Name: 3次元バイオリアクター培養による滑液間葉系幹細胞由来エクソソームの大規模調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: 学ぶ3次元バイオリアクターによる滑液間葉系幹細胞由来エクソソームのGMPグレード大量調製法。遠心分離、フローサイトメトリー、ウエスタンブロッティングを用いて、関節炎治療とエクソソーム生物学研究への応用可能性を示す。

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中国国家自然科学基金会(第81972116号、第81972085号、第81772394号);広東省自然科学財団の主要プログラム(No.2018B0303110003);広東省国際協力プロジェクト(No.2021A0505030011);深セン科学技術プロジェクト(No.GJHZ20200731095606019、いいえ。JCYJ20170817172023838, No.JCYJ20170306092215436, No.JCYJ20170413161649437);中国ポスドク科学基金会(No.2020M682907);広東省基礎応用基礎研究財団(No.2021A1515010985);深センの三明医学プロジェクト(SZSM201612079);広東省の高レベル病院の建設のための特別基金。

この研究は、深セン第二人民病院の人間倫理委員会によって承認されました。 インビトロ プロトコルでhSF-MSCから単離されたエキソソームの概略図を 図1に示します。
1. ヒトSF-MSCの培養と同定
<ol><li>臨床OA患者から注射器と針を使用して20mLのSFを採取します。<ol><li>OA患者の膝関節を消毒します。膝蓋骨の外側の大腿四頭筋腱から7#針で関節腔に穿刺します。</li>
		<li>関節液10mLを抽出します。輸血スティックで穿刺部位を覆い、5分間押します。</li>
	</ol></li>
	<li>SF上清を1,500 x g で4°Cで10分間遠心分離した後、廃棄する。</li>
	<li>細胞ペレットを10 mLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で再懸濁し、1,500 x g で4°Cで10分間遠心分離し、PBSを廃棄します。</li>
	<li>ペレットを10 mLのヒトMSC培地で細胞密度5 x 104 cells/mLで再懸濁し( 材料表を参照)、懸濁液を100 mmディッシュにプレートします。</li>
	<li>5%CO2を含む雰囲気下で37°Cでディッシュをインキュベートする。</li>
	<li>48時間後、培地を交換して非接着細胞を除去し、1x PBSで洗浄します。3日ごとに2週間培地を交換してください。</li>
	<li>細胞培養上清を採取する。</li>
	<li>フローサイトメトリーを用いてSF-MSCを同定します。<ol><li>第3世代(P3)のSF-MSCを消化し、1,000 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を捨て、細胞ペレットを回収する。 注:継代は、別の培養皿への細胞の継代培養として認識されます。SFから単離され、ディッシュに播種された初代細胞は、継代ゼロ(P0)としてラベル付けされます。約75%のコンフルエントで、細胞は消化され、ディッシュから切り離され、他のディッシュに播種され、P1として標識されます。</li>
		<li>400 μLのブロッキングバッファー(1x PBS中の1%BSA)をセルペレット(5 x 104)に加え、室温(RT)で15分間静置します。</li>
		<li>1,000 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを100 μLの1x PBSに再懸濁します。</li>
		<li>チューブあたり1 μLのCD105、CD73、CD90、CD45、CD34、HLA-DRモノクローナル蛍光抗体(希釈比1:100)( 材料の表を参照)を加え、RTで30分間インキュベートします。</li>
		<li>1x PBSで2回洗浄し、上清を廃棄します。細胞ペレットを回収し、100 μLの1x PBSに再懸濁します。</li>
		<li>525/50および585/40のフィルターを使用して最大10,000個の細胞をフローサイトメーターで検出し、蛍光色素を検出します。</li>
	</ol></li>
</ol>2.3Dバイオリアクター細胞培養
<ol><li>マイクロキャリアの調製<ol><li>乾燥した0.75 gのマイクロキャリア( 材料の表を参照)を膨潤させ、1xダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)(50 mL / gのマイクロキャリア)でRTで少なくとも3時間水和します。</li>
		<li>上清をデカントし、新鮮なDPBS(50 mL/gのマイクロキャリア)でマイクロキャリアを5分間洗浄します。PBSを廃棄し、新しい1x DPBS(50 mL / gのマイクロキャリア)と交換します。</li>
		<li>マイクロキャリアをオートクレーブ滅菌(121°C、15分、15psi)します。滅菌したマイクロキャリアを沈降させ、上清をデカントします。</li>
		<li>培養液中のマイクロキャリア(50 mL/gのマイクロキャリア)をRTで短時間すすぎ、マイクロキャリアを沈降させ、上清を廃棄します。</li>
	</ol></li>
	<li>灌流バイオリアクター<ol><li>オートクレーブ(121°C、15分、15psi)によってバイオリアクターを滅菌します。</li>
		<li>SF-MSCの数を数え、GMPグレードのMSC培養液(250 mL)を灌流したバイオリアクターに2.5 x 107 SF-MSC とマイクロキャリアを割り当てます。</li>
		<li>バイオリアクターを37°Cで5%CO2 の入ったインキュベーターに入れる。 バイオリアクターを15rpmの速度で回転させます。6日ごとに培地を交換してください。</li>
		<li>14日間の培養後、さらなる分析のために細胞培養上清とマイクロキャリアを収集します。</li>
	</ol></li>
</ol>3. エクソソーム同定と安全性検出
<ol><li>超遠心<ol><li>細胞培養上清を300 x g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を回収します。細胞の破片を捨てます。</li>
		<li>上清を2,000 x g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を回収します。より大きな小胞(アポトーシス小体といくつかの大きな微小小胞)を捨てます。</li>
		<li>上清を10,000 x g で4°Cで30分間遠心分離し、より大きな小胞を除去します。ペレットを収集し、40 mLの1x PBSに再懸濁します。</li>
		<li>再懸濁したペレットを120,000 x g で4°Cで70分間遠心分離し、上清を廃棄し、エキソソームを含むペレットを500 μLの1x PBSに再懸濁します。</li>
	</ol></li>
	<li>ナノ粒子追跡分析(NTA) 注:各実行について、500 μLのサンプルを30 μL/分の流速でチャンバーに注入しました。24.4°C〜24.5°Cで分析を実行します。<ol><li>新たに単離したエキソソームサンプルを滅菌1x PBSで107-10 9 / mLの粒子を含む1 mLに希釈し、ナノ粒子追跡分析システムに注入します( 材料の表を参照)。</li>
		<li>メーカーのプロトコルに従って、キャプチャおよび分析システムを手動で設定します。レーザー光散乱によって粒子を視覚化し、デジタルビデオでブラウン運動をキャプチャします。</li>
		<li>実行ごとに少なくとも200個の個々の粒子を追跡することに基づいて、ソフトウェア( 材料表を参照)を使用して記録されたビデオテープを分析します。</li>
	</ol></li>
	<li>透過型電子顕微鏡<ol><li>エキソソームを4%パラホルムアルデヒド(冷たい1x DPBS)で5分間固定します。</li>
		<li>5 μLのエキソソームを銅グリッドにマウントします。この実験では、エクソソームの濃度はタンパク質アッセイキットによって1 mg / mL定量されます( 材料の表を参照)。</li>
		<li>エキソソームを3%リンタングステン酸に氷上で10分間埋め込みます。余分な酸を取り除き、RTでサンプルを乾燥させます。</li>
		<li>エキソソームサンプルをTEMにより加速電圧100kVでイメージングします。</li>
	</ol></li>
	<li>ウェスタンブロッティング<ol><li>300 μLの溶解バッファー(1% Triton X-100、0.1% SDS、0.1 M Tris HCl、pH 7)およびプロテアーゼ阻害剤カクテル( 材料の表を参照)をエキソソームに加えます。</li>
		<li>エキソソームを溶解バッファー中で上下にピペッティングして混合し、氷上に20分間静置します。</li>
		<li>混合物を9,391 x g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を回収します。タンパク質アッセイキットを使用してタンパク質濃度を測定します( 材料表を参照)。</li>
		<li>100 μLの4xタンパク質ローディングバッファーを加え、100°Cで10分間加熱します。</li>
		<li>15 μLのタンパク質を10 mg/mLの濃度でロードし、ゲル電気泳動(120 V、70分)および100 V、4°Cで60分のエレクトロブロッティングで実行します。</li>
		<li>非エキソソーム特異的マーカー(カルネキシン)およびエキソソームバイオマーカー(CD9、CD63、およびCD81)を蛍光ウェスタンブロッティングで検出します( 材料の表を参照)。</li>
	</ol></li>
	<li>安全性試験<ol><li>細菌、真菌、結核 菌 を検出するには、手順3.5.2〜3.5.5に従います。</li>
		<li>100 μLのエキソソーム溶液(1 mg/mL)を血液寒天培養プレート( 材料表参照)に播種し、培養プレートを37°Cで24時間インキュベートします。</li>
		<li>100 μLのエキソソーム溶液(1 mg/mL)をサブロー寒天培地プレート( 材料の表を参照)に播種し、35°Cで48時間インキュベートします。</li>
		<li>100 μLのエキソソーム溶液(1 mg/mL)をローウェンスタイン・ジェンセン培養培地プレート( 材料の表を参照)に播種し、37°Cで3週間インキュベートします。</li>
		<li>細菌、真菌、 結核菌 群のコロニーの出現を巨視観察により検出します。 注:エクソソームの安全性を評価するための基準は、培養プレート上に微生物が存在しないことです。</li>
		<li>マイコプラズマを検出するには、手順3.5.7〜3.5.9に従います。</li>
		<li>キットに含まれている50 μLの緩衝液にエキソソームを再懸濁し、95°Cで3分間加熱します。</li>
		<li>PCRマイコプラズマ検出キットを使用して、エキソソーム溶液中のマイコプラズマを増幅します(材料の表を参照)。</li>
		<li>1.5% アガロースゲル電気泳動 (30 分、120 V) で PCR 産物を検出します。</li>
	</ol></li>
</ol>4. インビトロ エクソソーム機能検出
<ol><li>エキソソーム標識<ol><li>100 μLのエキソソーム(1 mg/mL)を1 mM Dil(1000x)で標識し( 材料の表を参照)、RTで30分間インキュベートします。</li>
		<li>100,000 x g で70分間の超遠心によりエキソソームを回収します。ペレットを500 μLの1x PBSに再懸濁します。</li>
	</ol></li>
	<li>Cy3-miR-140模倣体のエキソソームへの装填<ol><li>1 μg/μLのエキソソームタンパク質と5 μmol/mLのCy3-miR-140を最終容量400 μLのエレクトロポレーションバッファー(1.15 mMリン酸カリウム(pH 7.2)、25 mM塩化カリウム、21%(v/v))に混合します( 材料の表を参照)。</li>
		<li>混合物を冷たい0.4 cmエレクトロポレーションキュベットに移し、遺伝子トランスフェクションシステムを使用して300 V/100 μFの容量でエレクトロポレーションします(材料の表を参照)。</li>
		<li>エレクトロポレーションの直後に、混合物をRTで30分間維持して、エキソソーム膜が完全に回復することを確認します。</li>
		<li>混合物を1単位のRNase A( 材料の表を参照)で20分間処理して、エクソソーム外のmiRNA模倣物を除去します。</li>
		<li>エキソソーム混合物を120,000 x g で90分間超遠心し、上清を廃棄して、500 μLの1x PBSにエキソソームを再懸濁します。</li>
	</ol></li>
	<li>エキソソーム取り込みアッセイ<ol><li>軟骨細胞(1 x 107)を35 mmの共焦点ディッシュに、10%FBSを含む1 mLのDMEM/F12で播種します。</li>
		<li>24時間後、軟骨細胞をDiI標識エキソソーム(100 ng / mL)またはcy3-miR-140ロードエキソソーム(100 ng / mL)で1時間処理します。</li>
		<li>1x PBSで3回洗浄した後、DAPI(10 ng / mL)でRTで10分間ラベルを付けます。</li>
		<li>適切なフィルターを使用して、共焦点レーザー走査型蛍光顕微鏡(CLSM)で蛍光信号を記録します(材料表を参照)。</li>
	</ol></li>
</ol>5.統計分析
<ol><li>適切な統計ソフトウェアを使用して統計分析を実行します。 注:各図の代表データは、SD±平均値として表した。スチューデントのt検定は、統計ソフトウェアを使用して2つのグループを比較するために使用されました。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの多重分布は、複数のグループ間の比較の場合に実行されました。P 値は <0.05 (*)、<0.01 (**)、または <0.001 (***) です。</li>
</ol>

<ol><li>Cross, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+burden+of+hip+and+knee+osteoarthritis%3A+estimates+from+the+global+burden+of+disease+2010+study%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).</li>
<li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritis%3A+a+disease+of+the+joint+as+an+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis & Rheumatology. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li>
<li>Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlike+bone%2C+cartilage+regeneration+remains+elusive%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Unlike bone, cartilage regeneration remains elusive.</a> Science. 338 (6109), 917-921 (2012).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+recruitment+of+endogenous+stem+cells+and+chondrogenic+differentiation+by+a+composite+scaffold+containing+bone+marrow+homing+peptide+for+cartilage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Increased recruitment of endogenous stem cells and chondrogenic differentiation by a composite scaffold containing bone marrow homing peptide for cartilage regeneration.</a> Theranostics. 8 (18), 5039-5058 (2018).</li>
<li>Ogura, T., Bryant, T., Merkely, G., Mosier, B. A., Minas, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+analysis+of+revision+autologous+chondrocyte+implantation+for+failed+ACI%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Survival analysis of revision autologous chondrocyte implantation for failed ACI.</a> American Journal of Sports Medicine. 47 (13), 3212-3220 (2019).</li>
<li>Welch, T., Mandelbaum, B., Tom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+chondrocyte+implantation%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Sports+Medicine+and+Arthroscopy+Review%22%5BJournal%5D)">Autologous chondrocyte implantation: past, present, and future.</a> Sports Medicine and Arthroscopy Review. 24 (2), 85-91 (2016).</li>
<li>McGonagle, D., Baboolal, T. G., Jones, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+joint-resident+mesenchymal+stem+cells+for+cartilage+repair+in+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Native joint-resident mesenchymal stem cells for cartilage repair in osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 13 (12), 719-730 (2017).</li>
<li>Jo, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-articular+injection+of+mesenchymal+stem+cells+for+the+treatment+of+osteoarthritis+of+the+knee%3A+a+proof-of-concept+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Intra-articular injection of mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis of the knee: a proof-of-concept clinical trial.</a> Stem Cells. 32 (5), 1254-1266 (2014).</li>
<li>Pers, Y. M., Ruiz, M., Noël, D., Jorgensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+for+the+management+of+inflammation+in+osteoarthritis%3A+state+of+the+art+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells for the management of inflammation in osteoarthritis: state of the art and perspectives.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (11), 2027-2035 (2015).</li>
<li>Neybecker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+potentialities+for+cartilage+repair+from+human+advanced+knee+osteoarthritis+synovial+fluid-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo potentialities for cartilage repair from human advanced knee osteoarthritis synovial fluid-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 329(2018).</li>
<li>Jia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic-activated+cell+sorting+strategies+to+isolate+and+purify+synovial+fluid-derived+mesenchymal+stem+cells+from+a+rabbit+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and purify synovial fluid-derived mesenchymal stem cells from a rabbit model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).</li>
<li>Phinney, D. G., Pittenger, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+MSC-derived+exosomes+for+cell-free+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: MSC-derived exosomes for cell-free therapy.</a> Stem Cells. 35 (4), 851-858 (2017).</li>
<li>Phan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+mesenchymal+stem+cells+to+improve+their+exosome+efficacy+and+yield+for+cell-free+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Engineering mesenchymal stem cells to improve their exosome efficacy and yield for cell-free therapy.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1522236(2018).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+international+society+for+cellular+therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li>
<li>Lv, F. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+the+surface+markers+and+identity+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 32 (6), 1408-1419 (2014).</li>
<li>Samsonraj, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+Multifaceted+characterization+of+human+mesenchymal+stem+cells+for+use+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (12), 2173-2185 (2017).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells for regenerative medicine.</a> Cells. 8 (8), (2019).</li>
<li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+derived+from+human+neural+stem+cells+stimulated+by+interferon+gamma+improve+therapeutic+ability+in+ischemic+stroke+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Advanced+Research%22%5BJournal%5D)">Exosomes derived from human neural stem cells stimulated by interferon gamma improve therapeutic ability in ischemic stroke model.</a> Journal of Advanced Research. 24, 435-445 (2020).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+ability+and+Toll-like+receptor+expression+of+human+mesenchymal+stem+cells+improves+significantly+after+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Migration ability and Toll-like receptor expression of human mesenchymal stem cells improves significantly after three-dimensional culture.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 491 (2), 323-328 (2017).</li>
<li>Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+spheroid+formation+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+chitosan+films+on+stemness+and+differentiation+capabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities.</a> Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).</li>
<li>Guo, L., Zhou, Y., Wang, S., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+changes+of+mesenchymal+stem+cells+in+three-dimensional+%283D%29+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Epigenetic changes of mesenchymal stem cells in three-dimensional (3D) spheroids.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (10), 2009-2019 (2014).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+administration+of+cell-free+exosomes+generated+by+human+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+cultured+under+2D+and+3D+conditions+improves+functional+recovery+in+rats+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Systemic administration of cell-free exosomes generated by human bone marrow derived mesenchymal stem cells cultured under 2D and 3D conditions improves functional recovery in rats after traumatic brain injury.</a> Neurochemistry International. 111, 69-81 (2017).</li>
<li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+of+MSCs+produces+exosomes+with+improved+yield+and+enhanced+therapeutic+efficacy+for+cisplatin-induced+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture of MSCs produces exosomes with improved yield and enhanced therapeutic efficacy for cisplatin-induced acute kidney injury.</a> Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 206(2020).</li>
</ol>

著者は、競合する経済的利益はないと宣言しています。

間葉系幹細胞は、その自己複製、特殊な機能を有する組織細胞への分化、およびパラクリン効果により、再生医療において広く利用されてきた16,17。特に、エクソソームが及ぼすパラクリン効果が大きな注目を集めている18。エクソソームは間葉系幹細胞の生体情報を運び、その生物学的機能を果たし、面倒な保管や出荷などのMSCの欠点を克服します。このように、間葉系幹細胞由来のエクソソームは、OA療法において最も注目されている治療介入に用いられている。
現在、MSCを増殖させるには、2D培養と3次元(3D)培養の2つの方法があります19。2D培養は、低コストでin vitro研究用のMSCを培養する従来の方法です。ただし、時間がかかり、規模の可能性が限られています。また、2D微小環境でのMSCの伝播は、MSCの最も重要な特性の1つであるステムネス<sup class="xre...

関節軟骨とその根底にある骨の破壊に起因する変形性関節症(OA)は、障害につながる深刻な課題であり続けています1,2。血液と神経の供給がなければ、軟骨の自己治癒能力は一度損傷すると最小限になります3,4。過去数十年で、自家軟骨細胞移植(ACI)に基づく治療法は、OA治療においてある程度の進歩を遂げました5。軟骨細胞の単離と拡張のためには、OA関節の非体重支持領域から小さな軟骨を採取する必要があり、軟骨に損傷を与えます。また、この手順は、拡張した軟骨細胞6を移植するための第2の操作を必要とするであろう。したがって、軟骨損傷のないOA治療のためのワンステップ療法が広範囲に検討されています。
間葉系幹細胞(MSC)は、OA治療の有望な代替手段として示唆されています7,8。複数の組織に由来するMSCは、特定の刺激で軟骨細胞に分化することができます。重要なことに、間葉系幹細胞は抗炎症を介して免疫応答を調節することができます9。したがって、間葉系幹細胞は、軟骨欠損を修復し、特に炎症環境において免疫応答を調節することにより、OA治療において大きな利点を有する。OA治療では、滑液由来のMSC(SF-MSC)は、他のMSCソースよりも軟骨細胞分化能が強いため、最近注目を集めています10,11。特に整形外科クリニックでは、関節腔からの炎症性SFの抽出は、OA患者の疼痛症状を緩和するための日常的な治療法です。抽出された炎症性SFは、通常、医療廃棄物として処分される。患者と医師の両方が、炎症性SFから分離された自家間葉系幹細胞を、倫理的葛藤がほとんどないOA治療と見なす準備ができています。ただし、SF-MSC療法は、腫瘍形成のリスク、長期保存、および遠隔輸送の障壁のために損なわれます。
MSCを含む多くの細胞タイプによって分泌されるエキソソームは、親細胞の生体情報の大部分を運びます。無細胞療法として詳細に検討されている12、13。臨床試験政府(ClinicalTrials.gov)のウェブサイトで入手可能な最新のリソースによると、癌、高血圧、および神経変性疾患の研究分野で、より広範なエキソソーム臨床試験が開始され、実施されています。SF-MSCエキソソーム治療は、OAに対処するための刺激的で挑戦的な試験になる可能性があります。適正製造基準(GMP)グレードの大規模なエキソソーム生産は、臨床翻訳に不可欠です。小規模なエキソソーム単離は、2次元(2D)細胞培養に基づいて広く行われています。しかし、大規模なエクソソーム生産戦略には最適化が必要です。本研究では、ゼノフリー条件下での大量のSF-MSC培養に基づいて、大規模なエキソソーム製造方法を開発しました。細胞培養上清からの超遠心分離後、エキソソームの安全性と機能が検証されました。

<table><tbody><tr><td>BCAアッセイキット</td><td>ThermoFisher</td><td>23227</td><td>タンパク質濃度アッセイ</td></tr><tr><td>血液寒天プレート</td><td>南京Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.</td><td>P0903</td><td>細菌培養</td></tr><tr><td>CD105 抗体</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1243C</td><td>フローサイトメトリー</td></tr><tr><td>CD34 抗体</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1143C</td><td>フローサイトメトリー</td></tr><tr><td>CD45 抗体</td><td>BD Bioscience</td><td>555483</td><td>フローサイトメトリー</td></tr><tr><td>CD63 抗体</td><td>アブクロナール</td><td>&nbsp;A5271</td><td>ウェスタンブロッティング</td></tr><tr><td>CD73 抗体</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1242C</td><td>フローサイトメトリー</td></tr><tr><td>CD81 抗体</td><td>ABclonal</td><td>&nbsp;A5270</td><td>ウエスタンブロッティング</td></tr><tr><td>CD9抗体</td><td>アブクロナール</td><td>&nbsp;A1703</td><td>ウェスタンブロッティング</td></tr><tr><td>CD90抗体</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1167C</td><td>フローサイトメトリー</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>遠心分離機 5810R</td><td></td></tr><tr><td>CO2インキュベーター</td><td>サーモ</td><td></td><td>セル培養</td></tr><tr><td>共焦点レーザー走査型 蛍光顕微鏡</td><td>ZEISS</td><td>LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>Cytodex</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Microcarrier</td></tr><tr><td>Dil</td><td>ThermoFisher</td><td>D1556</td><td>エキソソームラベル</td></tr><tr><td>EZ-PCR マイコプラズマ検出キット</td><td>BI</td><td>20-700-20</td><td>マイコプラズマ検出</td></tr><tr><td>フローサイトメトリー</td><td>ベックマン</td><td></td><td>MSC 同定</td></tr><tr><td>Gene Pulser II System</td><td>バイオ・ラッド・ラボラトリーズ</td><td>1652660</td><td>遺伝子トランスフェクション</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8.0.2</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td>バージョン 8.0.2</td><td></td></tr><tr><td>HLA-DR 抗体</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1111C</td><td>フローサイトメトリー</td></tr><tr><td>Lowenstein-Jensen 培地</td><td>南京 Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.</td><td>T0573</td><td>結核菌</td></tr>培養 <tr><td>MesenGro</td><td>StemRD</td><td>MGro-500</td><td>MSC培養</td></tr><tr><td>Nanosight NS300</td><td>Malvern</td><td>Nanosight NS300</td><td>Nanoparticle Tracking analysis</td></tr><tr><td>NTA 2.3 software</td><td>Malvern</td><td></td><td>Data analysis</td></tr><tr><td>Odyssey FC</td><td>Gene Company Limited</td><td></td><td>蛍光ウェスタンブロッティング</td></tr><tr><td>OptiPrepエレクトロポレーションバッファー</td><td>Sigma</td><td>D3911</td><td>遺伝子トランスフェクション</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤 カクテル</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td>プロテイナーゼ阻害剤</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>158924</td><td>RNAの除去</td></tr><tr><td>Sabouraud 寒天プレート</td><td>南京Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.</td><td>P0919</td><td>菌類培養</td></tr><tr><td>TEM</td><td></td><td>JEM-1200EX</td><td></td></tr><tr><td>ロータリー細胞培養システム (RCCS)</td><td>Synthecon</td><td>RCCS-4HD</td><td>3D 培養</td></tr><tr><td>超遠心分離機</td><td>Beckman</td><td>Optima XPN-100</td><td>エクソソーム遠心分離機</td></tr></tbody></table>

3次元バイオリアクター培養による滑液間葉系幹細胞由来エクソソームの大規模調製

Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture

間葉系幹細胞(MSC)によって分泌されるエクソソームは、軟骨損傷および変形性関節症治療の有望な候補として示唆されている。臨床応用のためのエキソソームは、大規模な生産を必要とします。この目的のために、ヒト滑液MSC(hSF-MSC)をマイクロキャリアビーズ上で成長させ、動的3次元(3D)培養システムで培養しました。3D動的培養を利用することにより、SF-MSC培養上清から大規模なエクソソームを得ることに成功した。エキソソームを超遠心により回収し、透過型電子顕微鏡、ナノ粒子透過アッセイ、およびウェスタンブロッティングによって検証しました。また、エクソソームの微生物学的安全性も検出されました。エキソソーム検出の結果は、このアプローチが多数の適正製造基準(GMP)グレードのエキソソームを生成できることを示唆しています。これらのエキソソームは、エキソソーム生物学研究および臨床変形性関節症治療に利用することができる。

フローサイトメトリーは、国際細胞療法学会が推奨するヒトMSCを定義するための最小限の基準に従って、SF-MSCの表面マーカーを同定するために使用されました14,15。フローサイトメトリー解析の結果、本研究で培養したSF-MSCsがMSCの同定基準を満たしていることが明らかになりました。CD34、CD45、およびHLA-DRは陰性(3%未満)、CD73、CD90、およびCD105(95%以上)は陰性でした(図2)。
倒立顕微鏡下では、SF-MSCがマイクロキャリア上で増殖することが注目されました(図3A)。2D培養プレートおよび3D培養マイクロキャリアから細胞を消化洗浄した後、細胞数をカウントした。2D培養と比較して、3D培養はSF-MSCを6日以降より迅速に増殖させました(図3B)。3つの...

ここでは、3Dバイオリアクターを用いて滑液間葉系幹細胞から多数のGMPグレードのエキソソームを作製するためのプロトコールを提示する。

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. ...

3Dバイオリアクターを用いて、滑液間葉系幹細胞からGMPグレードのエキソソームを多数作製するためのプロトコルを提示します。これらのエキソソームは、エキソソーム生物学研究および臨床関節炎治療に利用できる可能性があります。手順を実演するのは、Yujie Liang博士です。滑液を摂氏4度で10分間1, 500倍Gで遠心分離することにより、ヒト間葉系細胞(MSC)の収集を開始します。遠心分離後、上清を捨て、細胞ペレットを10ミリリットルのPBSで再懸濁します。再懸濁した細胞を摂氏4度で1,500倍Gで10分間遠心分離し、PBSを廃棄してから、ペレットを10ミリリットルのヒトMSC培養培地で10ミリリットルあたり10〜4細胞分の5倍の細胞密度で再懸濁し、懸濁液を100ミリメートルの皿にプレートします。5%二酸化炭素を含む雰囲気で摂氏37度で皿をインキュベートします。2週間後、細胞培養上清を採取し、フローサイトメトリーを用いて滑液間葉系幹細胞(SF-MSC)を同定します。これを行うには、第3世代の継代3のSF-MSCを摂氏4度で5分間1, 000倍Gで遠心分離して消化します。その後、菌体ペレットを回収する前に上清を廃棄する。次に、400マイクロリットルのブロッキングバッファーを10〜4倍の濃度でセルペレットに添加し、ペレットを室温で15分間静置する。15分後、前述のように細胞懸濁液を遠心分離し、次いで分離したペレットを100マイクロリットルの1X PBSに再懸濁する。原稿に記載されているように、チューブあたり1:100の希釈比で1マイクロリットルのモノクローナル蛍光抗体を添加し、インキュベーション用のチューブを室温で30分間置きます。インキュベーション後、細胞を1X PBSで2回洗浄し、100マイクロリットルの1X PBSに細胞を再懸濁します。次に、赤色およびFITCチャンネルを使用して、フローサイトメーター上で最大10, 000個の細胞の蛍光色素を検出します。マイクロキャリアを調製するには、0.75グラムのマイクロキャリアを1X DPBS中で、1グラムあたり50ミリグラムの濃度で室温で少なくとも3時間膨潤および水和乾燥します。次いで、上清をデカントし、マイクロキャリアを新鮮なDPBSで5分間洗浄した。培地を1グラムあたり50ミリグラムのマイクロキャリアで新しい1X DPBSと交換した後、摂氏121度で15ポンド/平方インチで15分間オートクレーブ滅菌してマイクロキャリアを滅菌します。次に、上清をデカントする前に、滅菌されたマイクロキャリアを沈降させます。培養液中のマイクロキャリアを、室温でマイクロキャリア1グラムあたり50ミリグラムの濃度ですすぐ。マイクロキャリアが落ち着いたら、上清を捨てる。灌流バイオリアクターを調製するには、前述のようにオートクレーブによりバイオリアクターを滅菌する。完了したら、SF-MSCの数を数えて、7番目のSF-MSCに10の2.5倍を割り当て、マイクロキャリアを250ミリリットルのGMPグレードMSC培地で灌流したバイオリアクターに割り当てます。バイオリアクターを、毎分15回転の速度で摂氏37度の5%二酸化炭素を含むインキュベーターに入れる。6日ごとに培地を交換してください。14日後、さらなる分析のために細胞培養上清およびマイクロキャリアを収集する。細胞培養上清を300倍Gで4°Cで10分間遠心分離し、細胞残渣を捨てながら上清を回収する。摂氏4度で、上清を2, 000倍Gで10分間、次に10, 000倍Gで30分間連続的に遠心分離して、より大きな小胞を廃棄し、ペレットを収集します。ペレットを40ミリリットルのPBSに再懸濁した後、細胞懸濁液を摂氏4度で70分間120, 000倍Gで遠心分離する。次いで、エキソソームを含む回収したペレットを500マイクロリットルのPBSに再懸濁する。新たに単離したエキソソームサンプルを滅菌PBSでミリリットルあたり10〜7〜10〜9粒子の濃度に希釈し、毎分30マイクロリットル、摂氏24.4〜24.5度でナノ粒子追跡分析(NTAシステム)に500マイクロリットルのサンプルを注入します。メーカーのプロトコルに従って、キャプチャおよび分析システムを手動で設定します。レーザー光散乱によって粒子を視覚化し、デジタルビデオでブラウン運動をキャプチャします。次に、ソフトウェアを使用して記録されたビデオテープを分析し、実行ごとに少なくとも200個の個別の粒子を追跡します。ウェスタンブロッティングの場合は、300マイクロリットルの溶解バッファーとプロテアーゼ阻害剤カクテルをエキソソームに加え、上下にピペッティングして混合します。次に、氷の上に20分間放置します。この混合物を摂氏4度で9、391倍Gで10分間遠心分離した後、タンパク質アッセイキットを用いて上清中のタンパク質濃度を測定する。アッセイに続いて、サンプルを100マイクロリットルの4Xタンパク質ローディングバッファーで摂氏100度で10分間加熱します。次に、15マイクロリットルのタンパク質を1ミリリットルあたり10ミリグラムの濃度でロードし、120ボルトで70分間ゲル電気泳動を行い、摂氏4度で100ボルトで60分間エレクトロブロッティングします。カルネキシンなどの非エキソソーム特異的マーカーと、CD9、CD63、CD81などのエキソソームバイオマーカーを蛍光ウエスタンブロッティングにより検出します。フローサイトメトリー分析の結果、培養SF-MSCはCD34、CD45、HLA-DRが陰性、CD73、CD90、CD105が陽性であり、MSCの同定基準を満たしていることが明らかになりました。倒立顕微鏡下では、SF-MSCがマイクロキャリア上で増殖することが注目された。SF-MSCは、2D培養と比較して、6日以降、3D培養においてより早く増殖した。2Dおよび3D培養のSF-MSC由来のエキソソームをウエスタンブロッティングにより同定し、カルネキシン陰性ながらCD63、CD9、およびCD81を発現していることがわかりました。ナノサイト分析により、2Dおよび3Dエクソソームの直径は約120ナノメートルであることが示されました。透過型電子顕微鏡分析により、2Dおよび3Dエキソソームの形態が明らかになり、おおむね回転楕円体小胞が示されました。NTA分析を用いて、30〜160ナノメートルサイズの粒子の濃度を分析した。3D培養後、粒子濃度は10〜6ミリリットルあたり4.0倍であった。しかし、2D培養後、同サイズの粒子の濃度は1ミリリットルあたり10〜6倍の2.5倍であった。さらに、3D培養は2D培養よりも多くのエキソソームタンパク質を産生した。代表的な分析は、初代軟骨細胞によるディル標識エキソソームの内在化を示す。初代軟骨細胞に入ったジル標識エキソソームは、3時間目にピークを有するのが見られる。インビトロ送達研究は、エキソソームがスルホシアニン3標識マイクロRNA-140を軟骨細胞に送達できることを実証した。細胞のプレーティング、バイオリアクターでの反応の開始、および上清のプレーティングは、このプロトコルの最も重要なステップです。3D培養は、接着細胞の大規模培養に一般的に使用されます。スピンフレックスなどの他の方法も、エキソソームの大規模生産に使用できます。私たちの方法は、エキソソームの収率を改善し、MSCエキソソームベースの前臨床アプリケーションを可能にします。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

滑液の高濃度の培養ヒト関節軟骨細胞の3次元システムについて説明する。滑液は関節軟骨のための最も自然な微小環境を反映し、容易に入手し、保存することができます。このシステムは、このように軟骨再生の研究や、関節炎を治療するための治療薬をスクリーニングするために使用することができます。...

滑液における培養ヒト関節軟骨細胞用の3Dシステム

ミニブタの滑液と骨髄から分離され、注射器吸引を使用して非侵襲的に採取された間葉系幹細胞(MSC)を確立するプロトコルが提示されます。細胞表現型は、細胞単離後のフローサイトメトリーを使用し、MSCに由来する骨髄および滑液のin...

ミニブタの滑液および骨髄由来の間葉系幹細胞の単離および細胞表現型

間葉系幹細胞/間質細胞(MSC)の治療可能性は十分に文書化されていますが、患者のために細胞を準備する最善の方法は依然として議論の余地があります。ここでは、実験的および臨床的な応用のために、ゼノフリー条件下でプライミングされたMSCの治療用球状凝集体または「スフェロイド」を効率的に生成および投与するためのプロトコルを伝達します。...

異種非含有条件下での3次元培養における治療間葉系幹/間質細胞の生産と管理（MSC）スフェロイドプライム

幹細胞から軟骨形成は、培養条件の微調整が必​​要です。ここで、我々は、細胞を集光するための軟骨形成を開始するために不可欠なステップを磁気アプローチを提示します。また、当社は、バイオリアクター内の動的成熟は、細胞の構造に機械的刺激を適用し、軟骨細胞外マトリックスの産生を増強することを示しています。...

軟骨再生のための3次元磁気幹細胞凝集およびバイオリアクター成熟

この記事では、簡単な分離そしてニュージーランド白ウサギ滑液からの間葉系幹細胞の浄化のためのシンプルで経済的プロトコルを示します。...

磁気活性化細胞を分離し、滑膜液由来間葉系幹細胞が家兎モデルからの浄化戦略を並べ替え

エキソソームが医薬品配送事業者の新世代です。高収量とによる siRNA デリバリーのための純度エキソソームの隔離のプロトコルを設立しました。また、エクソソームに蛍光標識非特異的 siRNA をカプセル化し、がん細胞で siRNA ロード...

がん細胞への siRNA のエクソソームの準備

このプロトコルは、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞(ADSC)の培養や上清の収集から、超遠心分離を使用した細胞外小胞(EV)の抽出まで、すべての手順を説明しています。...

ヒト脂肪由来間葉系幹細胞からの細胞外小胞の精製とキャラクタリゼーション

この研究では、慢性創傷治癒のためのコアシース3Dバイオプリント足場を作製するためのプロトコルを提示します。細胞外小胞は間葉系幹細胞から単離され、カルボキシメチルセルロースとアルギン酸リアーゼから作られた鞘でコア(アルギン酸)にロードされます。この設計により、足場の劣化を制御し、EVを効率的にリリースできます。...

慢性創傷管理のためのコアシース3Dバイオプリントスキャフォールドを使用した細胞外小胞送達の最適化

メタゲノムライブラリの大規模スクリーン

内皮コロニー形成前駆細胞（ECFCs）は血管の恒常性と修復を研究するために有望なツールです。...

分離と成人ヒト内皮コロニー形成前駆細胞の大規模拡張

学ぶ3次元バイオリアクターによる滑液間葉系幹細胞由来エクソソームのGMPグレード大量調製法。遠心分離、フローサイトメトリー、ウエスタンブロッティングを用いて、関節炎治療とエクソソーム生物学研究への応用可能性を示す。

3次元バイオリアクター培養による滑液間葉系幹細胞由来エクソソームの大規模調製

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