Name: 一次マウス網膜色素上皮細胞の効率的解離と培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 学ぶ一次マウス網膜色素上皮細胞の効率的解離と培養法。酵素処理とラミニンコートTranswellを用いて、3日で融合した高極性RPE単層を樹立し、加齢性黄斑変性などの眼疾患の病態研究と治療薬スクリーニングに活用できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、マサチューセッツ眼と耳の眼ゲノミクス研究所によって支えられた。

眼科および視覚研究における動物の使用に関するARVO声明のガイドラインに従った。
注:この方法は、C57BL / 6J、B10を含む異なる遺伝的背景のマウスで成功することが証明されています。D2-Hco H2d H2-T18c/oSnJ,およびアルビノマウスは、様々な年齢で。好ましくは、RPE細胞を得るために8〜12週齢のマウスを使用する。古いマウスのRPE細胞は培養中に増殖が少なく、若いマウスは細胞が少なく、細胞が少なく、生存可能な培養物を持つために異なる動物から目をプールする必要があります。
試薬の調製と膜挿入物
<ol><li>以下の試薬を準備します。<ol>
<li>HBSS-H−(カルシウムなしHBSS、マグネシウムバッファーなし+10 mM HEPES):HBSS-(Ca/Mgなし)バッファの99 mLに1 M HEPESの1 mLを追加します。4°Cで1ヶ月まで保管してください。</li>
		<li>HBSS-H+(カルシウム付きHBSS、マグネシウムバッファー+ 10 mM HEPES)を準備する:HBSS+(Ca/ Mg付き)バッファの99 mLに1 M HEPESの1 mLを追加します。4°Cで1ヶ月まで保管してください。</li>
		<li>ヒアルロニダーゼ溶液(1mg/mL):10mgのヒアルロニダーゼをHBSS-H−の10 mLに加え、10 mLシリンジを使用して0.4 μmの滅菌シリンジフィルターでフィルターします。使用前に新鮮な準備をし、室温(RT;20-25°C)にしておきます。</li>
		<li>FBSソリューションを準備する:HBSS-H+と20%FBSをミックス。HBSS-H+の8 mLにFBSの2 mLを加えます。使用前に新鮮な準備をしてください。</li>
		<li>RPE培地を準備する:N1培地サプリメント1/100(v/v)、グルタミン1/100(v/v)、ペニシリンストレプトマイシン1/100(v/v)および非必須アミノ酸溶液1/100(v/ v)、ヒドロコルチゾン(20μg/L)、タウリン(250mg/L)およびトリヨード-チロニン(0.013 μg/L)をアルファMEM+ 5%FBSまたはFBS1、23、24なしにする。必要に応じて、FBS は熱不活化する可能性があります。違いは認められてない。RPE分離のために新鮮な準備をします。細胞培養のメンテナンスのため、4°Cで1ヶ月まで保管してください。</li>
		<li>トリプシン-EDTAを準備する:新鮮なトリプシンEDTA(0.25%)の小さな単独使用アリコート(約8 mL)を準備するそして-20 oCでそれらを凍結する。各使用前にRTでそれらを解凍します。フリーズ解凍サイクルを避けてください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>膜挿入物(例えば、トランスウェル挿入物)を準備します。<ol>
<li>6.5mm膜インサートを37°Cで30分間、5%CO2-気泡インキュベーターで30分間、RPE培地と平衡化します。1つの膜挿入物を使用して、2つのマウスの目からRPE細胞をシードします。</li>
		<li>インキュベーション後、下部コンパートメントの培地を700 μLのPBSに交換します。</li>
		<li>上部コンパートメントから培地を取り出し、100 μLのマウスラミニン(PBS)を100 μLの100 μLのRTで少なくとも2時間コーティングします(インキュベーションが短いほど、細胞のインサートへの取り付けが不十分になる可能性があります)。</li>
		<li>TER測定用のブランクとして使用する余分な膜挿入物をコーティングします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. マウスの目の解剖と核形成
<ol><li>マウスをCO2チャンバーに入れ、1分間に30~70%の充填率でゆっくりとCO2を放出することにより、CO2窒息によりマウスを安楽死させます。</li>
	<li>マウスの目の両側にマイクロ鉗子の角度付きの鋸歯状の先端を置き、眼球をプロプロトーゼ(核)に軽く押します。</li>
	<li>眼球の周りに配置された鉗子を閉じます。次に、前方と後方に移動しながら穏やかに引っ張って眼筋から視神経で目全体を切り離し、結合組織が瘢包に付着したままにならないようにします。</li>
	<li>70%エタノールで核眼球をリンスしてから、氷の上に3 mLのHBSS-H-Lを持つ6ウェルプレートの1ウェルに入れます。</li>
	<li>マウスの 2 番目の目を削除するには、手順 2.2 ~ 2.4 を繰り返します。30分以内に次のステップに進みます。 注:経験が得られるまで、一度に2つの目だけを核/解剖することをお勧めします。</li>
</ol>3. RPEの収集
注:層流フードの無菌条件下で以下の手順を実行します。RPE細胞死を引き起こす可能性のある氷上の拡張インキュベーションを避けるために、一度に2つ以上の目を集めないでください。
<ol><li>解剖した実体顕微鏡、デュモン#5鉗子、斜めのはさみを使用して、強眼球に切断することなく、眼球に取り付けられたすべての結合組織、血液および筋肉を慎重にきれいにします。HBSS-H-バッファの 3 mL を必要に応じて定期的に変更して、目を新鮮で清潔に保ち、RPE 培養物の汚染を避けてください。</li>
	<li>眼球を保持し、鋭い炭素鋼の#11刃で角膜の中央に穴を開けるハンドルとして視神経を使用してください。</li>
	<li>デュモン#5はさみを使用して、前述の穴を通して角膜に3回の切開を行い、レンズを取り外す十分なスペースがあることを確認します。</li>
	<li>視神経を保持し、レンズが完全に出てくるまで斜めのはさみのベースで、オラ・コナラにわずかな圧力を加えます。インキュベーション中に神経網膜とRPEの剥離を防ぐために、虹彩上皮を所定の位置に残します。目をHBSS-Hバッファに入れます。</li>
	<li>ステップ 3.1 ~ 3.4 を繰り返して、2 番目の目を解剖します。</li>
	<li>37°Cの12ウェルプレートにヒアルロニダーゼ溶液にレンズを入れずに目をインキュベートし、5%CO2-気泡インキュベーター(1.5 mL/well)で45分間、RPEから神経網膜を取り外します。</li>
	<li>各目を新しい井戸に入れ、氷の上で30分間、1.5 mLの冷たいHBSS-H+バッファーをウェルあたりでインキュベートし、ヒアルロニダーゼ活性を止めます。インキュベーションを45分以上延長しないでください。</li>
	<li>洗浄し、新鮮なHBSS-H +バッファを持つ35mmの培養皿に各目を入れ、8cmのヴァンナハサミを使用して、オラセラタに到達するまで元の切開を通して角膜をカットします。次いで、オレ・コナラの下に切り、虹彩上皮および角膜を除去する。</li>
	<li>湾曲したピンセットでアイカップエッジ/オロラセラタを保持し、角度付きマイクロ鉗子を使用して、RPE層が切断されないことを確認するために神経のretinaを引き離します。その後、視神経への内部付着を切断する。一部のRPE細胞が神経残りに付着したままの場合は、インキュベーション時間を延長しますが、合計で45分を超えません。</li>
	<li>視神経を切り、各眼球を1.5mLの新鮮なトリプシン-EDTAを含む別の12ウェルプレートに移します。眼のコップが開いたままで、トリプシンに完全に沈んだままであることを確認してください。37°Cで5%CO2インキュベーターで45分間、眼球をインキュベートします。</li>
	<li>トリプシンインキュベーション中に取り外したRPEシートと一緒に各アイカップを収集し、ウェルあたり1.5 mLのFBS溶液を含む12ウェルプレートに転送します。RPEシートがトリプシン溶液に残っている場合は、マイクロピペットを使用してFBS溶液でウェルに転送します。</li>
</ol>4. プライマリマウスRPE細胞の分離
<ol><li>視神経で各眼球を保持し、RPEシートの完全な剥離が達成されるまで、HBSS-H+で20%FBSの1.5 mLを含む12ウェルプレートに下に振ります。</li>
	<li>マイクロピペットを使用してRPEシートとRPEクラスタを収集し、15mLチューブに入れます。白い白い部分の白い部分の白い部分は、培養を汚染する可能性があり、または脈絡膜を避ける。1つのチューブに同じマウスから2つの目をプールします。</li>
	<li>340 x g で2分間RTで遠心分離し、上清を捨てます。</li>
	<li>リプシン-EDTAの1 mLでRPEペレットを穏やかに再懸濁(0.25%)37°Cの水浴中で1分間インキュベートし、RPEシートを単一細胞に分解します。インキュベーション後、マイクロピペットで10倍上下に軽くピペットを入れ、ピペットしながら泡形成を避けます。</li>
	<li>9 mLの新しく調製した RPE 培地を加えて、トリプシンを希釈し、不活性化し、340 x g で混合物を RT で 2 分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を吸引し、マイクロピペットを使用して5%FBSのRPE培地中の細胞ペレットを150μL慎重に再懸濁し、細胞が均一に再懸濁されることを保証し、ピペット化しながら気泡形成を回避します。</li>
	<li>ステップ1.2からラミニンコーティング膜挿入物を取り、底のチャンバからPBSを取り出し、RPE培地の700 μLを加えます。</li>
	<li>膜挿入液の上部チャンバーからラミニンを取り出し、RPE細胞懸濁液をチャンバの中央にドロップして均一に分配し、ピペット処理中に泡形成を回避します。</li>
	<li>膜インサートを37°Cの5%CO2インキュベーターに入れ、少なくとも24時間は邪魔しません。</li>
	<li>24時間後、顕微鏡下の膜挿入物を調べて、ほとんどのRPE細胞が挿入物に取り付けられ、合流率が少なくとも50%であることを確認してください(図1A)。最初の 72 時間の間にメディアを変更しないことが重要です。</li>
</ol>5. 偏光RPE単層の培養
<ol><li>細胞の取り付けができるようにRPE培地をリフレッシュする前に、培養中の単離されたRPE細胞を少なくとも72時間維持してください。播種時に50%以上の細胞合流は、適切な偏光RPE単層の形成に必要な基本である。</li>
	<li>細胞が結合された後に、新鮮で事前に温めたRPE培地(ステップ1.1.5)を使用して、週2回培養培地を変更する。血清は、最初の72時間後に培養培地から除去することができる。 注:培養の1週間後、細胞はコンフルエント、六角形、二核、色素沈着および偏光(図1B)で、予想される細胞数は6.5mmトランスウェル挿入物あたり約50,000細胞であるべきである。培養で2週間後、健康な細胞を含むRPE単層が観察される。RPE カルチャには、補助的なマイクロビリ、基底面の折り畳み、およびタイトな接合部が表示されます (図 1C)。</li>
</ol>6. TER測定
注: 培養で最低 4 日後に RPE 細胞の TER 測定を行い、RPE 単層の良好な整合性と分極化を確保してください。
<ol><li>70%エタノールでボルトメータの電極を洗浄し、慎重に乾燥させます。</li>
	<li>インキュベーターからトランスウェルを取り出し、温度変動による変化を避けるために3分以内にTER測定を行います。TERを測定するために、ボルトメーターの短い電極を上部チャンバーに浸し、長い電極を膜挿入部の底面チャンバーに浸す。細胞の剥離を防ぐためにRPE単層との接触を避けてください。</li>
	<li>TERを計算するには、試料からブランク(細胞のないラミニンでコーティングされた膜挿入)の値を差し引く。次に、得られた値(オームで)に膜挿入物の表面積(6.5mm膜挿入物の場合は0.33cm2)を掛けます。製品は、培養72時間後に少なくとも200 Ω x cm2でなければなりません。TER 値は、2 週間後に 400 Ω x cm2を超える値を測定する必要があります。TER 値が小さい RPE カルチャを破棄します。</li>
</ol>

<ol><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li>
<li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li>
<li>Konari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+blood-retinal+barrier+in+vitro%3A+Formation+of+tight+junctions+as+revealed+by+occludin+and+ZO-1+correlates+with+the+barrier+function+of+chick+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Development of the blood-retinal barrier in vitro: Formation of tight junctions as revealed by occludin and ZO-1 correlates with the barrier function of chick retinal pigment epithelial cells.</a> Experimental Eye Research. 61 (1), 99-108 (1995).</li>
<li>Kay, P., Yang, Y. C., Paraoan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+protein+secretion+by+the+retinal+pigment+epithelium%3A+Roles+in+retinal+health+and+the+development+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Directional protein secretion by the retinal pigment epithelium: Roles in retinal health and the development of age-related macular degeneration.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 833-843 (2013).</li>
<li>Johnson, L. V., Leitner, W. P., Staples, M. K., Anderson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+activation+and+inflammatory+processes+in+drusen+formation+and+age+related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Complement activation and inflammatory processes in drusen formation and age related macular degeneration.</a> Experimental Eye Research. 73 (6), 887-896 (2001).</li>
<li>Hageman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+hypothesis+that+considers+drusen+as+biomarkers+of+immune-mediated+processes+at+the+RPE-Bruch%27s+membrane+interface+in+aging+and+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">An integrated hypothesis that considers drusen as biomarkers of immune-mediated processes at the RPE-Bruch's membrane interface in aging and age-related macular degeneration.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 20 (6), 705-732 (2001).</li>
<li>Lommatzsch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+low+inflammatory+reactions+involved+in+exudative+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Graefe%27s+Archive+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Are low inflammatory reactions involved in exudative age-related macular degeneration.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (6), 803-810 (2008).</li>
<li>Bandyopadhyay, M., Rohrer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase+activity+creates+pro-angiogenic+environment+in+primary+human+retinal+pigment+epithelial+cells+exposed+to+complement%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase activity creates pro-angiogenic environment in primary human retinal pigment epithelial cells exposed to complement.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (4), 1953-1961 (2012).</li>
<li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+local+complement+response+by+RPE+causes+early-stage+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">A local complement response by RPE causes early-stage macular degeneration.</a> Human Molecular Genetics. 24 (19), 5555-5569 (2015).</li>
<li>Fernandez-Godino, R., Bujakowska, K. M., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+extracellular+matrix+cause+RPE+cells+to+make+basal+deposits+and+activate+the+alternative+complement+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Changes in extracellular matrix cause RPE cells to make basal deposits and activate the alternative complement pathway.</a> Human Molecular Genetics. 27 (1), 147-159 (2018).</li>
<li>Fernandez-Godino, R., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C3a+triggers+formation+of+sub-retinal+pigment+epithelium+deposits+via+the+ubiquitin+proteasome+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">C3a triggers formation of sub-retinal pigment epithelium deposits via the ubiquitin proteasome pathway.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li>
<li>Farkas, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+Pre-mRNA+processing+factors+3%2C+8%2C+and+31+cause+dysfunction+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Mutations in Pre-mRNA processing factors 3, 8, and 31 cause dysfunction of the retinal pigment epithelium.</a> American Journal of Pathology. 184 (10), 2641-2652 (2014).</li>
<li>Geisen, P., Mccolm, J. R., King, B. M., Hartnett, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Barrier+Properties+and+Inducible+VEGF+Expression+of+Several+Types+of+Retinal+Pigment+Epithelium+in+Medium-Term+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of Barrier Properties and Inducible VEGF Expression of Several Types of Retinal Pigment Epithelium in Medium-Term Culture.</a> Current Eye Research. 31, 739(2006).</li>
<li>Schütze, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+pigment+epithelium+findings+in+patients+with+albinism+using+wide-field+polarization-sensitive+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Retinal pigment epithelium findings in patients with albinism using wide-field polarization-sensitive optical coherence tomography.</a> Retina. 34 (11), 2208-2217 (2014).</li>
<li>Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+retinal+pigment+epithelium+dysfunction+is+concomitant+with+hyperglycemia+in+mouse+models+of+type+1+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).</li>
<li>Garland, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+genetics+and+proteomic+analyses+demonstrate+a+critical+role+for+complement+in+a+model+of+DHRD%2FML%2C+an+inherited+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mouse genetics and proteomic analyses demonstrate a critical role for complement in a model of DHRD/ML, an inherited macular degeneration.</a> Human Molecular Genetics. 23 (1), 52-68 (2014).</li>
<li>Fu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+R345W+mutation+in+EFEMP1+is+pathogenic+and+causes+AMD-like+deposits+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">The R345W mutation in EFEMP1 is pathogenic and causes AMD-like deposits in mice.</a> Human Molecular Genetics. 16 (20), 2411-2422 (2007).</li>
<li>Greenwald, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Models+of+NMNAT1-Leber+Congenital+Amaurosis+%28LCA9%29+Recapitulate+Key+Features+of+the+Human+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Mouse Models of NMNAT1-Leber Congenital Amaurosis (LCA9) Recapitulate Key Features of the Human Disease.</a> American Journal of Pathology. 186 (7), 1925-1938 (2016).</li>
<li>Gupta, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ift172+conditional+knock-out+mice+exhibit+rapid+retinal+degeneration+and+protein+trafficking+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Ift172 conditional knock-out mice exhibit rapid retinal degeneration and protein trafficking defects.</a> Human Molecular Genetics. 27 (11), 2012-2024 (2018).</li>
<li>Gibbs, D., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigmented+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).</li>
<li>Bonilha, V. L., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ezrin+promotes+morphogenesis+of+apical+microvilli+and+basal+infoldings+in+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ezrin promotes morphogenesis of apical microvilli and basal infoldings in retinal pigment epithelium.</a> Journal of Cell Biology. 147 (7), 1533-1547 (1999).</li>
<li>Nandrot, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+synchronized+retinal+phagocytosis+and+age-related+blindness+in+mice+lacking+%CE%B1v%CE%B25+integrin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking αvβ5 integrin.</a> Journal of Experimental Medicine. 200 (12), 1539-1545 (2004).</li>
<li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).</li>
<li>Maminishkis, A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+for+study+of+retinal+pigment+epithelial+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).</li>
<li>Brydon, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-Mediated+Gene+Augmentation+Therapy+Restores+Critical+Functions+in+Mutant+PRPF31%2B%2F%E2%88%92+iPSC-Derived+RPE+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+and+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">AAV-Mediated Gene Augmentation Therapy Restores Critical Functions in Mutant PRPF31+/− iPSC-Derived RPE Cells.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 15, 392-402 (2019).</li>
<li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. 2018 (133), (2018).</li>
<li>Bonilha, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+and+disease-related+structural+changes+in+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Age and disease-related structural changes in the retinal pigment epithelium.</a> Clinical Ophthalmology. 2 (2), 413(2008).</li>
</ol>

著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

マウスRPE細胞の分離および培養のためのいくつかの方法は、1、13、20、22、26、27の前に開発されていたが、フェルナンデス・ゴディーノの方法は、最初に培養1、9の培養でRPE細胞の効率的な増殖を可能にする膜挿入物を使用した。プロトコル1,9のもう一つの大きな変化は、RPE細胞1、13、20、26</sup...

このプロトコルは、2016年1年にフェルナンデス・ゴディーノらによって報告されたもので、トランスウェルプレート上で1週間以内に機能的で偏極したRPE単層を形成するマウス網膜色素上皮(RPE)細胞を効率的に単離および培養する方法を説明している。RPEは、神経性のレティナとブルッフの膜の間の目に位置する単層である。この単層は、高偏光性および色素上皮細胞で構成され、密接する接合によって結合され、ハニカム2に似た六角形の形状を呈する。この明らかな組織学的な単純さにもかかわらず、RPEは、レチナおよび正常な視覚サイクル2、3、4に不可欠な多種多様な機能を実行する。RPE単層の主な機能は、光吸収、感光体の栄養および再生、代謝末端産物の除去、経皮下腔内のイオン恒常性の制御および血液-筋バリア2、3の維持を含む。RPEはまた、眼5、6、7、8、9、10、11の免疫系の局所的な調節において重要な役割を果たしている。RPEの変性および/または機能不全は、網膜色素変性症、レーバー先天性アマウロシス、アルビニズム、糖尿病性網膜症、および黄斑変性症12、13、14、15のような多くの眼疾患によって共有される共通の特徴である。残念ながら、人間の組織の入手可能性は限られています。人間との高度に保存された遺伝的相同性を考えると、マウスモデルは、眼疾患16、17、18、19を研究するための適切で有用なツールを表す。さらに、培養された一次RPE細胞の使用は、これらの視力を脅かす障害9,11に対する新たな治療法の開発を加速することができる遺伝子操作および薬物検査などの利点を提供する。
マウスのRPEの分離と培養に利用可能な既存の方法は再現性に欠け、十分な信頼性を持つ生体内のRPE機能を再現しません。細胞は、培養13,20において数日内に色素沈着、六角形および後上皮電気抵抗(TER)を失う傾向がある。マウスからこれらの主要なRPE細胞培養を確立することは困難なプロセスであるため、この最適化されたプロトコルは、ラットおよびヒトの目21、22、23からRPE細胞を分離してマウスの目を解剖し、インビトロでマウスRPE細胞を培養する他のプロトコルに基づいて作成された。

<table><tbody><tr><td>10 ml BD Luer-Lokチップシリンジ、使い捨て</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 遠心分離管</td><td>VWR International</td><td>21008-103</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 遠心分離管</td><td>VWR International</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>Alpha Minimum Essential Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4526-500ML</td><td></td></tr><tr><td>角度付きマイクロ鉗子</td><td>WPI</td><td>501727</td><td></td></tr><tr><td>卓上遠心分離</td>機 <td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 インキュベーター</td><td>Thermo</td><td>HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'S Phospate Buffered Saline No Calcium, no Magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 45&deg;医学生物学用ピンセット、0.05 x 0.01 mm チップ、長さ 11 cm</td><td>WPI</td><td>14101</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン イージーグリップ クリア ポリスチレン 細胞培養皿、35mm</td><td>BD Biosciences</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ハイクロン</td><td>SH30071.03</td><td>熱不活性化。</td></tr><tr><td>ハンクバランスの取れた塩溶液とカルシウムとマグネシウム、フェノールレッド</td>ライフ<td>テクノロジー</td>ズ<td></td>14175095<td></td></tr><tr><td>ハンクs バランス塩溶液とカルシウム、マグネシウム、フェノールなし レッド B6</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Gibco</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>ヒアルロニダーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-3506 1G</td><td></td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-0396</td><td></td></tr><tr><td>層流フード</td><td>Thermo</td><td>CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA</td><td></td></tr><tr><td>ラミニン 1mg/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020-1 MG</td><td>PBSで37°Cから1mg/mLに希釈</td></tr><tr><td>McPherson-Vannasマイクロハサミ 長さ8cm</td>の<td>WPI</td><td>503216</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸 100X</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>N1 Supplement 100X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6530-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>滅菌済みバード・パーカー 炭素鋼製外科用ブレード サイズ 11</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>08-914B</td><td></td></tr><tr><td>タウリン</td><td>・シグマ・アルドリッチ</td><td>T-0625</td><td></td></tr><tr><td>組織培養処理済み 12ウェルプレート</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>08-772-29</td><td></td></tr><tr><td>組織培養処理済み 6ウェルプレート</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>14-832-11</td><td></td></tr><tr><td>トランズウェル対応 6.5mm</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>CLS3470-48EA</td><td></td></tr><tr><td>Triiodo-thyronin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-5516</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)、フェノールレッド</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Tweezer、Dumont #5 Medical Biology 11 cm、湾曲、ステンレス鋼 0.02 x 0.06 mm Mod tips</td><td>WPI</td><td>500232</td><td></td></tr><tr><td>Vannas はさみ 8cm 長、ステンレス鋼</td><td></td><td>WPI 501790</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Puradisc 25mmシリンジフィルター0.45&mu;m孔径</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>6780-2504</td><td></td></tr></tbody></table>

一次マウス網膜色素上皮細胞の効率的解離と培養

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

眼疾患は世界中の何百万人もの人々に影響を与えますが、人間の組織の利用可能性が限られていると研究が妨げられています。マウスモデルは、人体解剖学や生理学と類似しているため、眼疾患の病態生理を理解するための強力なツールです。網膜色素上皮(RPE)の変化は、形態および機能の変化を含め、多くの眼疾患によって共有される共通の特徴である。しかし、プライマリマウスRPE細胞の分離と培養は非常に困難です。この論文は、フェルナンデス・ゴディーノら2016年に発表されたプロトコルの更新された視聴覚バージョンであり、プライマリマウスRPE細胞を効率的に単離して培養する。この方法は非常に再現性が高く、トランスウェルズで数週間維持できる高度に偏光性および色素性の高いRPE単層の堅牢な培養を生じる。このモデルは、眼疾患の根底にある分子および細胞メカニズムの研究のための新しい道を開く。さらに、遺伝性の疾患や黄斑の過大代を含む、満たされていない医療ニーズを持つ重要な眼疾患を治療するために使用できる治療アプローチをテストするためのプラットフォームを提供します。

このプロトコルは、遺伝子組み換えマウス1からRPE細胞を単離および培養するために使用されてきた。マウス株や性別の間に違いは認められてはいない。この結果は、高齢者9の視力低下の最も一般的な原因である加齢黄斑変性症などの眼疾患のメカニズムの重要な側面を理解するのに役立った。このプロトコルに従って単離されたRPE細胞は、播種後24時間後に膜挿入物に完全に付着し、72時間1後に典型的なRPEサイズ、形態および色素沈着を示した。1週間後、高偏光RPE単層を、ZO-1を発現するタイトな接合によって結合された2つの核を有する六角形の色素性RPE細胞によって形成された(図1C、2)。透過電子顕微鏡写真は、円錐状のマイクロビリと基底面の折り畳みの存在を明らかにする(図1C)。RPE単層の偏光は、平均200 Ω xcm2を超えるTER値により確認されたが、これは時間の経過とともに安定した状態を保った(...

このプロトコルは、2016年1年にフェルナンデス・ゴディーノらによって報告されたもので、トランスウェルプレート上で1週間以内に機能的で偏極したRPE単層を形成するマウスRPE細胞を効率的に単離および培養する方法を説明している。手続きには約3時間かかります。

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

このプロトコルは、マウスRPE細胞の効率的な分離と培養を可能にします。健常なプライマリマウスRPE培養は、基礎となる眼疾患のメカニズムを理解するための貴重なモデルです。コンフルエントで実行可能なRPE培養は3日以内に取得し、数週間成長させることができます。このプロトコルは、先進国の高齢者の失明の主な原因である早期加齢黄斑変性症のメカニズムを理解するためにうまく使用されています。解剖ステップを視覚化することが重要です。詳細は、プロトコルの成功には、例えば、眼球を扱って、クリンラがパンチしないようにする方法、正確にカットを行う場所、そして彼らが開いたままになるようにトリプシンにアイカップを埋め込む方法など、重要です。プロトコルに必要なすべての試薬を準備します。次に、強切に切り傷をかけずに、デュモン番号5鉗子と斜めハサミを使用して、すべての結合組織、血液、筋肉を慎重に除去することによって眼球の洗浄を開始します。眼球を3ミリリットルのHEPESフリーHBSSバッファーを含む新鮮な皿に定期的に移して、目を新鮮で清潔に保ち、汚染を避けます。眼球を保持し、鋭い炭素鋼番号11ブレードで角膜の中央に穴を開けるハンドルとして視神経を使用してください。デュモン番号5ハサミで穴を通して角膜に3つの切開を行い、レンズを取り外すのに十分なスペースがあることを確認します。視神経を保持し、レンズが完全に出てくるまで、斜めのはさみのベースで、オラ・コナラタにわずかな圧力を加えます。インキュベーション中に神経網膜とRPEの剥離を防ぐために、虹彩上皮をそのままにしておきます。ヒューペスを含まないHBSSバッファに目を入れます。5%の二酸化炭素気泡インキュベーターで37°Cのヒアルロニダーゼ溶液中のレンズなしで目をインキュベートし、RPEから神経網膜を取り外します。1.5ミリリットルの冷たいHBSS HEPESバッファーを備えた新しいウェルに各目を置き、氷の上で30分間インキュベートします。洗浄後、新鮮なHBSS HEPESバッファーを備えた35ミリメートルの培養皿に各目を入れます。オラ・コナラに達するまで8センチメートルのヴァンナスハサミで元の切開を通して角膜を切り、その後、虹彩上皮と角膜を取り除くために、オラ・セラタの下にカットします。湾曲したピンセットでオラ・コナラを保持し、角度付きマイクロ鉗子を使用して、神経性のretinaを引き離し、RPE層が切断されないようにします。その後、視神経への内部付着を切断する。視神経を切断し、各アイカップを1.5ミリリットルの新鮮なトリプシン-EDTAを含む別の12ウェルプレートに移します。アイカップが開いたままで、トリプシンに完全に沈んだままであることを確認してください。アイカップを摂氏37度で45分間5%の二酸化炭素インキュベーターでインキュベートします。トリプシンインキュベーション中に取り外されたRPEシートと一緒に各アイカップを収集し、ウェルあたり1.5ミリリットルのFBS溶液を含む12ウェルプレートに転送します。RPEシートがトリプシン溶液に残っている場合は、マイクロピペットを使用してFBS溶液でウェルに転送します。視神経で各アイカップを保持し、RPEシートの完全な剥離が達成されるまで、HBSS HEPESバッファー内の20%FBSの1.5ミリリットルを含む12ウェルプレートに下に振ります。培養物を汚染する可能性のある白い部分の白い部分の白い部分を避け、15ミリリットルのチューブに入れて、マイクロピペットを使用してRPEシートとRPEクラスタを収集します。1つのチューブで同じマウスから2つの目を引っ張ります。次いで、RPE混合物を室温で2分間340xgで遠心し、上清を捨てる。0.25%トリプシン-EDTAの1ミリリットルの混合物中にRPEペレットを穏やかに再懸濁し、37°Cの水浴で1分間インキュベートし、RPEシートを単一細胞に分解します。その後、気泡の形成を避け、10回上下にピペットを穏やかに。作りたてのRPE培地を9ミリリットル加えて、トリプシンを希釈し、室温で2分間340 x gで遠心分離機を薄め、不活性化します。上清を吸引し、5%FBSで150マイクロリットルのRPE培地で細胞ペレットを慎重に再懸濁します。次に、前に調製したラミニン被覆膜挿入物の底部チャンバーからPBSを取り出し、それに700マイクロリットルのRPE培地を加える。膜挿入物の上部チャンバーからラミニンを取り出し、RPE細胞の懸濁液をドロップワイズおよび均一にチャンバーの中央に分配する。膜挿入物を5%の二酸化炭素インキュベーターに37°Cで少なくとも24時間放置します。次に、顕微鏡下の膜挿入物を調べて、ほとんどのRPE細胞が挿入物に取り付けられ、合流率が少なくとも50%であることを確認してください。このプロトコルを用いて単離されたRPE細胞は、典型的なRPEサイズ、形態、および色素沈着を示した。2つの核を持つ高度偏光RPE単層は、尖体マイクロビリと基底折りたたみの存在と共に、1週間後に観察された。RPE単層の偏光はTER値で確認され、平均は200ωセンチメートルを超え、時間の経過とともに安定したままでした。FITC標識されたウシPOSに対して行われた貪食アッセイでは、POSの巻き込みおよび消化が観察され、RPE細胞の機能的コンフルエント単層の形成を示す。実行可能な文化は、経験を持つ短い解剖時間を必要とします。一部の RPE 細胞は神経の残りの retina に接続されたままであっても、いくつかの RPE シートがアタッチされたままの場合、プロトコルは成功しません。新鮮なヒアルロンジダーゼは、この問題を防ぐために毎回使用する必要があります。これらの機能性プライマリマウスRPE細胞培養は、多くの眼疾患におけるRPEの病態生物学を研究するための貴重なツールである。例えば、このプロトコルは、黄斑変性のマウスモデルにおけるRPEの病態生物学を研究することを可能にした。

efficient-dissection-culture-primary-mouse-retinal-pigment-epithelial

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

網膜色素上皮 (RPE) は目の多機能上皮です。ここでマウスの網膜色素上皮から派生した一次電池文化を確立するためのプロトコルを提案する.

マウス網膜色素上皮からの一次電池文化

プロトコルは、マウス 神経網膜のorganotypic型外植体を記述し、その網膜色素上皮(RPE)と共に栽培され、R16で、血清および抗生物質を含まない。この方法は、 インビボ...

無条件網膜色素上皮を用いた、オルガマウス網膜の長期無血清栽培

この原稿では、網膜色素上皮(RPE)細胞をマウスの目から段階的に単離するための簡略化されたプロトコルについて説明しています。このプロトコルには、マウスの目の除核と解剖、それに続くRPE細胞の単離、播種、培養が含まれます。...

初代マウス網膜色素上皮細胞の単離

ここでは、初代ブタ網膜色素上皮細胞を 試験管内で 培養するためのわかりやすい方法が提示されている。...

ブタ網膜色素上皮細胞の初代培養

この原稿では、マウスの眼から網膜グリアMüller細胞を単離するための詳細なプロトコルについて説明しています。プロトコールは、マウスの眼の除核と解剖から始まり、続いてMüller細胞の単離、播種、および培養が行われます。...

初代マウス網膜グリアミュラー細胞の単離

網膜色素上皮(RPE)は、脈絡膜と網膜との間の重要な障壁として機能し、光受容体などの網膜細胞タイプの健康と機能を促進します。ここでは、成体マウスRPEを単離および培養するための簡単で効果的なプロトコルについて説明します。...

成体マウスからの網膜色素上皮細胞の単離および培養のための簡易法

この記事では、新生児Sprague-Dawley(SD)ラットから初代Retinal...

Sprague-Dawley(SD)ラットからの初代Retinal Müller細胞の単離と培養

卵管（FT）は、漿液性卵巣癌（SOC）の原産地別のサイトとして浮上している。このプロトコルは、分離するための新しい方法を説明し、...

初代ヒト卵管上皮細胞のex vivoでの文化

本書では、マウスの膵臓からプライマリー膵臓腺房細胞を単離し、培養するための迅速かつ便利な手順を説明します。この方法では、新鮮な主要形質転換/ノーマル膵外分泌細胞の生理機能を研究するための貴重なアプローチを構成している。...

マウスプライマリ膵臓腺房細胞の単離と培養

マイクロRNA（miRNAを）人為-多能性幹（IPS）細胞（IPS-RPE）、および胎児RPE由来のヒト誘起多能性幹（IPS）細胞、網膜色素上皮（RPE）のプロファイルは、比較した。...

ヒトiPS細胞のマイクロRNA発現プロファイル、IPから派生網膜色素上皮、および胎児の網膜色素上皮

学ぶ一次マウス網膜色素上皮細胞の効率的解離と培養法。酵素処理とラミニンコートTranswellを用いて、3日で融合した高極性RPE単層を樹立し、加齢性黄斑変性などの眼疾患の病態研究と治療薬スクリーニングに活用できます。

一次マウス網膜色素上皮細胞の効率的解離と培養

さらに動画を探す