患者末梢血単核細胞からのヒト心筋細胞の発生と拡大

これは、包括的なプロトコル施設であり、生のブースト生成、および末梢血単核細胞からの患者固有の培養物の使用を使用する。この戦術は再現性があり、初心者のために特に、従うのは簡単です。そして、幹細胞バラード、または心血管医学を専門とする、必要ありません。

私たちのプロトコルは、心血管疾患のモデリングおよび新薬の心臓毒性のテストに使用できる単一の血液引き出しから患者固有の心筋細胞を生成するために使用することができます。このプロトコルは、幹細胞の再プログラミングのメンテナンスと指示分化に長い時間のコミットメントを必要とします。しかし、あなたは本当にあなたの努力に感謝しています。

あなたが皿の中で心筋細胞を打つのを見たとき。ヒトiPSCコロニーが90%以上の合流度に達したら、37°CでDPBSで1ミリリットルのDPBSで細胞を処理する前に、DPBSの3ミリリットルで各々をよくすすいだ。5~8分後、iPSC通過培地を1ミリリットルずつ各ウェルに加え、細胞を手動で取り外します。

細胞の600〜900マイクロリットルを個々のウェルズに移し、37°Cおよび5%二酸化炭素で一晩インキュベーションのための6つのウェルプレートをコーティングした基質膜を有する。その後、3〜4日間、毎日完全なE8培地の2ミリリットルで培養物をリフレッシュします。培養物が合流性に達したら、培地を心筋細胞分化培地2ミリリットル、ウェルあたり2ミリリットルに置き換える。

2日目には、上清を心筋細胞分化培地1の2ミリリットルに置き換えます。3日目に、上清を心筋細胞分化培地3の2ミリリットルに置き換える。5日目。

上清を心筋細胞分化培地1の2ミリリットルに置き換えます。7日目から10日目に、上清を心筋細胞分化培地4の2ミリリットルに置き換えます。11日目と13日目。

収縮細胞が観察される場合は、上清を心筋細胞分化培地5の2ミリリットルに置き換える。15日、17日、19日、21日。上清を心筋細胞分化培地4の2ミリリットルに置き換えます。

7日あたりの完全な血液培地で前培養した後、PBMCはセンダイウイルスリプログラミング因子でトランスフェクションの準備ができていることを示す可視核と細胞質で大きくなった。完全なE8培地への導入時。完全に再プログラムされた細胞は、コロニーを形成し始めます。

4~5回の通過の後、非常に純粋なiPSCコロニーは、非常に少ない分化細胞を観察して再プログラムされた細胞から形成されます。この段階では、細胞のほとんどはOCT4およびNANOG陽性であり、その多能性を示す。心筋細胞を打つことは、通常、分化の12日後に観察される。

グルコース飢餓後、iPSC心筋細胞を再めっきして、自発的な拍動、およびインターカルレート心臓トロポニンTとαアクチニン発現を有するアライメントサルコメア構造を示す。コロニーは、トロポニンT発現によって証明されるように、その純度を保持します。iPSC心筋細胞は成人型心筋細胞に比べて比較的未熟であるが、

彼らは、卸売パッチ、クランプによって測定された行動電位のような心室および心房を示す。心室心筋細胞はミオシン軽鎖2を発現し、心房iPSC心筋細胞はNR2F2発現によって特徴付けられます。Wnt活性化は細胞分裂を促進し、細胞周期調節因子の発現を促進する。

興味深いことに、Wnt活性化はまた、この増殖能力は時間の経過とともに減少するが、コントロールと比較して2つの通路のための初期のiPSC心筋細胞の堅牢な増殖を誘発する。PBMの条件はiPSCの再プログラミングにとって重要であるため、iPSCリプログラミングベクターが導入される前に、PBMSが明確な核および細胞質で拡大されていることを確認してください。患者固有の心筋細胞は、インビトロで心血管疾患をモデル化し、心臓幹細胞療法のためにドナー細胞のトンを提供するために貴重です。