Name: マイクロ流体混合プラットフォームを用いた遺伝子導入のための脂質ナノ粒子の作製と特性化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 学ぶマイクロ流体混合プラットフォームを用いた脂質ナノ粒子の作製法。核酸封入効率と粒子サイズの制御により、遺伝子導入の非ウイルスベクターとして再現性の高いナノ医療技術を確立します。

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アトゥル・サルヤ、ヤティン・ゴカーン、マリア・テレサ・ペラッキア、ウォルター・シュヴェンゲル、フィリップ・ザカスの指導とLNP開発への貢献に感謝します。

全体的なプロセスの概略を図 1に示します。
1. バッファの準備
注:バッファーの滅菌フィルタリングは、核酸およびLNP品質に影響を与える可能性のある微粒子を除去するために、ここで非常に推奨されています。
<ol><li>リン酸緩衝生理食塩分 (PBS)<ol>
<li>8 mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、137 mM NaCl、およびヌクレアーゼフリー水で2.7 mM KClを使用して1x PBSを準備し、pHを7.4に調整します。</li>
		<li>0.22 μmの細孔サイズフィルターを使用して真空濾過により滅菌します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>クエン酸バッファ<ol>
<li>クエン酸ナトリウム5mM、クエン酸5mM、ヌクレアーゼフリー水中の塩化ナトリウム150mMを使用してクエン酸緩衝液を調製し、pH 4.5に調整します。</li>
		<li>0.22 μmの細孔サイズフィルターを使用して真空濾過により滅菌します。 注: クエン酸バッファーは、mRNA が LNP にカプセル化される核酸である場合にのみ準備する必要があります。DNAがカプセル化される場合は、1.2をスキップし、1.3に進みます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>リンゴ酸バッファー<ol>
<li>ヌクレアーゼフリー水中で20mMリンゴ酸と30mMの塩化ナトリウムを使用してリンゴ酸緩衝液を調製し、pH3.0に調整します。</li>
		<li>0.22 μmの細孔サイズフィルターを使用して真空濾過により滅菌します。 注: リンゴ酸バッファーは、DNA が LNP にカプセル化される核酸である場合にのみ準備する必要があります。mRNAをカプセル化する場合は、1.3をスキップします。クエン酸緩衝液は、リンゴ酸緩衝液を有する3.0の低いpHとして、mRNAカプセル化に使用され、mRNA分解の可能性を高める可能性がある。プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 脂質混合の調製
<ol><li>ストック脂質が粉末状の場合は、純粋な200の証拠エタノールで可溶化する。</li>
	<li>所望のモル比に基づいて、必要な脂質成分の混合を計算します。50:10:39:1のモル比(イオン化脂質:ヘルパー脂質:コレステロール:PEG)は、10 mMの総脂質濃度の例としてここで使用されます。 表1 は、これらの各成分に必要な濃度と体積を示しています。 注:マイクロ流体ミキサーのエタノール中の脂質混合濃度(EtOH)を達成するために必要な体積を計算する場合、総体積はEtOHの添加が脂質濃度に影響を与えないことを確実にするために考慮される。例えば、68.5μLのイオン化可能な脂質量は、エタノール中の5mM濃度に総脂質混合容積533μLを掛け、その後、38.9mMのストック脂質濃度で割ることによって計算されます。</li>
	<li>各脂質ストック溶液の適切な量をガラスバイアルに加え、成分が断続的なボルテックスと混合できるようにします。533 μL の混合を合計する場合は、200 個の証拠エタノールを追加します。 表1の例では、これは254μLのエタノールです。 注:1回のランで1mLのLNPを生成するには、342.5 μLの脂質溶液が必要です。これは、サンプル採取前後の体積を持つ有機脂質溶液に対する水性核酸の3:1ミックスによるものです。533 μLの混合は超過として償うためになされる。</li>
</ol>3. 核酸溶液の調製
注:核酸溶液の調製と取り扱いは、可能な限り無菌でRNaseフリーの環境で行われるようにします。核酸で可能な限りバイオセーフティキャビネットで作業してください。
<ol><li>N/P比を計算します。N/P比は、負に荷電した核酸リン酸基(P)の総数に対するイオン化可能脂質アミン基(N)の総数である。N/P比は、多くの場合、LNP形成中に最適化することができるパラメータです。以下の手順に従います。<ol>
<li>以下の数式を使用して、N 単位の数を計算します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62226/62226eq01.jpg"> 注:イオン化可能な脂質濃度(表1)は5 mMであり、これは5 x10-6 mol/mLに相当する。必要な脂質注入容積は0.3425 mLである。例えば、分子当たりのN単位数が1である場合、上記の式を用いて、脂質混合には1.03 x10 18N 単位がある。</li>
		<li>目的の N/P 比の P 単位を計算します。ここでは、N/P = 36 が使用されます。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62226/62226eq02.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
	<li>以下の式を使用して2.86 x 1016 P単位を得るために必要な核酸濃度を計算する。 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62226/62226eq03.jpg"> ここで、mRNAの塩基対当たりのP単位数は1、DNAは2である。1,200塩基のmRNAの場合、N/P = 36に必要なmRNAの量は3.96 x10-11 モルです。</li>
	<li>以下の式を用いて、N/P=36に必要なmRNAの質量濃度を計算する。 <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/62226/62226eq04.jpg"> リボヌクレオチド一リン酸単位の平均分子量は322g/mol30である。1,200基のmRNAを用いて、mRNAの分子量は386,400 g/molである。核酸溶液の必要な注入量は1.028 mLである。したがって、必要なmRNAの濃度は1.488x10-5 g/mLであり、これは14.88 μg/mLである。</li>
	<li>クエン酸バッファー内の mRNA の 14.88 μg/mL の 1.5 mL を構成します。 注:DNAが核酸をカプセル化する場合は、リンゴ酸バッファーを使用して核酸溶液を構成してください。</li>
</ol>4. マイクロ流体チャネルのプライミング
メモ:このプロトコルは、機器メーカーのガイドラインに基付けされています。
<ol><li>適切なフィールドをクリックして、プライミングパラメータを計測器ソフトウェアに入力します(表2)。 注: 流量比は 3:1、流量率は 4~12 mL/minを推奨します。これは、ここで提示された研究だけでなく、メーカーによって最適であることが示されています。これは、アプリケーションに対して関心がある場合に変更できます。</li>
	<li>器具の蓋を開け、マイクロ流体カートリッジを回転ブロックに挿入します。</li>
	<li>1 mL シリンジに少なくとも0.5 mLのエタノールを引き込み、シリンジ先端に気泡やエアギャップがないことを確認します。この注射器をカートリッジの右入口に積み込みます。</li>
	<li>3 mL のシリンジに水性バッファー (DNA の RNA 用クエン酸とリンゴ酸) を 1.5 mL 充填し、気泡や隙間がないことを確認します。この注射器をカートリッジの左入口に積み込みます。</li>
	<li>クリップホルダーに2本の15 mL円錐形チューブを挿入して、廃棄物容器として使用します。</li>
	<li>計測器ソフトウェアで [実行 ]をクリックしてミキシングを開始し、パラメータが正しく入力されていることを確認します。</li>
	<li>底の青色光が止んで示されるプライミングが停止したら、蓋を開け、円錐形のチューブとシリンジを適切に処分します。</li>
</ol>5. LNPの形成
メモ:このプロトコルは、機器メーカーのガイドラインに基付けされています。
<ol><li>適切なフィールドをクリックして、定式化パラメータを使用してソフトウェアを更新します (表 2)。</li>
	<li>1 mL シリンジに脂質混合液を充填します(ステップ2で作成)。シリンジチップのエアギャップや泡を取り外し、シリンジをカートリッジの右側に挿入します。</li>
	<li>核酸溶液(ステップ3で作成)を3mLシリンジに引き込み、シリンジ先端に気泡やエアギャップがないことを確認します。カートリッジの左側の入口に注射器を挿入します。 注: 1 mL の LNP ソリューションを作成するためにボリュームが提供されています。この器械は10 mLまでのシリンジのサイズを組み込むことができる、そして容積は結果に影響を与えなしでそれに応じて拡大することができる。1 回の準備で準備できる LNP の最大ボリュームは 12 mL です。</li>
	<li>サンプル名を15 mL RNaseフリーの円錐形チューブにラベル付けし、左チューブクリップに挿入します。右チューブクリップに15 mLの廃棄物円錐を入れます。</li>
	<li>パラメータの入力が正しいことを確認したら、計器の蓋を閉じて[ 実行]をクリックします。</li>
	<li>計測器の実行が終了したら、廃棄物容器とカートリッジを適切に廃棄します。円錐状のチューブを LNP サンプルで保持します。</li>
	<li>エタノールを&lt;5%(v/v)に最小限に抑えるために、PBSでLNP 5xを希釈します。 注: 分解を防ぐためには、マイクロ流体混合後できるだけ早くPBSでLNPを希釈することが重要です。常にバイオセーフティキャビネットで希釈を行い、バッファ交換を通じてバイオセーフティキャビネットで作業を続けてください。</li>
</ol>6. バッファ交換
メモ: 超遠心フィルターを使用するためのプロトコルが提供されています。この方法は、バッファーのより時間効率の良い交換をもたらすが、透析はここで置き換えることができます。
<ol><li>1000 x g で 5 分間遠心分離機を使用して、PBS 2 mL の超遠心分離フィルター (100 kDa の毛穴サイズ) をあらかじめ洗浄します。下のコンパートメントからPBSを空にします。 注:PBSは、生理学的に関連し、中性電荷を有するイオン化脂質をもたらす7.4±0.2にpHを増加させるために選択されます。</li>
	<li>希釈したLNPを、洗浄済みの超遠心分離フィルターの上部コンパートメントに加え、遠心分離機を1000 x g で12分間追加します。</li>
	<li>下部コンパートメントからフロースルーを破棄します。毎回5mLのPBSを超遠心分離フィルターに加えて、さらに2回のスメを行います。同じパラメータで遠心分離機。維持する必要がある最大ボリュームはありません。 注: スケールアップされた Lnrp のボリュームを準備した場合は、それに応じて、各洗浄の PBS の量を増やします。例えば、1回のランで2mLのLNPを調製した場合、1回の洗浄につき10mLPBSが推奨される。</li>
	<li>LNPの損失を最小限に抑えるために、超遠心分離フィルターの壁に対してLNP溶液をピペット数回。超遠心分離フィルターからLNP溶液を取り出し、ヌクレアーゼフリーバイアルに保管します。1 mLのLNP溶液の最終容積を達成するために必要な場合はPBSを加える。</li>
	<li>必要に応じて、プリウェット0.2 μmシリンジフィルターを通してフィルターします。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
</ol>7. カプセル化効率の測定
<ol><li>PBSで働く核酸溶液の2倍の連続希釈を行い、最高濃度500 ng/mLから始まり、少なくとも5つの希釈液を作ることで、標準曲線を調製します。PBS をブランクとして使用します。</li>
	<li>LNP サンプル希釈液を準備します。PBSでLNPサンプルを希釈し、標準曲線の中間点(例えば初期濃度から推定される核酸の250 ng/mL)の周囲にある概算理論的濃度を達成する。</li>
	<li>RNA定量試薬(mRNA測定用)の溶液をTritonX-100で調製し、LNPを破壊し、LNP内外の核酸の総量を測定します。この溶液には、0.5%(v/v)RNA試薬、0.4%(v/v)TritonX-100、および99.1%(v/v)PBSが含まれています。</li>
	<li>TritonX-100を使用せずに試薬の溶液を調製し、LNPにカプセル化されていない核酸の量を測定します。この溶液は0.5%(v/v)RNA試薬および99.5%(v/v)PBSを含んでいる。 注: LNP がプラスミド DNA などの二本鎖 DNA (dsDNA) をカプセル化する場合は、同じ手順に従って、代わりに 7.3 および 7.4 の dsDNA 試薬を使用してください。</li>
	<li>96ウェル黒色蛍光可能プレートでは、7.1および7.2で調製されたLNPおよび核酸標準溶液のそれぞれに少なくとも4つの複製物をロードする。</li>
	<li>標準およびサンプルの複製の半分に、TritonX-100を含む試薬の等しい量を加えます。これは、核酸の総量を定量化します。</li>
	<li>標準およびサンプルの残りのウェルに、TritonX-100なしで試薬の等しい量を加える。これは、LNPの内部にカプセル化されていない核酸の量を定量化します。</li>
	<li>プレートを室温で5分間振って、添加された試薬との標準とサンプルを完全に混合し、光の露出を避けるための予防措置を講じます。</li>
	<li>マイクロプレートリーダーを用いて、励起波長480nm、発光波長520nmで蛍光を測定します。</li>
	<li>TritonX-100を使用しない試薬を添加した標準曲線を使用して、LNPの外の核酸濃度を計算します。7.2 で使用される希釈係数を掛けます。</li>
	<li>TritonX-100を含む試薬を添加した標準曲線を用いて、LNPの内側と外側の両方の核酸の濃度を計算します。7.2 で使用される希釈係数を掛けます。</li>
	<li>内部と外側の両方の核酸の総濃度から外側の核酸濃度(ステップ7.10から計算)を差し引いて核酸の濃度を計算する(ステップ7.11から計算)</li>
	<li>LNP内部の核酸濃度(ステップ7.12から計算)と核酸の総濃度(ステップ7.11から計算)の比からカプセル化効率を定量化する。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
</ol>8. 濃度調整
<ol><li>必要に応じて、カプセル化効率の結果を用いて、LNP溶液内の核酸濃度を調整します。</li>
	<li>より少ない濃縮溶液が望ましい場合は、PBSで溶液を希釈して所望の濃度を達成する。</li>
	<li>より濃縮された溶液が望ましい場合は、超遠心分離フィルターを使用して追加の遠心分離を実行します。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
</ol>9. LNP流体力学サイズと多分散を測定する
<ol><li>PBSで40倍のLNP溶液のアリコートを希釈し、1mLの最終体積を得た。 注: この希釈は必要に応じて変更される場合があります。この希釈値は、高品質の結果を提供しながら、少量のLNPストック溶液を使用するため推奨されます。</li>
	<li>セミマイクロキュベットを使用して、流体力学的直径と多分散指数を測定します。キュベットにLNP溶液を追加し、インストルメントに挿入します。計測器ソフトウェアで、測定タイプ、サンプルの詳細(材料、分散剤、温度、セルタイプ)、測定指示(実行回数)を含むように操作手順を設定します。測定の取得を開始する準備ができたら 、[開始 ] をクリックします。</li>
</ol>10. LNPゼータ電位を測定する
<ol><li>LNP溶液40xのアリコートをヌクレアーゼフリー水で希釈し、1mLの最終体積を得た。 注:ヌクレアーゼフリー水は、伝導度に対する高塩バッファーの影響を最小限に抑えるためにゼータ電位測定のための溶媒として使用されます。</li>
	<li>折り畳まれた毛細管ゼータ細胞を使用して、ゼータ電位を測定する。<ol>
<li>充填ラインまで、キュベットにLNP溶液を追加します。電極が機器と接触していることを確認するために、機器に挿入します。</li>
		<li>計測器ソフトウェアで、測定タイプ、サンプルの詳細(材料、分散剤、温度、セルタイプ)、測定指示(実行回数)を含むように操作手順を設定します。測定の取得を開始する準備ができたら 、[開始 ] をクリックします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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著者は全員サオブフィの従業員です。著者らは、利益相反や競合する金銭的利益はないと宣言している。

再現性、速度、および低体積スクリーニングは、マイクロ流体混合を用いて、他の既存の方法(例えば、脂質フィルム水和およびエタノール注入)と比較してLNPを形成する重要な利点である。我々は、異なるLNPバッチで観察されるカプセル化効率または粒子サイズに影響を与えなく、この方法の再現性を実証した。これは、Lnpsを含むあらゆる治療が臨床的に利用可能になるための不可欠な基準です。
ここで説明する技術は、わずかな数分の時間スケールでLNP形成をもたらす、ずらしたヘリンボーン微小流体混合を採用しています。この混合は、制御と短縮時間27を混合するために有利である混沌とした対流を使用しています。このミキサーは水相と有機相が互いに効果的に27を包み込むのを可能にする。ずらしてヘリンボーン混合を用いて、以前の研究では、粒子が最小の熱力学的に安定なサイズ32で形成されることを示しており、これは、組成がLNPs27、32、33</...

薬物キャリアは、低細胞毒性、バイオアベイラビリティの増加、および安定性の向上1、2、3を含む典型的な好ましい特性を有する治療を保護し、提供するために使用される。ポリマーナノ粒子、ミセル、および脂質ベースの粒子は、核酸カプセル化および送達4、5、6、7について以前に検討されてきた。脂質は、高い安定性8と生体適合性であるため、リポソーム、および脂質ナノ粒子を含む異なるタイプのナノキャリア系で使用されてきた。LNPは遺伝子送達用核酸を容易に封入できる9,10.それらは、全身循環11の間に血清プロテアーゼによる分解から核酸を保護し、特定の部位への送達を改善することができ、LNPの表面地形および物性がそれらの生物分布12に影響を及ぼす。LNPはまた、組織の浸透と細胞の取り込み9を改善します。これまでの研究では、2018年に米国食品医薬品局(FDA)および欧州医薬品庁によって承認された遺伝性経サイレチン媒介性アミロイドーシス14治療の治療用siRNA治療を含む最初の市販LNPを含むLNP13内でのsiRNAカプセル化の成功が実証されている。最近では、Lnpは、より大きな核酸部分、すなわちmRNAとDNA9の送達のために研究されている。2018年現在、臨床試験を受けている脂質ベースの核酸送達系は~22個あった。さらに、LNPを含むmRNAは現在有力な候補であり、COVID-19ワクチン15,16に採用されている。これらの非ウイルス性遺伝子治療の潜在的な成功は、核酸のカプセル化が高い小さな(〜100nm)、安定した均一な粒子を形成する必要があります。
LNP製剤中の主成分としてのイオン化可能脂質の使用は、複素化、カプセル化、及び送達のeffciciency14に対する利点を示している。イオン化可能な脂質は、典型的には酸解離定数(pKa)を有<7;例えば、ジリノールメチル-4-ジメチルアミノブチレート(D-Lin-MC3-DMA)は、FDA承認LNP製剤に用いられるイオン化可能な脂質を、6.4417のpKaを有する。低pHでは、イオン化可能な脂質上のアミン基がプロトン化され、正に荷電し、mRNAおよびDNA上に負に荷電したリン酸基を有する組立が可能になる。アミンの比率は、「N」、リン酸塩に対する基、「P」、基が組み立てを最適化するために使用される。N/P比は、使用される脂質および核酸に依存し、製剤18によって異なる。形成後、pHは中性または生理学的pHに調節して、治療的投与を可能にすることができる。これらのpH値では、電化可能な脂質も脱プロトン化され、中性表面電荷をLNPに付与する。
このイオン化脂質は、内経脱出19,20にも役立つ。LNPは細胞取り込み中にエンドサイトーシスを受け、細胞細胞質またはDNA貨物にmRNA貨物を核21に送達するためにエンドソームから放出されなければならない。内の内部は、通常、細胞外媒体よりも酸性の環境であり、イオン性脂質を正に22、23に充電する。正に荷電したイオン化可能な脂質は、内膜脂質膜上の負電荷と相互作用し、これが、LNPおよび核酸の放出を可能にする内因性の不安定化を引き起こす可能性がある。異なる電化脂質は、現在、両方のLNP分布の有効性を改善するために研究されている、 ならびに内経体脱出14。
LNPの他の典型的な成分は、ホスファチジルコリン(PC)またはホスホエタノールアミン(PE)脂質などのヘルパー脂質を含む。1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2-ディステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)、および1,2-ジオレオイル-snグリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)が一般的に使用されているヘルパー脂質24,25。DOPEは、反転六角形II(HII)相を形成し、膜融合26によってトランスフェクションを増強することが示されているが、DSPCはその円筒形状27でLNPsを安定化させると考えられている。コレステロールはまた、膜剛性を高めるために製剤に組み込まれ、その後、LNPの安定性を助ける。最後に、脂質共役ポリエチレングリコール(PEG)が、粒子自己集合性27に助けるために必要な立体的障壁を提供するために製剤に含まれる。また、PEG は集約を防止することで LNP のストレージの安定性を向上させます。さらに、PEG はステルスコンポーネントとしてよく使用され、LNP の循環時間を長くすることができます。しかし、この属性はまた、アポリポタンパクE(ApoE)28によって駆動される内因性標的機構を介して肝細胞へのLNPの採用に対する課題を提起する可能性がある。従って、研究は、LNPからのPEGの拡散のためのアシル鎖長さを調査し、短い長さ(C8-14)がLNPから解離し、より長いアシル長28と比較してApoE採用に対してより適性であることを発見した。また、PEGが共役する脂質尾の飽和度合いは、LNPs29の組織分布に影響を与えることを示している。近年、Tween 20は、生物学的薬剤製品製剤に一般的に使用される界面活性剤であり、長い不飽和脂質尾を有するが、PEG-DSPEと比較してリンパ節の排出において高いトランスフェクションを有することが示されたが、これは注射部位29で筋肉を大部分トランスフェクトした。このパラメータは、望ましいLNPバイオディストリビューションを達成するために最適化することができます。
LNPsの形成の従来の方法は、薄膜水和法およびエタノール注入法27を含む。これらは容易に入手できる技術であるが、それらはまた、労働集約的であり、低いカプセル化効率をもたらし、そして27をスケールアップすることは困難である。混合技術の進歩は、より均一な粒子27を開発しながら、スケールアップに適した方法をもたらしました。これらの方法には、T-接合部混合、ずらしてヘリンボーン混合、及び微流体流体力学的集化27が含まれる。各方法は、固有の構造を有するが、全ては、脂質成分を含む有機相を有する核酸を含む水相を迅速に混合することを可能にし、結果として核酸27の高い封入を生じる。このプロトコルでは、マイクロ流体カートリッジを介した迅速かつ制御混合が利用され、ずらしたヘリンボーン混合設計を採用しています。このプロトコルは、LNPを含む核酸の調製、組立、および特性を概説する。

<table><tbody><tr><td>1,2-ジミリストイル-RAC-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール-2000 (C-14 PEG)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880151P</td><td></td></tr><tr><td>10 & micro;l 目盛り付きフィルターのヒント&nbsp;(RNase-、DNase-、DNAフリー)</td><td>USAサイエンティフィック</td><td>1121-3810</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro;l 目盛り付きフィルターチップ (RNase-,DNase-, DNAフリー)</td><td>USA Scientific</td><td>1111-2831</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro;l 斜めフィルターチップ (RNase-,DNase-, DNAフリー)</td><td>USA Scientific</td><td>1120-1810</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro;l 目盛り付きフィルターチップ (RNase-,DNase-, DNAフリー)</td><td>USA Scientific</td><td>1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>3&beta;-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3&beta;-ol (Cholesterol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-823-434</td><td></td></tr><tr><td>BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-823-436</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer 汎用シリンジニードル (BD Blunt Fill Needle 18G)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23-021-020</td><td></td></tr><tr><td>卓上遠心分離機</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Black 96 well plates</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-245-177</td><td></td></tr><tr><td>BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA フリー微量遠心チューブ (1.5mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-380-813</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-002-611</td><td></td></tr><tr><td>コーニング 500ml 真空フィルター/保存ボトルシステム、0.22 um ポア</td><td>コーニング</td><td>430769</td><td></td></tr><tr><td>使い捨て折り畳み毛細血管細胞</td><td>マルバーン</td><td>DTS1070</td><td></td></tr><tr><td>エチルアルコール、ピュア 200 プルーフ</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャー ブランド セミマイクロ キュベット</td><td>サーモフィッシャーScientific</td><td>14955127</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen コニカルチューブ (15 mL) (DNase-RNase-free)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM12500</td><td></td></tr><tr><td>MilliporeSigma Amicon Ultra 遠心フィルターユニット</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>NanoAssemblr Benchtop</td><td>Precision Nanyosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9930</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp;P7589</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R11490</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-004-036</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム・二水和物・粒状</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-004-056</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax i3x</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano</td><td>Malvern</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マイクロ流体混合プラットフォームを用いた遺伝子導入のための脂質ナノ粒子の作製と特性化

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

脂質ベースの薬物キャリアは、サイズが小さく、生体適合性、高いカプセル化効率のために、臨床的および商業的に入手可能な送達システムに使用されてきました。核酸をカプセル化する脂質ナノ粒子(LnPs)の使用は、RNAまたはDNAを分解から保護するのに有利であり、細胞の取り込みを促進する。LNPは、多くの場合、イオン化可能な脂質、ヘルパー脂質、コレステロール、ポリエチレングリコール(PEG)結合脂質を含む複数の脂質成分を含みます。LNPは、イオン化可能な脂質存在に起因する核酸を容易に封入することができ、これは低pHでカチオンであり、負に荷電したRNAまたはDNAとの複合体化を可能にする。ここでLNPは、有機相中の脂質成分と核酸成分を水相で迅速に混合してメッセンジャーRNA(mRNA)またはプラスミドDNA(pDNA)を封入することによって形成される。この混合は精密なマイクロ流体混合プラットフォームを使用して行われ、層流を維持しながらナノ粒子自己集合を可能にする。流体力学のサイズと多分散は、ダイナミック光散乱(DLS)を使用して測定されます。LNP上の有効表面電荷はゼータ電位を測定することによって決定される。カプセル化効率は、蛍光色素を使用して、封じ込められた核酸を定量化することを特徴としている。代表的な結果は、この方法の再現性と、異なる製剤およびプロセスパラメータが開発されたLNPに及ぼす影響を示す。

同じ脂質製剤と6のN/P比を有するLNPの複数のバッチを別々の日に開発し、この技術の再現性を実証した。バッチ1と2は、類似した多分散性を有する重なり合うサイズ分布をもたらした(図2A)2つの異なるバッチ間のサイズまたはカプセル化効率に有意な差は認められなかった(図2B)。カプセル化効率はバッチ毎に高く(&gt;98.5%)、サイズは77 nm LNP直径と類似していた。粒子は、バッチ1の平均多分散指数(PDI)0.15、バッチ2の0.18で均一であった。
製剤パラメータの変化は、N/P比、使用されるイオン化可能脂質、および核酸をカプセル化することに関して、いくつかの小さく、まだ統計的に有意な差を示した。違いが議論されているが、生成されたすべてのLNPは、ほとんどの製剤が95%を超え、粒子サイズが110nm未満で80%を超えるカプセル化...

脂質ナノ粒子は、mRNAおよびDNAカプセル化のためのマイクロ流体混合プラットフォームアプローチを用いて開発される。

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...

このプロトコルは、高い再現性と速度と低い体積で核酸をカプセル化した脂質ナノ粒子を生成するために使用することができます。製剤パラメータは、臨床応用に基づいて所望のバイオ分布を達成するように調整することができる。マイクロ流体カートリッジの標準的なヘリンボーン設計は、混合中に迅速、精密、制御された層流を可能にします。この方法はスケールアップに適しており、均一で高度に封入された粒子を生成します。ウイルス法に依存するほとんどの商業的に承認された遺伝子治療産物では、この手順は、その非ウイルスアプローチが繰り返し投薬が必要なアプリケーションを可能にするので、遺伝子送達に関する洞察を提供することができる。まず、各液体ストック溶液の適切な量を、断続的な渦を伴うガラスバイアルに添加します。表に示されているように、533マイクロリットルの最終容積に200の証拠エタノールを添加した。次に、適切な量のmRNAストックを加え、クエン酸緩衝液で希釈して、所望の濃度で1.5ミリリットルの最終体積を達成します。マイクロ流体チャネルをプライミングするには、まず、表に示すように、プライミングパラメータを計測器ソフトウェアに入力します。次に、器具の蓋を開け、マイクロ流体カートリッジを回転ブロックに入れます。少なくとも500マイクロリットルのエタノールを1ミリリットルのシリンジに積み込み、シリンジ先端に泡やエアギャップが存在しないのに注意し、注射器をカートリッジの右入口に挿入します。5 ミリリットルのシリンジに1.5ミリリットルのクエン酸バッファーをロードし、気泡や隙間が存在しないよう注意し、カートリッジの左入口に注射器を挿入します。2つの15ミリリットルの円錐形チューブをクリップホルダーに入れ、廃棄物容器として機能し、Go"をクリックしてソリューションを混合します。底の青色光が止まっているように、楽器がプライミングを停止したら、遅く開き、円錐形のチューブと注射器を適切に処分します。脂質ナノ粒子形成の場合、表に示されているように適切な製剤パラメータを設定し、あらかじめ調製した脂質ミックスで1ミリリットルのシリンジをロードする。シリンジチップのエアギャップや泡を取り除き、シリンジをカートリッジの右側に挿入します。前に調製した核酸溶液を3ミリリットルのシリンジにロードし、シリンジ先端に気泡やエアギャップが存在しないのを考慮し、注射器をカートリッジの左入口に挿入します。サンプル名でラベル付けされた15ミリリットルのRNAaseフリー円錐チューブを左チューブクリップに入れ、右チューブクリップに15ミリリットルの廃棄物円錐形を入れます。装置の蓋を閉じて Go.Go.をクリックします。脂質および mRNA 溶液はマイクロ流体カートリッジを流れ、脂質ナノ粒子溶液は円錐形のチューブに集められます。製剤プロセスの最後に円錐形のチューブを保持し、その後、PBSと生物学的安全キャビネットの5ミリリットルで脂質ナノ粒子を希釈します。バッファー交換を行うために、まずPBS、遠心分離機の2ミリリットルで100キロダルトン孔サイズの超遠心分離フィルターを前洗いし、次に、底部コンパートメントからPBSを空にします。希釈した脂質ナノ粒子を3回の遠心洗浄用の前洗い超遠心分離フィルターの上部コンパートメントに追加し、フロースルーを破棄し、最初の2回の洗浄後にPBSを超遠心分離フィルターに5ミリリットル加えます。最後の洗浄後、超遠心分離フィルターの壁に対して脂質ナノ粒子溶液をピペットし、ナノ粒子溶液をヌクレアーゼを含まないバイアルに移す前にナノ粒子の損失を最小限に抑える。次にPBSを添加し、必要に応じてナノ粒子懸濁液を適切な実験濃度及び体積に持ち込む。脂質ナノ粒子のカプセル化効率を評価するために、まずPBSで働く核酸溶液の2倍の連続希釈を調製して標準曲線を生成し、1ミリリットル当たり500ナノグラムから始まり、少なくとも5つの希釈液を作る。次に、PBSでナノ粒子サンプル希釈液を調製し、標準曲線の中間点の周りにある適切な理論濃度を達成する。次に、リボグリーンRNA試薬を調製し、適切な量のRNA試薬であるTriton X100とPBSを混合して、脂質ナノ粒子の内外のRNAの存在を検出します。次いで、液体ナノ粒子の外側のRNAの存在を検出し、適切な量のRNA試薬とPBSのみを混合する。核酸標準溶液と脂質ナノ粒子溶液を黒色蛍光度対応96ウェルプレートに積み込み、その後、トリトンX100を用いて、かつトリトンX100を使用せず、等量のRNA定量試薬を加え、サンプル複製を行います。プレートリーダーのプレートを光から保護された室温で5分間振ってサンプルの完全な混合を得てから、マイクロプレートリーダーの蛍光を480ナノメートルの励起波長と520ナノメートルの発光波長で測定します。脂質ナノ粒子の流体力学的サイズおよびポリ分散度を測定するために、まずPBSでナノ粒子溶液を40回希釈し、その溶液をセミマイクロキュベットに加える。ゼタサイザーにキュヴェットをロードし、材料、分散剤、温度および細胞タイプに従ってナノ粒子を測定する器具を設定する標準的な操作手順を選択する。次に「開始」をクリックして、脂質ナノ粒子の流体力学サイズとポリ分散度を測定します。脂質ナノ粒子のゼータ電位を測定するには、ナノ粒子溶液をヌクレアーゼを含まない水で40倍希釈し、溶液をキュベットに充填ラインにロードする。電極が機器と接触するように、ゼータ電位分析装置にキュベットをロードし、脂質ナノ粒子の特定の構成に応じてゼータ電位を測定する装置を設定します。次に「開始」をクリックして、ゼータの脂質ナノ粒子電位を測定します。この分析では、同じ脂質製剤とアミン対リン酸比を有する脂質ナノ粒子の複数のバッチを別々の日に開発し、その技術の再現性を実証した。観察されたように、バッチ1と2は、類似したポリ分散性を有する重複サイズ分布を示し、バッチ間のサイズまたはカプセル化効率に有意な差は認められなかった。典型的には、製剤パラメータの変化は、いくつかの小さいけれども統計的に有意な差を誘発する。例えば、アミン対リン酸比を減少させると、カプセル化効率が4%減少し、ナノ粒子の流体力学的直径が増加する。脂質ナノ粒子は、異なるイオン化可能脂質を配合したが、同じアミン対リン酸比を用いて、カプセル化効率の著しい変化を示すとともに、粒子径のわずかな違いを示す。プラスミドDNAのカプセル化は、mRAカプセル化された脂質ナノ粒子と比較してより大きな粒子をもたらすが、両方のタイプのナノ粒子は同様のカプセル化効率を示す。しかし、流量プロセスパラメータの変化は、脂質ナノ粒子の発達に影響を与えない。脂質ナノ粒子は素晴らしい用途を持ち、完璧な例は最近承認されたCOVID-19ワクチンである。この技術は、優れたツールセットとして機能し、下肢製剤スクリーニングを可能にすることによって、将来のアプリケーションへの道を開きます。

formulating-characterizing-lipid-nanoparticles-for-gene-delivery

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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細胞の急速な機械的な変形は高分子およびナノ物質の細胞内送達のための有望な、ベクトルフリー法として浮上している。このプロトコルは、幅広いアプリケーションのためのシステムを使用する方法の詳細な手順を提供しています。...

堅牢、マイクロ流体細胞内送達プラットフォームとしての細胞絞る

液滴界面の脂質二重層に対するマイクロ流体噴射は、膜の非対称性、膜貫通タンパク質の取り込み、および材料のカプセル化を制御して小胞を生成するための信頼できる方法を提供します。この技術は、区画化された生体分子が所望される生体系の様々な研究に適用することができる。...

マイクロ流体ジェッティングを使用して、脂質二重層小胞の生成

学ぶマイクロ流体混合プラットフォームを用いた脂質ナノ粒子の作製法。核酸封入効率と粒子サイズの制御により、遺伝子導入の非ウイルスベクターとして再現性の高いナノ医療技術を確立します。

マイクロ流体混合プラットフォームを用いた遺伝子導入のための脂質ナノ粒子の作製と特性化

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