マイクロ流体混合プラットフォームを用いた遺伝子導入のための脂質ナノ粒子の作製と特性化

このプロトコルは、高い再現性と速度と低い体積で核酸をカプセル化した脂質ナノ粒子を生成するために使用することができます。製剤パラメータは、臨床応用に基づいて所望のバイオ分布を達成するように調整することができる。マイクロ流体カートリッジの標準的なヘリンボーン設計は、混合中に迅速、精密、制御された層流を可能にします。

この方法はスケールアップに適しており、均一で高度に封入された粒子を生成します。ウイルス法に依存するほとんどの商業的に承認された遺伝子治療産物では、この手順は、その非ウイルスアプローチが繰り返し投薬が必要なアプリケーションを可能にするので、遺伝子送達に関する洞察を提供することができる。まず、各液体ストック溶液の適切な量を、断続的な渦を伴うガラスバイアルに添加します。

表に示されているように、533マイクロリットルの最終容積に200の証拠エタノールを添加した。次に、適切な量のmRNAストックを加え、クエン酸緩衝液で希釈して、所望の濃度で1.5ミリリットルの最終体積を達成します。マイクロ流体チャネルをプライミングするには、まず、表に示すように、プライミングパラメータを計測器ソフトウェアに入力します。

次に、器具の蓋を開け、マイクロ流体カートリッジを回転ブロックに入れます。少なくとも500マイクロリットルのエタノールを1ミリリットルのシリンジに積み込み、シリンジ先端に泡やエアギャップが存在しないのに注意し、注射器をカートリッジの右入口に挿入します。5 ミリリットルのシリンジに1.5ミリリットルのクエン酸バッファーをロードし、気泡や隙間が存在しないよう注意し、カートリッジの左入口に注射器を挿入します。

2つの15ミリリットルの円錐形チューブをクリップホルダーに入れ、廃棄物容器として機能し、Go"をクリックしてソリューションを混合します。底の青色光が止まっているように、楽器がプライミングを停止したら、遅く開き、円錐形のチューブと注射器を適切に処分します。脂質ナノ粒子形成の場合、表に示されているように適切な製剤パラメータを設定し、あらかじめ調製した脂質ミックスで1ミリリットルのシリンジをロードする。

シリンジチップのエアギャップや泡を取り除き、シリンジをカートリッジの右側に挿入します。前に調製した核酸溶液を3ミリリットルのシリンジにロードし、シリンジ先端に気泡やエアギャップが存在しないのを考慮し、注射器をカートリッジの左入口に挿入します。サンプル名でラベル付けされた15ミリリットルのRNAaseフリー円錐チューブを左チューブクリップに入れ、右チューブクリップに15ミリリットルの廃棄物円錐形を入れます。

装置の蓋を閉じて Go.Go.をクリックします。脂質および mRNA 溶液はマイクロ流体カートリッジを流れ、脂質ナノ粒子溶液は円錐形のチューブに集められます。製剤プロセスの最後に円錐形のチューブを保持し、その後、PBSと生物学的安全キャビネットの5ミリリットルで脂質ナノ粒子を希釈します。バッファー交換を行うために、まずPBS、遠心分離機の2ミリリットルで100キロダルトン孔サイズの超遠心分離フィルターを前洗いし、次に、底部コンパートメントからPBSを空にします。

希釈した脂質ナノ粒子を3回の遠心洗浄用の前洗い超遠心分離フィルターの上部コンパートメントに追加し、フロースルーを破棄し、最初の2回の洗浄後にPBSを超遠心分離フィルターに5ミリリットル加えます。最後の洗浄後、超遠心分離フィルターの壁に対して脂質ナノ粒子溶液をピペットし、ナノ粒子溶液をヌクレアーゼを含まないバイアルに移す前にナノ粒子の損失を最小限に抑える。次にPBSを添加し、必要に応じてナノ粒子懸濁液を適切な実験濃度及び体積に持ち込む。

脂質ナノ粒子のカプセル化効率を評価するために、まずPBSで働く核酸溶液の2倍の連続希釈を調製して標準曲線を生成し、1ミリリットル当たり500ナノグラムから始まり、少なくとも5つの希釈液を作る。次に、PBSでナノ粒子サンプル希釈液を調製し、標準曲線の中間点の周りにある適切な理論濃度を達成する。次に、リボグリーンRNA試薬を調製し、適切な量のRNA試薬であるTriton X100とPBSを混合して、脂質ナノ粒子の内外のRNAの存在を検出します。

次いで、液体ナノ粒子の外側のRNAの存在を検出し、適切な量のRNA試薬とPBSのみを混合する。核酸標準溶液と脂質ナノ粒子溶液を黒色蛍光度対応96ウェルプレートに積み込み、その後、トリトンX100を用いて、かつトリトンX100を使用せず、等量のRNA定量試薬を加え、サンプル複製を行います。プレートリーダーのプレートを光から保護された室温で5分間振ってサンプルの完全な混合を得てから、マイクロプレートリーダーの蛍光を480ナノメートルの励起波長と520ナノメートルの発光波長で測定します。

脂質ナノ粒子の流体力学的サイズおよびポリ分散度を測定するために、まずPBSでナノ粒子溶液を40回希釈し、その溶液をセミマイクロキュベットに加える。ゼタサイザーにキュヴェットをロードし、材料、分散剤、温度および細胞タイプに従ってナノ粒子を測定する器具を設定する標準的な操作手順を選択する。次に「開始」をクリックして、脂質ナノ粒子の流体力学サイズとポリ分散度を測定します。

脂質ナノ粒子のゼータ電位を測定するには、ナノ粒子溶液をヌクレアーゼを含まない水で40倍希釈し、溶液をキュベットに充填ラインにロードする。電極が機器と接触するように、ゼータ電位分析装置にキュベットをロードし、脂質ナノ粒子の特定の構成に応じてゼータ電位を測定する装置を設定します。次に「開始」をクリックして、ゼータの脂質ナノ粒子電位を測定します。

この分析では、同じ脂質製剤とアミン対リン酸比を有する脂質ナノ粒子の複数のバッチを別々の日に開発し、その技術の再現性を実証した。観察されたように、バッチ1と2は、類似したポリ分散性を有する重複サイズ分布を示し、バッチ間のサイズまたはカプセル化効率に有意な差は認められなかった。典型的には、製剤パラメータの変化は、いくつかの小さいけれども統計的に有意な差を誘発する。

例えば、アミン対リン酸比を減少させると、カプセル化効率が4%減少し、ナノ粒子の流体力学的直径が増加する。脂質ナノ粒子は、異なるイオン化可能脂質を配合したが、同じアミン対リン酸比を用いて、カプセル化効率の著しい変化を示すとともに、粒子径のわずかな違いを示す。プラスミドDNAのカプセル化は、mRAカプセル化された脂質ナノ粒子と比較してより大きな粒子をもたらすが、両方のタイプのナノ粒子は同様のカプセル化効率を示す。

しかし、流量プロセスパラメータの変化は、脂質ナノ粒子の発達に影響を与えない。脂質ナノ粒子は素晴らしい用途を持ち、完璧な例は最近承認されたCOVID-19ワクチンである。この技術は、優れたツールセットとして機能し、下肢製剤スクリーニングを可能にすることによって、将来のアプリケーションへの道を開きます。