Name: パターン化ニューロン上の神経膠芽腫幹細胞の共培養による移動と細胞相互作用の研究 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: 学ぶ神経膠芽腫細胞のパターン化ニューロン上での移動解析法。ラット海馬ニューロンを用いた共培養システムにより、侵襲性の定量化と臨床指標の評価が可能です。

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この研究はフォンダシオンARC 2020、リーグ・コントル・ル・ガン(コミテ・ド・ラ・ジロンド)、ARTC、プランガン2021、INCA PLBIOによって支えられていました。アルベオールはアジェンス・ナショナル・デ・ラ・レシェルシュ(グラント・ラベックス・ブレインANR-10-LABX-43)によってサポートされています。ジョリス・ギヨンはトゥールーズ大学病院(CHUトゥールーズ)からフェローシップを受けています。

インフォームド・コンセントは、すべての患者(地元の倫理委員会の規則に従って、ノルウェーのベルゲンのハウケランド病院から)から得られました。このプロトコルはボルドー大学の人間と動物の研究倫理委員会のガイドラインに従います.妊娠中のラットは、ボルドー大学の動物施設に収容され、治療されました.E18タイミングの妊娠ラットの安楽死は、CO2を用いて行った。すべての動物の手順は、制度上のガイドラインに従って行われ、地元の倫理委員会によって承認されています。すべての商用製品は、 資料一覧で参照されています。
1. パターン化されたスライドの準備
<ol><li>マイクロパフォーミング用基板調製<ol>
<li>18 mmの円形ガラスカバーリップを空気/プラズマ活性化で5分間処理します。1時間のデシケーターに100 μLのトリエトキシシラン(3-アミノプロピル)トリエトキシシランを用いて、カバースリップを閉じたチャンバーに入れます。</li>
		<li>10mMカーボネート緩衝液中のポリ(エチレングリコール)-スクシニミジルバレレート(分子量5,000(Peg-SVA))を100mg/mLでインキュベートし、pH>8、1時間用。超純水で広範囲にすすい、化学フードの下で乾燥させます。 注:この段階では、サンプルは暗い4°Cで保存して、さらに使用することができます。</li>
		<li>光新生剤、4-ベンゾイルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド(PLPP)をリン酸緩衝生理食塩分(PBS)に14.7mg/mLで加えます。 注: PLPP ゲルの濃縮形式も使用できます。これは、PEGブラシ(100 mJ/mm2)を劣化させるために必要な短い紫外線(UV)照明時間をもたらす。</li>
	</ol>
</li>
	<li>光新刺激体ゲル堆積物<ol>
<li>スライド中央に沈着するPLPPゲル3μLと無数エタノール50μLの混合物を調製します。絶対エタノールが完全に蒸発するまで、サンプルを化学フードの下に置きます。 注:この段階では、サンプルは暗い4°Cで保存して、さらに使用することができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ガラススライドマイクロパターニング<ol>
<li>ラダン室にカバースリップを取り付け、オートフォーカスシステムを装備した顕微鏡の電動ステージに置きます。</li>
		<li>想定されるマイクロパターンに対応する画像をソフトウェアにロードします。これらのパラメータを適用する:複製4 x 4回、200 μmの間隔、1,000 mJ/mm2のUV線量。自動UV照明シーケンスの後、PLPPを複数のPBSを洗い流して洗い流します。 注:PLPPゲルを使用した場合は、脱イオン水で広範な水を流して取り除き、N2の流れで乾燥し、4°Cで保管してください。</li>
		<li>ラミニン(PBSで50 μg/mL)を30分間インキュベートします。PBSで広範囲に洗います。 注:精製された緑色蛍光タンパク質(GFP、PBS中10μg/mL)の蛍光溶液をラミニンと混合して、蛍光顕微鏡でマイクロパターンを可視化することができます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 共培養のためのニューロンとGBM細胞の調製
<ol><li>胚性ラット海馬ニューロンの培養<ol>
<li>胚(E18)ラットの海馬を解剖し、ハンクのバランス塩溶液(HBSS)/1 mM 4-(2-ヒドロキシェチル)-1-ピペラジネタンスルホン酸(HEPES)/ペニシリンストレプトマイシン溶液に15mLチューブで組織を移管する。海馬を乾燥させることなく余分な溶液を除去する。</li>
		<li>ペニシリン(10,000単位/mL)/ストレプトマイシン(10,000 μg/mL)および1 mM HEPESを添加したトリプシンエチレン酢酸(EDTA)5 mLを加え、37°Cで15分間インキュベートします。 HBSS/HEPES/ペニシリンストレプトマイシン溶液で2倍洗浄し、この溶液中に2〜3分間組織を残します。</li>
		<li>2つの炎で磨かれたパスツールピペットを使用して組織を解約し、各組織で10倍上下にピペット化することで、発泡を最小限に抑えるように注意する。細胞を数え、細胞懸濁液の生存率を評価する。以下に示すように、マイクロパターン化されたカバーリップにニューロンをプレートします。 注:細胞生存率は抽出後85〜90%です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>マイクロパターン化されたカバーリップ上のニューロンの細胞培養<ol>
<li>PBSでマイクロパターン化ガラススライドを再水和し、完全な神経細胞培養培地をインキュベートする。</li>
		<li>E18スプレイグドーリーラットから得られた海馬ニューロンを、3%の馬血清で濃縮された神経基底培地(NBM)のcm2当たり50,000細胞の密度でマイクロパターン化ガラスカバースリップの上に直接種付けします。マイクロパターン化されたニューロンをインキュベーター(37°C、5%CO2)に48時間置きます。 注:〜6時間後、主要な海馬ニューロンは、ラミニンマイクロパターンに付着して見ることができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ニューロン上のヒトGBM幹細胞の共培養 注:この研究のために、膜GFP陽性および核トマト患者由来GBM細胞は、以前に公表されたプロトコル10に従って増殖した。<ol>
<li>スフェロイド状の細胞が懸濁液で成長するにつれて、200×gで5分間の懸濁液を遠心分離する。5 mLのPBSでスフェロイドを洗浄し、細胞を0.5 mLの細胞解離試薬(材料表参照)で37°Cで5分間インキュベートします。</li>
		<li>4.5 mLの完全なNBM(B27サプリメント、ヘパリン、線維芽細胞成長因子2、ペニシリン、ストレプトマイシンを補う)を加え、自動計数技術を使用して細胞を数える。</li>
		<li>3%の馬の血清で富化NBMの微パターン神経培養の上に1,000 GBMの細胞をシード。プレートを37°C、5%CO2、湿度95%でインキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ライブセルイメージング
<ol><li>GBM細胞の播種直後に、サーモスタットチャンバーを装備した反転顕微鏡のステージ上にサンプルを置きます。ソフトウェアの多次元取得ツールボックスを使用して、複数の位置を記録するための電動ステージを備えた顕微鏡でライブセルイメージングを行います。温度(37°C)およびガス制御(5%CO2)環境で20倍の目的で、12時間にわたって5分ごとに明視野および蛍光GFP/トマト画像を取得します。</li>
</ol>4. 画像解析
注: フィジーを使用して、IJ1 マクロ言語で記述された、2 次元 (2D) イメージ スタックは、半自動処理または、IJ1 マクロ言語で記述された、自家製のユーザー フレンドリツール (このアドレスで入手可能: https://github.com/Guyon-J/Coculture_Gliomas-Neurons/blob/main/README.md) を使用して処理されました (図 2A)。自動化されたワークフローと手順を 図 2Bに要約します。
<ol><li>神経回路ネットワーク解析 (図 2Bi)<ol>
<li>スタックのイメージを 1 つ選択します。 ネットワーク ツールを右クリックして、対応する [オプション] ダイアログ ボックスを開き、設定 ( しきい値 = トライアングル、Li、黄、 ガウス ブラー、 中央値 フィルタ = 1、2、3.) を調整して、画像の正確なセグメンテーションを作成します。次に 、[OK] をクリックします。</li>
		<li>[ネットワーク] ツールを左クリックすると、次の手順が自動的にアクティブになります。<ol>
<li>選択した画像を複製し、3 つのカラーチャンネル(レッドグレー-グリーン)に 分割 します。</li>
			<li>グレーのチャンネル(明視野)を選択し、異なる領域間の分離を強化するために コントラストストレッチエンハンスメント (CSE)を実行します。 Sobel エッジ ディテクタ (SED)を使用して、[ エッジの検索 ]コマンドですでにグループ化されている 2D 信号処理畳み込み操作を実行します。</li>
			<li>ダブルフィルタリング(F)の場合は、ガウスブラーと中央値フィルタを適用してノイズを低減し、オブジェクト信号を滑らかにします。黒のピクセル (セル領域) と白のピクセル (背景) を持つバイナリ画像 (BIN-グレー) を取得する調整されたしきい値アルゴリズムを実行してマスク (CM) に変換します。小さな非ネットワーク化されたパーティクルを除去することにより、セル領域を単純なネットワーク (NET) にスケルトン化(Sk) し、NET イメージ内のパーティクル (EP) をフィルター処理します。</li>
			<li>赤と緑のチャンネル(核と膜)の場合は 、二重フィルタリングを実行し、適合した閾値法 を使用してマスクに変換 し、[ パーティクルを分析]コマンドを使用して BIN-green で細胞の形態を決定できるようにします。</li>
			<li>関心領域 (ROI) を OR (結合 ) 演算子で使用するすべてのチャネルを結合し、初期色を単純な RGB 画像に再割り当てします。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>単細胞運動性解析(図2Bii)<ol>
<li>[単一セルトラッキング]ツールを右クリックして対応するオプションダイアログボックスを開き、設定を調整します(例えば、トレイルタイプ= 核または膜、しきい値= トライアングル、Li..、Z投影= 最大強度、合計スライス、ガウスブラーフィルタ、中央値フィルタ= 1、2、3.)を調整して、画像の正確なセグメンテーションを作成します。次に、[OK] をクリックします。</li>
		<li>[単一セルトラッキング]ツールを左クリックすると、次の手順が自動的にアクティブになります。<ol>
<li>グレーのチャンネルを削除します。時間(Tスタック)に応じてイメージスタックに対応する画像を生成するスタックに Z投影 を適用します。 ダブルフィルター し、セルによって残された軌跡を マスクに変換 します。小さなパーティクルを BIN-RED/緑のイメージに削除します。</li>
			<li>ROI を使用して、セル トレースの各輪郭を選択し、[オプション]ダイアログ ボックスの[エッジ検出をスキップ] チェックボックスをオンにして、後続の手順でこの前処理手順をスキップします。</li>
			<li>
元のスタック上の赤いチャネル(トレイルタイプ= nucleus)を分離します。1 つの ROI を選択し、外側の領域を削除します。すべての画像をダブルフィルターし、マスク(ビンレッド)に変換します。各二項核の重心X/Y位置を決定します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>スプレッドシート ソフトウェア13に対して既に公開されているマクロを使用して、このセルの平均平方変位、方向比、平均速度を計算します。</li>
	</ol></li>
	<li>多細胞追跡解析 (図 2Biii)<ol>
<li>トラッキングツールを右クリックして、対応するオプションダイアログボックスを開き、設定(閾値= トライアングル、Li、黄、ガウスブラー 、中央値フィルタ = 1、2、3.)など)を調整して、画像の正確なセグメンテーションを作成します。次に、[OK] をクリックします。</li>
		<li>追跡ツールを左クリックすると、次の手順が自動的にアクティブになります。<ol>
<li>グレーのチャンネルを削除します。</li>
			<li>
赤と緑のチャンネルを分割し、ダブルフィルタを行い、マスクに変換します。</li>
			<li>画像計算機を使用してチャンネルをマージ.コマンドはAND演算子で、膜内に見つかった核信号のみを残します。 注:フィジーのいくつかのプラグインは、同時にこのバイナリ前処理された画像内のいくつかのセルのX / Y位置を決定するために使用することができます( 資料表を参照してください)。</li>
		</ol>
</li>
		<li>先に説明したマクロ13を用いて、これらのセルの軌道プロット、平均平方変位、方向比、平均速度を計算する。</li>
	</ol></li>
	<li>ニューラルマット上のスフェロイド移動 (図2Biv)<ol>
<li>[移行] ツールを右クリックして、対応する[オプション]ダイアログ ボックスを開き、設定 (しきい値= トライアングル、Li、黄、ガウス ブラー 、中央値フィルター = 1、2、3.) を調整して、画像の正確なセグメンテーションを作成します。次に、[OK] をクリックします。</li>
		<li>移行ツールを左クリックすると、次の手順が自動的にアクティブになります。<ol>
<li>赤いチャンネルを削除します。</li>
			<li>
緑と灰色のチャンネルを分割します。</li>
			<li>グレーのチャンネルの場合は、手動でニューロンマットの輪郭を 描 き、その面積を測定します。</li>
			<li>緑のチャンネルでは、スタック をダブルフィルタ し、 マスクに変換します。パターンの外側の領域 (BIN) を削除し、各画像の二値化セル領域を決定します。 注: 上記のパラメータは、目的のアイコンを左クリックして値を変更することで調整されます。この処理は手動で行うことができます。ただし、多数の画像(取得あたり約100)、チャンネル(一般的には3チャンネル)、および処理ステップの場合は、自動化されたツールまたは半自動ツールが適しています。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Pasturel, A., Strale, P. -O., Studer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+common+hydrogels+into+3D+cell+culture+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Advance+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Tailoring common hydrogels into 3D cell culture templates.</a> Advance Healthcare Materials. 9, 2000519(2020).</li>
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</ol>

著者らは、利益相反はないと宣言している。

神経膠芽腫は、周囲の血管のコオプション、間質の侵略、またはWMTs18への侵入など、さまざまなモードを使用して広くパレンチマに侵入する。この後者のモードは、WMTの侵略に関連するインビトロまたはインビボモデルで適切な発見に困難があるため、文献で十分に特徴付けられていない。ここでは、培養げっ歯類ニューロンをラミニンコーティングされた表面にパターン化し、蛍光GBM幹細胞をニューロンの上に播種する簡略モデルが提案されている。この研究では、腫瘍細胞の付着、浸潤、増殖の解析を改善するために、グリッド形状パターンを用いた。GBM細胞は、これらの実験でラミニンであったマトリックス上で直接よりもニューロンの上に効率的に移動しました。記録処理を通してセル形状が変化し、同時にセル表面積が増加した。GBM幹細胞様細胞は、特定のシグナル経路(すなわち、NOTCH2/SOX2)4または分泌された因子およびニューロン自体からのシグナルの活性化を介してニューロン管によって引き付けられる可能性がある。このシステムは、GBM細胞とニューロン...

GBMを含む原発性悪性神経膠腫は壊滅的な腫瘍であり、GBM患者の中生存率は12〜15ヶ月である。現在の治療は、大規模な腫瘍大量切除術と化学療法に依存し、放射線療法と相まって、生存率を数ヶ月しか延長していない。治療障害は、血液脳関門(BBB)を横切る薬物送達不良と、血管内腔、髄液、およびWMTs1に沿った侵襲的な成長に密接に関連している。血管内侵入は血管の共同オプションとも呼ばれ、よく研究されたプロセスであり、分子機構が解明され始めています。しかし、WMTに沿ったGBM細胞浸潤のプロセスは十分に理解されていません。腫瘍細胞は、シェラーの二次構造に沿って健康な脳に移行する2.確かに、ほぼ1世紀前、ハンス・ヨアヒム・シェラーは、現在、脳血管内サテリトーシス、血管内サテリアトーシス、亜脈広がり、WMTに沿った侵略と呼ばれているGBMの侵襲的なルートを説明しました(図1A)。
一部のケモカインおよびその受容体は、例えば、間質細胞由来因子-1α(SDF1α)およびC-X-Cモチーフケモカイン受容体4(CXCR4)など、血管内皮増殖因子(VEGF4)には関与していないが、WMT浸潤因子3に関与しているようである。さらに最近では、細胞内NOTCH1-SOX2軸がGBM細胞4のWMT浸潤において重要な経路であることが示されている。著者らは、GBM幹細胞が部分的に非髄鞘のニューロン上で脳のパレンチマに侵入する方法を説明し、GBM細胞によるミエリン鞘の破壊を示唆した。2019年に3つの論文が連続してネイチャージャーナルに掲載され、グリオーマ開発における電気活動の役割を強調したマイルストーンに達しました5,6.Monjeと共同研究者による精細な研究は、神経膠腫の発達を促進するニューロリジン-3の分泌における電気活動の中心的な役割に光を当てた。
ウィンクラーと共同研究者は、侵襲的なステップにおいて重要であるGBM細胞(マイクロチューブ)間の接続、および最近、新たに記述された神経神経膠腫シナプスを介したGBM細胞とニューロン間の相互作用について説明した。これらの構造は、α-アミノ-3-ヒドロキシ-メチル-4-イソキサゾアプロピオン酸(AMPA)受容体のグルタミン酸刺激を好み、腫瘍の発生と浸潤を促進するGBM細胞膜に位置する。腫瘍細胞浸潤は、GBM患者において観察される転移または遠隔二次病巣の普及における中心的なプロセスである。トロンボシン−1のようなGBMの浸潤において重要であることがいくつかの要因が同定されている、変換成長因子β(TGFβ調節されたマトリセルタンパク質、またはケモカイン受容体CXCR3)7、8。
ここでは、ニューロンがラミニンの軌跡にパターン化され、GBM細胞が単一細胞またはスフェロイドとして播種されるGBMの浸潤を研究するための単純化されたバイオミメティックモデルが説明されている(図1B)。2つの実験設定は、GBM9、10、11で観察されるニューロンへの侵入を再現することを目的としています。このようなモデルは、機械的または化学的特性12を調節することによって細胞移動を研究することを可能にするアライメントナノファイバー生体材料(コアシェルエレクトロスピニング)として過去に開発されてきた。この記事で説明する共培養モデルは、このプロセスに関与する新しい分子経路を定義することによって、GBM細胞がニューロン上で脱出する方法をよりよく理解することを可能にする。

<table><tbody><tr><td>(3-アミノプロピル) トリエトキシシラン</td><td>シグマ</td><td>440140-100ML</td><td>アミノ基は、mPEG-SVA</td></tr><tr><td>96ウェル丸底プレート</td><td>Sarstedt</td><td>2582624</td><td>スフェロイドの調製に使用</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Gibco</td><td>A11105-01</td><td>-20 °C で保存;C(長期)または4°;C (短期)、球体解離酵素</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587</td><td>-20 °C;C、使用前に解凍</td></tr><tr><td>基本的な線維芽細胞成長因子</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>-20 °Cで保存;C、使用前に解凍</td></tr><tr><td>Countess Cell Counting ChamberSlides</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>細胞計数に使用</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Marienfeld</td><td>111580</td><td>細胞培養基質</td></tr><tr><td>デシケーターカートリッジ</td><td>シグマ</td><td>Z363456-6EA</td><td>(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン治療中にmostureを減らすために使用</td></tr><tr><td>DPBS 10x</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-53-500</td><td>4で保存&deg;C</td></tr><tr><td>フィジーのソフトウェア、MTrack2 macro</td><td>ImageJ</td><td></td><td>写真の分析に使用</td></tr><tr><td>Flask 75 cm&sup2;</td><td>Falcon</td><td>10497302</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H8264-500ML</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム</td><td></td><td>ΣH3149-100KU</td><td>4°Cで保存。C</td></tr><tr><td>Laminin</td><td></td><td>114956-81-9</td><td>ニューロンの接着を促進します</td></tr><tr><td>Leonardoソフトウェアの</td><td></td><td></td><td>ロード 想定されたマイクロパターンの</td></tr><tr><td>MetaMorph ソフトウェア&nbsp;</td><td>Molecular Devices LLC</td><td>NA</td><td>顕微鏡自動化ソフトウェア</td></tr><tr><td>メチルセルロース</td><td>Sigma</td><td>M0512</td><td>NBMで希釈して最終濃度 2%</td></tr><tr><td>神経基礎培地</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>4°Cで保存。C</td></tr><tr><td>Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA)</td><td></td><td></td><td>電動ステージ付き倒立顕微鏡&nbsp;</td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>4°Cで保存;C</td></tr><tr><td>PLPP</td><td>Alveole</td><td>PLPPclassic_1ml</td><td>PEGブラシの分解に用いる光開始剤</td></tr><tr><td>Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA)</td><td>Laysan Bio</td><td>VA-PEG-VA-5000-5g</td><td>防汚コーティングとして使用</td></tr><tr><td>PRIMO</td><td>Alveole</td><td>PRIMO1</td><td>DMD(デジタルマイクロミラーデバイス)系UV投射装置</td></tr><tr><td>トリパンブルー 0.4%</td><td>ThermoFisher</td><td>T10282</td><td>細胞カウントに使用</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA</td><td>シグマ</td><td>T4049-100ML</td><td>接着細胞の剥離に使用</td></tr></tbody></table>

パターン化ニューロン上の神経膠芽腫幹細胞の共培養による移動と細胞相互作用の研究

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

グレードIV悪性神経膠腫(GBM)は、その積極的な特性のためにヒト癌の最も致命的なタイプの一つです。これらの腫瘍の遺伝学の有意な進歩にもかかわらず、GBM細胞が健康な脳のパレンチマに侵入する方法はよく理解されていない。特に、GBM細胞が異なる経路を介して心房に侵入することが示されている。本稿の主な関心事は、白物庫(WMT)に沿った経路である。腫瘍細胞と腹分神経細胞成分との相互作用は十分に特徴付けられていない。本明細書において、GBM細胞浸潤に対するニューロンの影響を評価する方法が記載されている。本論文は、ニューロン上のGBM幹細胞様細胞の移動を解析することによってWMTの侵入を模倣する、高度な共培養イン・ニューロンを紹介する。ニューロンの存在下でのGBM細胞の挙動は、オープンソースおよびフリーアクセスソフトウェアを用いた自動追跡手順を使用して監視される。この方法は、多くの用途、特に機能的および機械学的研究、ならびにニューロンに対するGBM細胞の移動をブロックすることができる薬理学的薬剤の影響を分析するのに有用である。

蛍光GBM細胞と共培養したパターン化されたニューロンは、プロトコルセクションに記載されているように調製し、追跡実験を行った。GBM細胞は、ニューロン上で移行しながら、それらの形状を素早く変更しました(図1B:パネル6 と ビデオ1)。細胞は、ランダムな動きで、ニューロンの拡張に沿って移行しました (ビデオ 1).蛍光GBM細胞と非蛍光ニューロンは容易に区別することができ、これはプロトコルセクション(図2)に記載されているように、フィジーマクロを使用して細胞の動きを追跡することを可能にした。フィジーは、画像処理と分析を容易にするオープンライセンスソフトウェアです。多数の画像の分析に比較的時間がかかる手動プロシージャは、マクロで自動化できます。画像は、ドラッグアンドドロップの手順でインポートされ、処理され、定量化され、ROIマネージャを使用して利用可能なデータが生成されます。
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ここでは、パターン化されたニューロン上で神経膠芽腫(GBM)の移行を分析するための使いやすい共培養アッセイを提示する。我々は、ニューロン上のGBM細胞移動を容易に定量化するためのFiJiソフトウェアでマクロを開発し、ニューロンがGBM細胞侵襲能力を変更することを観察した。

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

神経膠芽腫は、高い侵襲性プロファイルを持つ壊滅的な脳腫瘍です。この共培養システムは、神経膠芽腫細胞の移動を模倣して、患者で観察された侵襲的経路の1つを再現する。共培養モデルの幾何学と組成は、精密に制御されています。それはよりよい再現性および複雑な生物学的プロセスの簡単な定量化を促進する。この方法は、解化したばかりの神経膠芽腫細胞およびニューロンを共培養することによって臨床診断に適応することができる。これは、臨床指標を定義します, 臨床結果として非常に重要です.この方法は、線維芽細胞や免疫細胞などの他の移動細胞を定量化するためにも使用できます。この手順をデモンストレーションするのは、私のチームの博士課程の学生、ジョリス・ギヨンです。マイクロパターニング用の基板を作るために、18ミリメートルの円形ガラスカバーリップを空気またはプラズマ活性化で5分間処理してから、100マイクロリットルのトリエトキシシランを付けたデシケーターにカバースリップを1時間置き、PEG-SVAの溶液を1ミリリットル当たり100ミリグラムで1時間インキュベートします。ゲル沈着の場合、インキュベーションの終わりに、PLPPの3マイクロリットルと50マイクロリットルの絶対エタノールをスライドの中央に加え、完全に乾燥するまで待ちます。ガラススライドのマイクロパターニングの場合、カバースリップをLudinチャンバーに取り付け、自動焦点システムを装備した顕微鏡のステージにチャンバーを配置します。イメージングの後、マイクロパターンイメージをソフトウェアにロードします。自動UV照明シーケンシングの後、ピペットを使用して、PBSで広範囲にカバースリップからPLPPを洗浄します。その後、ラミニン1ミリリットル当たり50マイクログラムでカバースリップを30分間インキュベートし、続いてPBSで別の洗浄を行います。マイクロパターンのカバーリップ上に胚性ラット海馬ニューロン培養をセットアップするには、最後の洗浄後、神経細胞培養培地でガラススライドを再水和する。種子50〜第4ラット海馬ニューロンは、摂氏37度で5%の二酸化炭素インキュベーターで24時間インキュベートのために各マイクロパターン化カバースリップに平方センチメートルあたり3%馬の血清で濃縮神経基底培地に懸濁した。遠心分離機は、1,000RPMで5分間神経膠芽腫細胞を解約し、グリオブトーマ細胞培地中のペレットを再懸濁し、次いでマイクロパターン化されたニューロン上に10回3番目のGBM細胞に沈着した。細胞の生きた細胞イメージングのために、37°Cのサーモスタットチャンバーを備えた逆顕微鏡のステージに共培養を置き、20X目的を選択します。次に、顕微鏡ソフトウェアの多次元取得ツールボックスを使用して、ニューロンを持つパターンの数に基づいて、16の異なる位置で12時間

co-culture-glioblastoma-stem-like-cells-on-patterned-neurons-to-study

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

がん幹細胞の移動を調査するための区分するマイクロ流体デバイスが記載されている。この小説のプラットフォームは、生存細胞の微小環境を作成し、生細胞運動の微視的な可視化を可能にします。非常に運動性のがん細胞は、潜在的に、より効果的な将来の治療法につながる積極的な浸潤の分子メカニズムを研究するために隔離されています。...

区分するマイクロ流体デバイスとライブセルイメージングを使用した癌幹細胞の移行の評価

このビデオは、神経膠芽腫幹様細胞が腫瘍周囲腔のニューロン上を移動するときに、有髄ニューロン路の浸潤を模倣する、マイクロパターンニューロン上の神経膠芽腫細胞の共培養アッセイについて説明しています。このアッセイは、神経膠腫のニューロンに対する膠芽腫細胞の遊走を阻害する薬理学的薬剤の効果を解析するのに役立ちます。...

パターン化ニューロン上の神経膠芽腫細胞の共培養:ラット海馬ニューロン上の神経膠芽腫細胞の移動をin vitroでモニターする技術

癌細胞との器官型脳切片の共培養は、脳組織の癌細胞浸潤の過程で蛍光だけでなく、明視野（ビデオ）顕微鏡によって形態学的変化を可視化することができます。このモデル系は、細胞の交換や補充的なアプローチを可能にし、操作及び分析を幅広く提供しています。...

器官型脳スライスと癌細胞の3Dスフェロイドとの共培養システム

無血清神経球培地における解離された高等度神経膠腫外科標本の伝播のためのプロトコルは、癌幹細胞表現型を有する細胞に対して選択する。神経球として成長できない標本については、代替プロトコルが提案される。免疫細胞化学のための3D神経球アーキテクチャを維持するためのパラフィン埋め込み技術について説明する。...

臨床関連動物モデルおよび3D免疫化学における使用のための外科検体からのハイグレード神経膠腫細胞培養の最適化

神経膠芽腫（GBM）の現在のex vivoモデルは、ヒト腫瘍浸潤の生理学的に関連する研究のために最適化されていない。ここでは、我々は、新鮮なヒトGBM組織からの器官型スライス培養物の生成および維持のためのプロトコールを提示する。経時顕微鏡法および定量的細胞移動分析技術の説明が提供される。...

腫瘍細胞移動の研究および抗浸潤性薬物の患者特異的効果の研究のためのヒト神経膠芽腫の器官型スライス培養モデル

癌の悪性挙動を理解するには、腫瘍細胞がマクロファージなどの腫瘍微小環境の構成要素とどのように相互作用するかについての正確なモデルを作成する必要があります。ここでは、膠芽腫細胞と腫瘍関連マクロファージおよびミクログリアとの相互作用を研究するための2つの方法について説明し、膠芽腫の浸潤への影響が評価されます。...

共培養アッセイは、神経膠芽腫の浸潤のマクロファージとミクログリアの刺激を研究します

ここでは、移行と時間をかけて、複数の治療条件下で神経膠腫脳腫瘍幹細胞の侵入を定量化する生細胞イメージング技術について述べる。...

住セルイメージ投射アッセイ研究神経膠腫脳腫瘍幹細胞の遊走と浸潤に

ここでは、ヒトグリオーマ細胞(hGC)移行をリアルタイムで研究するためのex-vivo混合単層培養システムを提示する。このモデルは、区画化されたチャンバー内のhGCと骨髄化した軸索と非骨髄化軸の間の相互作用を観察する能力を提供する。...

後根神経節軸軸索-オリゴデンドロサイト共培養におけるヒトグリオーマ細胞移動のリアルタイムモニタリング

ここでは、神経膠芽腫に対する使いやすい侵入アッセイについて述べています。このアッセイは、神経膠芽腫幹細胞に適しています。侵略、移動、および拡散を容易に定量化するためのフィジーのマクロも説明されています。...

神経膠芽腫の3次元スフェロイドモデル

新たに診断され再発した腫瘍から生成された患者由来の磁気膠腫を用いて、3次元膠芽腫移動モデルを提示します。このプラットフォームは、患者特有の移動動態の可視化と治療効果の評価を可能にします。このアッセイは移動後に多重化され、タンパク質の局在化や発現パターンを評価することができます。...

磁気ナノ粒子媒介の球状定在を用いた低酸素条件下での再現可能な3D膠芽腫移動アッセイ

学ぶ神経膠芽腫細胞のパターン化ニューロン上での移動解析法。ラット海馬ニューロンを用いた共培養システムにより、侵襲性の定量化と臨床指標の評価が可能です。

パターン化ニューロン上の神経膠芽腫幹細胞の共培養による移動と細胞相互作用の研究

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