ヘルムホルツ・ツェントルムベルリンにおける結晶学的フラグメントスクリーニングのワークフローとツール
2021年3月3日
ヘルムホルツ・ツェントルムベルリンでの結晶学的断片スクリーニングは、専用の複合ライブラリ、結晶処理ツール、高速データ収集機能、および大部分が自動化されたデータ分析を含むワークフローを使用して行われます。提示されたプロトコルは、下流の構造ベースのリガンド設計の有望な出発点を提供するために、このような実験の出力を最大化することを意図しています。
X線結晶学を用いた断片と呼ばれる小さな有機化合物のスクリーニングは、創薬や生化学的ツール化合物開発の出発点である分子を同定するための効率的な方法です。結晶学的断片スクリーニングは、同一性だけでなく、研究中のタンパク質の表面上で断片が結合する場所と方法も明らかにした。この技術は、適切なタンパク質結晶を成長させることができるすべての生化学的または医学的に関連するタンパク質標的に使用することができる。
結果の品質は、サンプル処理の品質に密接に関連しています。以下の目視デモンストレーションは、研究者が高品質な実験を行う上で役立つと考えています。この手順を実証することは、私の研究室の博士研究員で博士課程の学生であるタジャナ・バルテルです。
まず、スクリーニングプレートの袋を室温に予め温め開き、ふたとホイルをスクリーニングプレートから取り除きます。試薬貯留槽に5ミリリットルの浸漬液をデカントする。その後、12チャネルピペットを使用して、プレートの96リザーバーのそれぞれに40マイクロリットルの浸漬溶液を充填します。
スクリーニングプレートの上に簡単にアクセスできるフレームを置き、デバイスの左右にスライドさせて、付属のクランプで固定します。顕微鏡下にスクリーニングプレートと簡単にアクセスフレームを配置し、フレームのそれぞれのアクリルガラスタイルを移動させることによって最初のウェルをスライド開きます。新鮮なピペットチップを使用して、貯水池からよく含まれる断片に浸漬溶液の0.4マイクロリットルを追加します。
ドロップが乾燥したフラグメントを覆っていることを確認します。2番目の顕微鏡の下に最大の結晶を含む結晶板を置き、ウェルの1つでシールホイルを切り開きます。適当なサイズのループを使用して、第1の顕微鏡下でスクリーニングプレートのウェルに結晶を移す。
準備したガラススポットプレートでループを洗い、組織にそっと触れて乾燥させます。クロスコンタミネーションを避けるために、すべての転送後にこれを行います。顕微鏡を使用して、クリスタルが適切に配置されていることを確認します。
2番目の結晶に対して手順を繰り返します。次の井戸に移動し、残りのすべての井戸の手順を繰り返します。結晶がスクリーニングプレート内の96のウェルすべてに移された後、顕微鏡下から簡単にアクセスできるフレームと一緒にスクリーニングプレートを取り外し、ベンチまたはテーブルに置きます。
次に、スクリーニングプレートから容易にアクセスできるフレームを取り出し、スクリーニングプレートをシールホイルで密封し、結晶化インキュベーターまたは食器棚に入れて、以前に最適化された浸漬時間のためにインキュベートします。2時間のインキュベーションで十分ですが、一晩がより便利かもしれません。3つのユニパック蓋でユニパックフォームデュワーを準備し、半分は地面にそれを維持し、液体窒素でそれを埋めます。
半分満たされたデュワーをベンチに移動し、それを完全に端まで埋めます。実験全体の間、上端まで充填し、液体窒素を頻繁に交換してください。インキュベーターからスクリーニングプレートを取り出し、ホイルを取り外します。
簡単なアクセスフレームを上に配置します。最初の井戸をスライドして開きます。落下から1つの結晶を収穫し、フラッシュは速い垂直運動で突っ込むことによって液体窒素でそれを冷却します。
適切なパック位置にサンプルを挿入し、サンプル追跡シートに関連するメモを取ります。2番目の結晶に対して手順を繰り返します。次の井戸に移動し、すべての3パックがいっぱいになるまで、他の結晶の位置を繰り返します。
液体窒素でユニパックベースを事前に冷却し、蓋の上に追加します。ユニパックは、輸送デュワーまたはストレージデュワーのストレージラックに保管してください。測定まで極低温で液体窒素に保管してください。
スクリーニングプレートの残りのサンプルについて、結晶を収穫してUnipucksに保存するのと同じ手順を繰り返します。フラグメント浸漬と結晶採取を行った後の結晶形態の変動をここに示す。やや劣化しているように見える結晶でさえ、有用なデータをもたらすため含まれていました。
データは、ビームライン14.1および14.2でBESSY IIシンクロトロンで収集した。回折データ収集は、各サンプルについて行った。データは、処理のためのXDSAPP、構造改良のためのfspipeline、ヒット発見のためのPenDAの組み合わせに焦点を当てて、FragMAXappを使用して分析されました。
DMSOフリー浸漬条件を用いてARタンパク質複合体に15ヒットを記録した。同じターゲットに対するF2X入力画面の以前のキャンペーンでは、浸漬状態でDMSOを含め、20のヒットが見つかりました。つまり、DMSO を省略すると、ヒットの 75% を識別できます。
実験の成功のためには、結晶が手順の各ステップの間に適切かつ慎重に処理されていることが重要です。結晶学的断片スクリーニングは、広く使用されている技術に成熟しており、これはアカデミアや製薬業界でしばしば適用されます。
概要
本記事では、X線結晶構造解析を用いて潜在的な薬物候補を同定する方法として、結晶学的フラグメントスクリーニングについて解説します。本プロトコルの目的は、自動化されたデータ解析と最適化された試料ハンドリングを活用し、実験の効率を高めることにあります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 結晶学
- 創薬
- 生物化学
背景
- フラグメントスクリーニングは、タンパク質に結合可能な低分子有機化合物を同定するために用いられる手法である。
- 結果の精度は、サンプルの取り扱いおよび結晶化技術に大きく依存する。
- 本手法は、生化学的に重要なさまざまな標的タンパク質に適用可能である。
- データ収集を成功させるには、結晶を適切に取り扱うことが極めて重要である。
研究目的
- 結晶構造解析を用いたフラグメントスクリーニングの詳細なプロトコルを提示すること。
- タンパク質表面におけるフラグメントの結合特性に関する知見を提供すること。
- 構造ベースのリガンド設計における実験成果を向上させること。
使用した手法
- 浸漬溶液を用いたスクリーニングプレートの調製。
- タンパク質結晶のスクリーニングウェルへの転送。
- 最適化された条件下での結晶のインキュベーション。
- 専用ソフトウェアを用いたデータ収集および解析。
主な結果
- DMSO不使用条件下で、ARタンパク質複合体に対する15個のヒットを同定した。
- 以前の実験との比較により、DMSOを省略しても依然として有意なヒットが得られることが示された。
- 結晶形態の多様性と、それがデータ品質に与える影響を実証した。
結論
- 結晶学的フラグメントスクリーニングは、創薬において非常に有用な手法です。
- 信頼性の高いデータを得るためには、結晶を慎重に取り扱うことが不可欠です。
- 本プロトコルは、学術界および産業界の研究者にとってのガイドとして活用いただけます。
よくある質問
業界における実用的意義
結晶構造解析によるフラグメントスクリーニングは、原子レベルの分解能でリガンド結合様式を早期に特定することを可能にし、構造ベースの創薬におけるターゲットバリデーションおよびリード最適化を支援します。HZBで提示されたワークフローでは、自動データ処理と標準化された結晶ハンドリングを統合することで、フラグメントヒット探索における再現性とスループットを向上させています。このアプローチは、フラグメントとタンパク質の相互作用に関する直接的な構造的知見を提供することで、初期探索におけるメカニズム的な不確実性を低減し、その後のメディシナルケミストリーにおける進退判断（go/no-go決定）の根拠となります。
バイオ製薬R&Dにおける戦略的応用
初期段階の発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：断片結合部位の直接的な3D可視化を提供し、標的仮説のメカニズム的なリスク低減を可能にする。
- 運用上の価値：タンパク質結晶に対する96成分のフラグメントライブラリーの迅速なスクリーニングをサポートし、結合部位の可塑性を解析する。
- 予測的価値：強力な結合剤の構造ベース最適化の起点となるフラグメントヒットを特定する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 定量的な電子密度マップを提供し、フラグメントの占有率および結合配座を確認する。
- 運用上の価値： シンクロトロン放射光施設におけるロボット搭載のサンプル交換を利用し、数百個の結晶にわたるデータ収集を自動化する。
- アッセイの準備状況： 標準化された浸漬および急速凍結プロトコルを採用し、再現性のある回折品質のデータを確保する。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- トランスレーショナルな継続性：CFSにより同定されたフラグメントヒットを、前臨床評価に向けて薬理学的特性を改善したリード化合物へと進化させることができます。
- メカニズムによるリスク低減：フラグメント結合から得られる構造データは、SARの開発に有用な情報を提供し、リード最適化における脱落リスクを低減させます。
- 前臨床における有用性：フラグメント効率およびリガンド効率の指標による評価を可能にし、開発可能性の高いケモタイプを優先的に選択できます。
パイプラインおよびワークフローの統合
CFSのワークフローは初期探索の連続的なプロセスに組み込まれており、構造特性解析によるターゲットバリデーションをサポートし、フラグメントの伸長やリンキング戦略によるリード化合物の同定を可能にします。
- 創薬生物学：標的タンパク質のどこに、どのように低分子が結合するかを明らかにすることで、仮説検証を促進します。
- スクリーニング：自動結晶ハンドリングとシンクロトロンベースのデータ収集により、フラグメントライブラリの並列スクリーニングを可能にします。
- 分析：XDSAPP、fspipeline、およびPenDAを統合し、回折データセットからの自動処理、精密化、およびヒット化合物の同定を実現します。
- トランスレーショナルリサーチ：フラグメント最適化のための原子レベルの結合モードを提供し、構造ベースのリガンド設計を支援します。
- エンタープライズ再利用：創薬ポートフォリオにおける複数の標的タンパク質に対するフラグメントスクリーニングのための、標準化された再利用可能なプラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 結合モードの直接的な実験的根拠を示すことで、ターゲット-リガンド相互作用への信頼性を高める。
- 運用的価値： 標準化された結晶浸漬、回収、および凍結保存手順により、再現性を向上させる。
- 戦略的価値： 創薬化学にとって有利な結合相互作用を持つフラグメントを優先させることで、ヒットからリードへの最適化効率を向上させる。
- ポートフォリオへの影響： フラグメントスクリーニングの結果と構造的攻略可能性に基づき、リスク調整したターゲットの優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- タンパク質の結晶化、結晶の取り扱い、およびシンクロトロンを用いたデータ収集に関する専門知識が必要です。
- ハイスループットスクリーニングのためには、高輝度ビームラインおよび自動サンプルチェンジャーへのアクセスが不可欠です。
- フラグメントライブラリーの調製、浸漬条件、およびデータ解析パイプラインの標準化されたプロトコルが必要です。
- 構造生物学、創薬化学、およびデータ解析グループ間でのチームを横断した連携を伴います。
- スクリーニング条件下で、再現性のある高品質な結晶を得て維持できる標的に限定されます。
