化培地5の2ミリリットルに置き換える。15日、17日、19日、21日。上清を心筋細胞分化培地4の2ミリリットルに置き換えます。7日あたりの完全な血液培地で前培養した後、PBMCはセンダイウイルスリプログラミング因子でトランスフェクションの準備ができていることを示す可視核と細胞質で大きくなった。完全なE8培地への導入時。完全に再プログラムされた細胞は、コロニーを形成し始めます。4~5回の通過の後、非常に純粋なiPSCコロニーは、非常に少ない分化細胞を観察して再プログラムされた細胞から形成されます。この段階では、細胞のほとんどはOCT4およびNANOG陽性であり、その多能性を示す。心筋細胞を打つことは、通常、分化の12日後に観察される。グルコース飢餓後、iPSC心筋細胞を再めっきして、自発的な拍動、およびインターカルレート心臓トロポニンTとαアクチニン発現を有するアライメントサルコメア構造を示す。コロニーは、トロポニンT発現によって証明されるように、その純度を保持します。iPSC心筋細胞は成人型心筋細胞に比べて比較的未熟であるが、彼らは、卸売パッチ、クランプによって測定された行動電位のような心室および心房を示す。心室心筋細胞はミオシン軽鎖2を発現し、心房iPSC心筋細胞はNR2F2発現によって特徴付けられます。Wnt活性化は細胞分裂を促進し、細胞周期調節因子の発現を促進する。興味深いことに、Wnt活性化はまた、この増殖能力は時間の経過とともに減少するが、コントロールと比較して2つの通路のための初期のiPSC心筋細胞の堅牢な増殖を誘発する。PBMの条件はiPSCの再プログラミングにとって重要であるため、iPSCリプログラミングベクターが導入される前に、PBMSが明確な核および細胞質で拡大されていることを確認してください。患者固有の心筋細胞は、インビトロで心血管疾患をモデル化し、心臓幹細胞療法のためにドナー細胞のトンを提供するために貴重です。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

私たちは、人間の心臓前駆細胞の大量供給と心血管修復のための機能的な心筋細胞の導出を可能にする低分子化合物、と定義された条件の下で維持さ多能性ヒト胚性幹細胞から直接cardioblastsの誘導のためのプロトコルを確立している。...

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト心筋前駆体と心筋細胞の効率的な導出

整列心筋組織の生成が臨床的に有用な目的のために、幹細胞生物学の最近の進歩に適応させるための重要な要件です。ここに我々は、細胞の形や機能の正確な制御のためのマイクロコンタクトプリントのアプローチについて説明します。心臓前駆細胞由来の胚性幹細胞の高度に精製された集団を使用して、我々はそれから異方性、機能心筋組織を生成します。...

マイクロコンタクトプリントスルーアライン機能心筋組織の生成

多能性幹細胞は、胚又は人工多能性幹細胞（iPS細胞）のいずれかで、心筋細胞を含むヒト分化細胞の貴重な情報源を構成する。ここでは、胚様体ベースのプロトコルを介して機能的なヒト心筋細胞を得るためにそれらを使用する方法を示す、iPS細胞の心筋誘導に焦点を当てます。...

ヒト心筋細胞の生成：フィーダーフリーヒト人工多能性幹細胞からの分化プロトコル

この原稿は、表面マーカー発現と細胞選別を使用して、定義された人工心臓組織の作成について説明しています。次に、定義された組織をマルチティッシュバイオリアクターで使用して、心臓細胞療法のメカニズムを調査し、機能的でありながら制御されたヒト心臓のモデルシステムを提供できます。...

心臓細胞療法のメカニズムを研究するために定義されたヒューマン・エンジニア心臓組織の構築

人間の心臓組織は、心筋再生のために適切であり得る多能血管周囲の前駆細胞集団を保有します。ここに記載された技術は、ネイティブの血管に関連する2つの多能ストローマ細胞集団の同時単離および精製を可能にする、すなわち CD146 + CD34 -周皮細胞およびCD34 + CD146 -外膜細胞、ヒト心筋から。...

ヒト心臓組織からの血管周囲多能前駆細胞集団の単離

我々は、心筋細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞およびパッチ媒介性サイトカインの送達と細胞注射を組み合わせることにより、移植細胞の生着を改善する配送方法に、ヒト人工多能性幹細胞を分化するための3つの新規かつより効率的なプロトコルを提示します。...

多能性幹細胞は、心筋の修復のための心臓細胞を派生します

ここでは、機能、契約、心筋細胞のような細胞を生成するために若いヒト間葉系幹細胞源の心臓微分の潜在性を効率的に活用する方法を提案するの in vitro...

体外ヒト間葉系幹細胞の心筋細胞のような細胞への分化

ここで我々 アクチビン A のレンチ ウイルスを介した Id1...

最初心臓フィールドのような心臓前駆細胞およびひと多能性幹細胞からのような心室心筋細胞の生成

ここでは、幹細胞移植前の DNA...

心臓の細胞治療幹細胞 DNA の完全性を評価します。

ここでは、分化前のヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞、心臓線維芽細胞、および内皮細胞からなる3D自己組織化心臓ミクロ組織アレイを生成するための使いやすい方法論について説明する。心臓ミクロ組織を生成するためにこのユーザーフレンドリーで低細胞を必要とする技術は、疾患モデリングおよび医薬品開発の初期段階に実装することができる。...

ヒトiPSC由来心筋細胞、心臓線維芽細胞、内皮細胞を用いた3次元心臓ミクロ組織アレイの作製

ここでは、ハイスループットの多次元フォーマットで培養されたヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞からの心臓スフェロイド(CS)の生成と凍結保存のための一連のプロトコルを紹介します。この3次元モデルは、疾患モデリング、ハイスループットスクリーニングのための堅牢なプラットフォームとして機能し、凍結保存後もその機能を維持します。...

ヒト誘起多能性幹細胞由来心臓スフェロイドの作製、ハイスループットスクリーニング、バイオバンキング

学ぼう末梢血単核細胞から患者特異的心筋細胞を発生・拡大する手法。iPSC再プログラミングと指向性分化を用い、心血管疾患モデリングや薬剤毒性試験に応用可能な実験プロトコルを解説します。

患者末梢血単核細胞からのヒト心筋細胞の発生と拡大

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