Name: インビボ マウス劣オリーブにおけるカルシウムイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 学ぶマウス脳幹腹側アプローチによるカルシウムイメージング手法。GRINレンズを用いて劣オリーブニューロンの活動を記録し、運動協調の神経動態をリアルタイムで観察する技術を習得できます。

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OISTのメディアセンターのアンドリュー・スコットがビデオ録画と編集に協力してくれたことに感謝します。また、ヒューゴ・ホーデメイカーが脳幹を暴露する手術の開発に協力してくれたことに感謝し、ケビン・ドオルガン博士は数字の図を描くのに役立ちます。さらに、サルヴァトーレ・ラカヴァのナレーション、そしてCOVID-19の厳しい時代の幸福のための継続的なサポートのためのすべてのnRIMメンバーとペットに感謝します。

<ol><li>Russell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+signals+in+vivo%3A+A+powerful+tool+in+physiology+and+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology.</a> British Journal of Pharmacology. , (2011).</li>
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<li>Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vital+signs+monitoring+during+injectable+andn+inhalant+anesthesia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Animals%22%5BJournal%5D)">Vital signs monitoring during injectable andn inhalant anesthesia in mice.</a> Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).</li>
<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 6 (2), 174-178 (2011).</li>
<li>Vrieler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+and+directionality+of+inferior+olive+neuron+dendrites+revealed+by+detailed+3D+characterization+of+an+extensive+morphological+library%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">Variability and directionality of inferior olive neuron dendrites revealed by detailed 3D characterization of an extensive morphological library.</a> Brain Structure and Function. 0 (0), 1677-1695 (2019).</li>
<li>Esposito, M. S., Capelli, P., Arber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brainstem+nucleus+MdV+mediates+skilled+forelimb+motor+tasks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Brainstem nucleus MdV mediates skilled forelimb motor tasks.</a> Nature. , (2014).</li>
<li>Martin, E. M., Devidze, N., Shelley, D. N., Westberg, L., Fontaine, C., Pfaff, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+neuroanatomical+characterization+of+single+neurons+in+the+mouse+medullary+gigantocellular+reticular+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Molecular and neuroanatomical characterization of single neurons in the mouse medullary gigantocellular reticular nucleus.</a> Journal of Comparative Neurology. , (2011).</li>
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<li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> eLife. 8, 1-45 (2019).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIN1PIPE%3A+A+Miniscope+1-Photon-Based+Calcium+Imaging+Signal+Extraction+Pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">MIN1PIPE: A Miniscope 1-Photon-Based Calcium Imaging Signal Extraction Pipeline.</a> Cell Reports. 23 (12), 3673-3684 (2018).</li>
<li>Sciences S.U. GitHub - PeyracheLab/miniscoPy: A package to analyse calcium imaging data recorded with the Miniscope. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/PeyracheLab/miniscoPy">https://github.com/PeyracheLab/miniscoPy</a> (2020).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. , (1998).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+accurate+extraction+of+in+vivo+calcium+signals+from+microendoscopic+video+data%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data.</a> eLife. 7, 1-37 (2018).</li>
<li>Zhou, P., et al. GitHub - zhoupc/CNMF_E: Constrained Nonnegative Matrix Factorization for microEndoscopic data. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/zhoupc/CNMF_E">https://github.com/zhoupc/CNMF_E</a> (2020).</li>
<li>De Gruijl, J. R., Bosman, L. W. J., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferior+olive%3A+All+ins+and+outs%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+the+Cerebellum+and+Cerebellar+Disorders%22%5BJournal%5D)">Inferior olive: All ins and outs.</a> Handbook of the Cerebellum and Cerebellar Disorders. , (2013).</li>
<li>Dorgans, K., Kuhn, B., Uusisaari, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Subthreshold+Voltage+Oscillation+With+Cellular+Resolution+in+the+Inferior+Olive+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Imaging Subthreshold Voltage Oscillation With Cellular Resolution in the Inferior Olive in vitro.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. , (2020).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

外科的処置は、多数の極めて重要な構造(動脈、神経)を有する咽喉領域で行われる手術を伴うため、高レベルの外科的スキルを有する研究者によって行われることが不可欠である。以下では、この手順のいくつかの重要なポイントを強調し、コメントします。しかし、書かれたアドバイスの量は、研究者の経験、スキル、および直感に取って代わることはできないということを思い出させる必要があります。
手術の最も重要なステップは気管切開です。気管を切断し、鼻コーンから挿管チューブにイオブルランを切り替え、気管を胸部の皮膚に固定し、気管と挿管チューブを結び付けます。これらの操作はすべて、不十分な麻酔、気管への流体の流入、挿管チューブのスリップオフなどの事故を避けるために、スムーズかつ迅速な方法で完了する必要があります。気管を切る前にプロトコルを明確にしておかなければなりません。
出血は、この手術における動物死亡の主な原因の1つである。首の領域は血管で密集しているので、目に見えない静脈や動脈を切断することを避けるために、視線が明確な場合にのみ切断を実行する必要があります。したがって、視力を隠す筋肉や結合組織を取り除く必要があり、壊れた毛細血管からの血液は前進する前に洗浄する必要があります。
動物は手術の開始から長い間(8時間以上)生き続けることができます。しかし、動物の生理学的状態が良好なときに脳幹ニューロンを調べる時間が増えるため、外科的処置を迅速に終了することが重要です。熟練した研究者は、70分で全体の手順を完了することができます。
この方法は腹側脳表面のきれいなビューを提供するが、残念ながら気管切開を行わず、喉の領域内のかなりの量の組織を除去することは不可能である。したがって、動物は麻酔から目覚めることはできません。さらに、麻酔薬の送達を注意深く調整し、体温や水分補給を維持することで、動物を何時間も生き続けることが可能であるにもかかわらず、長期実験が最終的に動物の状態の弱体化につながることは避けられない。安定した録音の最大期間を考慮することは、研究者の専門知識に委ねられます。
ここで説明する方法のもう一つの潜在的な制限は、GRINレンズが脳の華やまに挿入されないので、比較的表面的なニューロン(〜150〜200μm)しか検査できないということである。GRINレンズの外科的移植は技術的に可能であるが、急性の外科手術方法は、ニューロンが酸化ストレスから回復するのに十分な時間を許さないし、移植後の血液の存在は許容範囲を超えて画質を低下させる可能性が高い。
上記の懸念事項にもかかわらず、IOニューロンの インビボ イメージング法が発表されるのはこれが初めてであると考えています。これは、感覚系からの無傷の発泡性入力の存在下 での生体内 の文脈におけるIOニューロンにおける時空間的活性の検査を可能にするとともに、小脳核およびメソジエンスファリック接合部22からの信号は、これまで不可能であった偉業である。この方法により、IOの機能は、感覚的および光遺伝学的刺激の組み合わせにより、より深く調査できるようになりました。特に、電圧イメージング(IO 23における最近の電圧イメージング法など)の進化により、提示された外科的手法が、IOが小脳複雑なスパイクの生成にどのように寄与するかを調査することに挑戦する多くの研究者を鼓舞することを期待しています。

システム神経科学の主な目標は、神経回路の時空間的な活動パターンが動物の行動の生成にどのように寄与するかを理解することです。このように、カルシウム感受性プローブを利用した蛍光イメージング方法論は、1細胞からメソスケール回路に至るまでの空間的なダイナミクスを可視化できるため、過去10年間に生きている動物1,2における神経細胞ネットワーク活性を調べる主要なツールとなっています。近年、脳の表面構造(脳や小脳のコルチなど)の神経回路が透明な頭蓋窓3を介して画像化される一般的なアプローチは、深部脳構造におけるネットワークダイナミクスの検討を可能にする勾配屈折率(GRIN)レンズ4の使用によって補完されている。現在利用可能なGRINレンズは、マウス扁桃体、海馬、大脳基底核5などの数ミリメートルの深い構造に到達することができます。しかし、腹側髄質中の様々な核のような関心のある多くの領域は、かなり深く、GRINレンズの到達の極端な部分に置きます。
ここでは、脳の腹側を通して髄質の比較的容易なアクセスを利用して、この困難を克服する方法を説明する。側腹腔髄質の核であるオリーブ(IO)がカルシウムセンサGCaMP6sでウイルスにトランスフェクションされた成体マウスを用いて、麻酔薬の脳の腹側にGRINレンズを配置するための外科的ステップ(もともとKhosrovaniら 20076.に記載された方法から改変)を記述する。ミニチュア顕微鏡を用いて、このような極度の腹側脳領域における神経活動の記録の実現可能性を実証する。この処置は必ずしも非生存手術であり、覚醒動物では実験を行うことはできないが、この方法は感覚的または他の異性経路刺激の文脈における無傷のネットワークダイナミクスの検査を可能にし、急性スライス製剤を使用するなどのex vivoアプローチよりも明確な利点を提供する。

<table><tbody><tr><td>AAVです。CAGです。GCaMP6s.WPRE.SV40</td><td>Addgene, USA</td><td>100844-AAV9</td><td></td></tr><tr><td>6mm半円針付き吸収性縫合</td>糸 <td>Natume, 日本</td><td>L6-60N2</td><td>フック針 糸付き</td></tr><tr><td>吸収三角形</td><td>FST, ドイツ</td><td>18105-03</td><td>手術用スポンジ</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ライカ, ドイツ</td><td>M50</td><td></td></tr><tr><td>カストロビエホ 湾曲した先端の針ホルダー ロック付き</td><td>FST, ドイツ</td><td>12061-01</td><td>手術用具</td></tr><tr><td>綿棒</td><td>山陽、日本</td><td>HUBY-340</td><td></td></tr>繊細な<tr><td>縫合糸結束鉗子</td><td>FST、ドイツ</td><td>11063-07</td>手術<td>ツール</td></tr><tr><td>繊細な縫合タイイング鉗子</td><td>FST、ドイツ</td><td>11063-07</td>手術<td>ツール</td></tr><tr><td>デュモン#5/45鉗子</td><td>FST、ドイツ</td><td>11251-35</td>手術<td>ツール</td></tr><tr><td>ファインアイリスはさみ</td><td>FST、ドイツ</td><td>14060-09</td><td>手術ツール</td></tr><tr><td>Friedman-Pearson rongeur 湾曲した先端</td><td>FST、ドイツ</td><td>16221-14</td><td>手術ツール</td></tr><tr><td>Gelfoam 吸収性ゼラチンスポンジ</td><td>ファイザー、米国</td><td>0315-08</td><td>止血ゼラチンスポンジ</td></tr><tr><td>ガラス毛細管ナノ注射</td><td>Neurostar、ドイツ</td><td>n/a</td><td>ウイルスベクター注射用</td></tr><tr><td>鋸歯状の先端を持つGraefe鉗子</td><td>FST、ドイツ</td><td>11052-10</td><td>手術器具</td></tr><tr><td>インプラントロッド</td><td>Inscopix, USA</td><td>n/a</td><td>nVoke2 システムの一部です。それはnVoke2ミニチュアマイクロスプに設計されており、GRINレンズはそれに取り付けることができる</td></tr><tr><td>IsoFlo</td><td>Zoetis、英国</td><td>n/a</td><td>イソフルラン</td></tr><tr><td>筋肉内注射用ケタラー</td><td>第一三共、日本</td><td>n/a</td><td>ケタミン</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark、米国</td><td></td><td>洗浄ティッシュ</td></tr><tr><td>レーザーベースのマイクロピペットプーラー</td><td>サッター機器、米国</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットベベラー</td><td>サッター機器、米国</td><td>BV-10</td><td></td></tr><tr><td>Kopfに基づく電動定位固定装置、モデル900</td><td>Neurostar、ドイツ</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>直腸温度センサーと大腿部クランプパルスオキシメータを備えた</td>定位固定フレームmouseOxPlus <td>Starr Life Sciences、PA、USA</td><td>MouseOxPlus</td><td>は、動物の心拍数、動脈血糖飽和度(SpO2)、呼吸数、および温度</td></tr><tr><td>を測定しますnVoke2 integrarted カルシウムイメージングマイクロカメラシステム</td><td>Inscopix, USA</td><td>1000-003026</td><td>ミニチュア顕微鏡</td></tr><tr><td>Ohaus Compact Scales</td><td>Ohaus, USA</td><td>CS 200</td><td>動物の体重測定に使われるスケール</td></tr><tr><td>大塚 正常生理食塩水</td><td>大塚製薬工場,</td><td>日本 n/a</td><td></td></tr><tr><td>生理学的・生物学的温度調節システム</td><td>SuperTech Instruments, Hungary</td><td>TMP-5b</td><td>マウス用サーマルパッド</td></tr><tr><td>ProView レンズプローブ 直径 1.0 mm、長さ 9.0 mm</td><td>Inscopix、米国</td><td>1050-002214</td><td>勾配屈折率(GRIN)レンズ</td></tr><tr><td>Q114-53-10NP ガラス毛細血管</td><td>Sutter Instrument、米国</td><td></td><td>112017カスタマイズ&nbsp; 石英ガラス毛細血管</td></tr><tr><td>Safety IV Catheter 20G</td><td>B. Braun, Germany</td><td>4251652-03</td><td>挿管チューブの準備に使用される 20 gauage カテーテル</td></tr><tr><td>サンドペーパー</td><td>ESCO, Japan</td><td>EA366MC</td><td>25G針の先端を研磨して湾曲した鈍い針を調製するために使用</td></tr><tr><td>メスの刃</td><td>室町機械, 日本</td><td>10010-00</td><td>石英ガラスピペットの先端を切断するために使用</td></tr><tr><td>SomnoSuite 低流量吸入麻酔システム</td><td>Kent Scientific, USA</td><td>SOMNO</td><td>イソフルランフローの正確な制御を提供</td></tr><tr><td>Surgic XT Plusドリル</td><td>NSK</td><td>Y1002774</td><td>ウイルスベクター注射</td></tr><tr><td>用 シリンジ 1 ml</td><td>テルモ、日本</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ針 25G</td><td>トップ、日本</td><td>00819</td><td>鈍く曲げられた針を作るために使用されます</td></tr><tr><td>シリンジ針 26G</td><td>テルモ、日本</td><td>NN-2613S</td><td></td></tr><tr><td>Thrive 2100 プロフェッショナルトリマー</td><td>Thrive、日本</td><td>n/a</td><td>シェーバー</td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml;bingen spring scissors</td><td>FST, Germany</td><td>15004-08</td><td>Surgery tool</td></tr><tr><td>ワセリン</td><td>林純薬, 日本</td><td>22000255</td><td></td></tr><tr><td>Veet 敏感肌</td><td>Veet, Canada</td><td>n/a</td><td>脱毛クリーム</td></tr><tr><td>キシロカインゼリー 2% 30ml</td><td>アスペン 日本,&nbsp;日本</td><td>871214</td><td></td></tr></tbody></table>

インビボ マウス劣オリーブにおけるカルシウムイメージング

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

腹側髄質の核であるオリーブ(IO)は、小脳に入る2つの入力経路のうちの1つを形成するクライミング繊維の唯一の供給源である。IOは、運動制御にとって重要であると長い間提案されており、その活動は現在、小脳の運動と認知機能の両方の多くの仮説の中心であると考えられている。その生理学と機能は インビトロの単細胞レベルで比較的よく研究されているが、現在のところ、生きている動物におけるIOネットワーク活動の組織に関する報告はない。これは主にIOの極めて困難な解剖学的位置に起因し、従来の蛍光イメージング法の対象となるため、対象領域に向かう脳全体を通して光学路を作り出さなければならない。
ここでは、IOネットワークから最新レベルのカルシウムイメージングデータを取得する代替方法について説明する。この方法は、IOの極端な腹側位置を利用し、麻酔マウスにおけるカルシウムセンサGCaMP6s発現IOの腹側表面に接触するために頸部内臓を介して勾配屈折率(GRIN)レンズを挿入するための外科的処置を伴う。代表的なカルシウムイメージング記録は、手術後にIOニューロン活性を記録するフィージビリティを示す。これは非生存手術であり、録音は麻酔下で行われなければならないが、生命界の脳幹核への損傷を避け、時空間的活動パターンおよびIOにおける入力統合を調査する多種多様な実験を行うことを可能にする。この手順は、腹側脳幹の他の隣接領域での記録に使用できます。

ここでは、記載した方法で得られた代表的な記録を提示する。 図6a は、実験中に可視化された明るいラベルのIOセルの位置を示す。暗い斜めの縞は血管です。なお、個々の細胞の明るさの変化は、トランスフェクション効能の変化から生じる。パネル 図6b では、パネルaに色と数字で示されたソマトンから得られた平均正規化蛍光強度(deltaF/F)トレースを示す。上向きの偏向は、細胞内カルシウムの一過性増加を表す。GCaMP6sの発現のレベルが異なる(パネルaの細胞の明るさに反映される)が、可変的な信号対雑音比(SNR)を導く方法に注意してください。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62222/62222fig06.jpg"> 図6:麻酔マウスにおけるIOニューロンの活動記録例(a)空間フィルタリング後の記録からの代表的なフレーム。明るいスポットはIOニューロンソマトンであり、そのうちのいくつかは関心領域(ROI、色付きの数字)として示されています。暗い縞は血管です。(b) パネル a に示された ROI から取得されたデルタF/F トレースの例。上向きのたわみはカルシウムシグナルの増加を反映する。a=10 μm のスケール<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62222/62222fig06large.jpg" target="_blank"></a>バー。

我々は、腹側から成虫マウスの脳幹を暴露するプロトコルを提示する。ミニチュア顕微鏡で傾斜屈折率レンズを用いることで、インビボでのオリーブ神経ソマタの活性を調べるためにカルシウムイメージングを用いることができる。

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

オリーブは、髄質の最も腹側部分であり、したがって、生きている動物に到達することは非常に困難です。ここでは、脳の脳の脳を腹側から出すプロトコルを紹介し、GRINレンズを用いて、カルシウムセンサーを発現する劣ったオリーブニューロンの神経活動を記録する。この方法は、生命に重要な脳幹への損傷を回避し、空間的時間的活動パターンと劣ったオリーブの入力統合に関する調査を可能にする。手術は多くの重要な構造を有する複雑な咽喉領域で行われるので、高レベルの外科技術を有する研究者によって行われることが不可欠である。20ゲージカテーテルの先端から長さ5~6ミリメートル、幅0.8mmのスリットを切断して挿管チューブを用意します。先端を切り落とし、骨折表面を砂で切り、ペンチで曲げて、鈍くて曲げられた針を準備します。これは気管切開中の気管を支えるために使用されます。15%の手術ツールと消耗品を組み立てるに生理食塩水で1ミリリットルケタミンあたり15ミリグラムを希釈します。暖房パッドを摂氏38度に設定します。ステレオタックスフレームで、ノセッコを180度水平に回します。オリーブの劣ったマウスを以前にウイルスを運ぶGCaMP6sによってトランスフェクションしたマウスの重量を量り、注射のための希釈ケタミンの量を計算する。5%イソファランを備えたプレフィル誘導ボックス、マウスの麻酔を行います。ステレオタックスフレームにマウスを取り付け、腹側を上に取り付けます。マウスの喉と太ももの領域を剃ります。脱毛クリームで残った髪を取り除きます。喉の皮膚にキシロカインゼリーを局所的に塗布する。直腸熱センサーでマウス温度を監視します。腹腔内に1ミリリットルの予熱生理食塩水を注入する。後肢のつま先に強いピンチで麻酔の深さを評価します。検出可能な応答を呼び出すべきではありません。正中線に沿って喉の皮膚に垂直切開を行います。鈍い解剖法を使用して、その下の内臓から首の皮膚を分離し、皮膚を切断します。結合組織から唾液腺を解放し、それらを横に反転して、ステノ甲状腺筋肉で覆われた気管を露出させる。腹腔内は、動物の体重1キログラム当たり5ミリリットルで希釈ケタミンの最初の用量を注入する。慎重に気管を露出するために細かい鉗子の先端と中線に沿ってステノ甲状腺筋肉を分割.鈍い解剖法を使用して鉗子で血管および食道から気管を切り離す。動物の体重1キログラム当たり2.5ミリリットルで希釈ケタミンの第二の用量を注入します。横方向に気管の下に鈍い針を挿入します。鈍い針で気管を持ち上げます。縫合糸を3番目の気管リングの周りを回り、甲状腺を半分の円の針で尾行させます。このリングに4つの楽器のネクタイを作ります。胸部の皮を同じ半円の針で突き刺し、糸を皮膚に通します。気管を糸でそっと持ち上げ、気管尾を甲状腺に切ります。胸の皮膚に向かって気管を引っ張ります。その下に手術用スポンジの小片を追加することによって気管の開口部を上げます。洗浄ティッシュの薄いストリップと気管の開口部の先端の中に残っている液体を取除きます。ステレオタキシックなノセコーンから挿管チューブにイオブルランの流れを切り替えます。挿管チューブを気管に挿入します。チューブのスリットの一部が気管の外側に残っていることを確認して呼吸を可能にします。3~4本の楽器を結ぶと、マウス胸部の皮膚に気管を固定します。管切開チューブを固定するために縫合糸で気管を結びます。細かい鉗子で筋線維に沿って、ステノ甲状腺の筋肉をスリット.スプリングハサミで孤立した部分を切り落とします。筋肉の血管の損傷を最小限に抑えるために、筋肉から慎重に残った気管と喉頭を解放します。残った気管と喉頭を取り除く。鉗子で付着した組織から食道を解放し、春のはさみでそれを切り落とす。脳幹とアトラスの腹側のアーチを覆う縦方向の筋肉を取り除きます。アトラス腹側のアーチと前ツベルを覆う筋肉を取り除きます。ロンダの腹側のアーチをロングールで切ります。アトラスの前塊茎を取り除く。血液と体液を取り除き、頭間のマグナムと脳幹を見ます。後頭部の骨を回転骨で取り除くことによって、前頭部のマグナムを拡大する。軟骨を取り除き、硬膜の骨膜層を細かい鉗子で慎重に剥がし、腹側脳幹をはっきりと見る。マウスの太ももにSpO2センサーをクランプして、心拍数、酸素飽和度、呼吸速度などのバイタルサインを監視します。GRINレンズを注入ロッドに取り付けます。70%エタノール浸し洗浄組織でレンズを丁寧に洗浄してください。ステレオタックスフレーム上の移植ロッドを固定し、移植ロッドにミニチュア顕微鏡を取り付けます。GRINレンズを浸漬するために、脳幹領域に生理食糸を数滴加えます。GRINレンズで脳幹に近づく。表面領域に劣ったオリーブニューロンを発現するGCaMP6sは、長方形状の領域、残りのアトラスに約0.5〜1.7ミリメートルのロストラル、および正中線に約2.6〜1.1ミリメートルの横方向に見つけることができます。ミニチュア顕微鏡で励起ブルーのLEDをオンにして、GCaMP6sのトランスフェクション劣ったオリーブニューロンを見つけます。ニューロンは、様々なGCaMP6s発現レベルに起因する異なるベースライン蛍光強度を示す。左側のビデオの円状の下にあるオリーブニューロンソマタのカルシウムレベルの変化は、デルタFを右側のFトレースで割って示しています。マウスは暖かく保たれ、水分補給されますが、麻酔や手術の長期化によって必然的に弱くなります。マウスの体調が記録に適するように、手術の持続時間を短くしておくことが不可欠です。熟練した研究者は70分で手術を終えることができます。この方法は、修飾を伴って、腹側脳幹の他の隣接領域を研究するために使用することができる。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

新皮質のマイクロ回路のネットワークのダイナミクスを理解するために、それは同時に、神経細胞の多数のアクティビティを記録することが不可欠です。のin...

レイヤーin vivoでの2光子カルシウムイメージングマウスの2 / 3

出典:Shannonhouse, J., et al.In vivo 無傷の背根神経節における一次感覚ニューロンのネットワークにおけるニューロン集団のカルシウムイメージング。J. Vis. Exp. （2023年).このビデオは、トランスジェニックマウスの後根神経節(DRG)のニューロン活動を監視するためのin...

マウスの無傷の背根神経節におけるニューロン群のin vivoカルシウムイメージング

出典:Lee, H. et.al., ヘッドマウント小型顕微鏡による、自由に行動するマウスの扁桃体における生体内カルシウムイメージングに成功しました。J. Vis. Exp. (2020)このビデオは、勾配屈折率またはGRINレンズと小型顕微鏡を使用したマウスのin...

自由に動くマウスにおけるリアルタイム微小内視鏡的カルシウムイメージング

このプロトコルは、麻酔薬を使用したマウスの近くの血管から脳を包み込む周囲細胞からの蛍光カルシウム画像と血流データを取得して分析するステップを提示する。これらの技術は、壁画細胞生理学の研究に有用であり、任意の細胞型のカルシウム過渡症を調査するために適応することができる。...

生体内のトランスジェニックマウスにおける脳ペリサイトカルシウムと血行力学イメージング

本プロトコルは、フードラップ、透明シリコーン、およびカバーガラスを使用して、大きな(6 x 3 mm2)頭蓋窓を作成することについて説明しています。この頭蓋窓は、同じマウスでの in vivo...

インビボ 大きな頭蓋窓を用いたマウスからの広視野および2光子カルシウムイメージング

このプロトコルは、後根神経節(DRG)の外科的曝露とそれに続くGCaMP3(遺伝的にコードされたCa2+ インジケーター;緑色蛍光タンパク質-カルモジュリン-M13タンパク質 3)Pirt-GCaMP3マウスを用いて、同側後肢に様々な刺激を加えながら神経細胞集合体をCa2+...

インビボ 無傷の背根神経節における一次感覚ニューロンのネットワークにおけるニューロンアンサンブルのカルシウムイメージング

現在の方法は、容易に入手可能な遺伝的にコードされたカルシウム指標を使用して、カエノラブディティスエレガンスのin...

in vivoでの神経細胞カルシウムハンドリングの細胞内イメージング

このプロトコルは野生型マウスの皮質をそのまま残している間2光子の顕微鏡検査との単一ニューロンの活動をイメージ投射すること、および部分皮質の突然変異体のマウスの広視野顕微鏡検査が付いている全体のSCをイメージ投射することを含む目がさめているマウスの優秀なcolliculus (SC)のカルシウム応答を、イメージ投射するためのプロシージャを詳述する。...

マウス上結腸におけるカルシウムイメージング

海馬の歯状回は、学習と記憶において重要で明確な機能を果たします。このプロトコルは、自由に動くマウスの歯状回における顆粒細胞の in vivo...

マウス海馬歯状回における顆粒細胞のin vivoカルシウムイメージング 

本プロトコルは、社会的状態操作(社会的孤立および社会的再会)中に自由に行動するマウスの視床下部神経細胞をミニスコーでin vivo...

インビボ マウスの社会的行動を理解するための視床下部での微型顕微鏡によるカルシウムイメージング

学ぶマウス脳幹腹側アプローチによるカルシウムイメージング手法。GRINレンズを用いて劣オリーブニューロンの活動を記録し、運動協調の神経動態をリアルタイムで観察する技術を習得できます。

インビボマウス劣オリーブにおけるカルシウムイメージング

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インビボ マウス劣オリーブにおけるカルシウムイメージング

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