Name: ゼブラフィッシュで泳ぐ後側面線の発泡性ニューロンの活動 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: 学ぶパッチクランプ電気生理学を用いて、ゼブラフィッシュの後側面線有毛細胞から求心性ニューロンの活動をリアルタイムで記録する方法です。感覚ニューロンと運動ニューロンの同時記録により、人の聴覚障害に関わる回路機構を解明できます。

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国立衛生研究所(DC010809)、国立科学財団(IOS1257150、1856237)、ホイットニー海洋生物科学研究所からJ.C.Lへの支援を心から受け入れました。遼研究室の過去・現在のメンバーに対し、議論を刺激して頂き、感謝申し上げたいと思います。

<ol><li>Trapani, J. G., Nicolson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+spontaneous+activity+in+afferent+neurons+of+the+zebrafish+lateral-line+organ%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanism of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral-line organ.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (5), 1614-1623 (2011).</li>
<li>Haehnel-Taguchi, M., Akanyeti, O., Liao, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Afferent+and+motorneuron+activity+in+response+to+single+neuromast+stimulation+in+the+posterior+lateral+line+of+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Afferent and motorneuron activity in response to single neuromast stimulation in the posterior lateral line of larval zebrafish.</a> Journal of Neurophysiology. 112 (6), 1329-1339 (2014).</li>
<li>Levi, R., Akanyeti, O., Ballo, A., Liao, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+response+properties+of+primary+afferent+neurons+in+the+posterior+lateral+line+system+of+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Frequency response properties of primary afferent neurons in the posterior lateral line system of larval zebrafish.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (2), 657-668 (2015).</li>
<li>Harris, G. G., Fishkopf, L. S., Flock, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+potentials+from+hair+cells+of+the+lateral+line%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Receptor potentials from hair cells of the lateral line.</a> Science. 167 (3914), 76-79 (1970).</li>
<li>Dow, E., Jacobo, A., Hossain, S., Siletti, K., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connectomics+of+the+zebrafish%27s+lateral+line+neuromast+reveals+wiring+and+miswiring+in+a+simple+microcircuit%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Connectomics of the zebrafish's lateral line neuromast reveals wiring and miswiring in a simple microcircuit.</a> eLife. 7, 33988(2018).</li>
<li>Obholzer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+glutamate+transporter+3+is+required+for+synaptic+transmission+in+zebrafish+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Vesicular glutamate transporter 3 is required for synaptic transmission in zebrafish hair cells.</a> The Journal of Neuroscience. 28 (9), 2110-2118 (2008).</li>
<li>Keen, E. C., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+characteristics+of+the+hair+cell%27s+afferent+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transfer characteristics of the hair cell's afferent synapse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (14), 5537-5542 (2006).</li>
<li>Li, G., Keen, E., Andor-Ardó, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unitary+event+underlying+multiquantal+EPSCs+at+a+hair+cell%27s+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell's ribbon synapse.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).</li>
<li>Manley, G. A., Robertson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+spontaneous+activity+of+auditory+neurons+in+the+spiral+ganglion+of+the+guinea-pig+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of spontaneous activity of auditory neurons in the spiral ganglion of the guinea-pig cochlea.</a> The Journal of Physiology. 258 (2), 323-336 (1976).</li>
<li>Kiang, N. Y. S., Watanabe, T., Thomas, E., Clark, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKiang%2C+NYS+%22Discharge+patterns+of+single+fibers+in+the+cat%27s+auditory+nerve%22">Discharge patterns of single fibers in the cat's auditory nerve</a>. , MIT Press. Cambridge MA. (1965).</li>
<li>Corey, D. P., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+basis+of+the+receptor+potential+in+a+vertebrate+hair+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell.</a> Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).</li>
<li>Trapani, J. G., Nicolson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+recordings+from+zebrafish+lateral-line+hair+cells+and+afferent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Physiological recordings from zebrafish lateral-line hair cells and afferent neurons.</a> Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).</li>
<li>Reinig, S., Driever, W., Arrenberg, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+descending+diencephalic+dopamine+system+is+tuned+to+sensory+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The descending diencephalic dopamine system is tuned to sensory stimuli.</a> Current Biology. 27 (3), 318-333 (2017).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+silent+sensory+hair+cells+in+zebrafish+are+recruited+after+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage.</a> Nature Communications. 9 (1), 1388(2018).</li>
<li>Pichler, P., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+behavior+selectively+inhibits+hair+cells+activated+forward+motion+in+the+lateral+line+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Motor behavior selectively inhibits hair cells activated forward motion in the lateral line of zebrafish.</a> Current Biology. 30 (1), 150-157 (2020).</li>
<li>Olszewski, J., Haehnel, M., Taguchi, M., Liao, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+larvae+exhibit+rheotaxis+and+can+escape+a+continuous+suction+source+using+their+lateral+line%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Zebrafish larvae exhibit rheotaxis and can escape a continuous suction source using their lateral line.</a> PloS One. 7 (5), 36661(2012).</li>
<li>Suli, A., Watson, G. M., Rubel, E. W., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheotaxis+in+larval+zebrafish+is+mediated+by+lateral+line+mechanosensory+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rheotaxis in larval zebrafish is mediated by lateral line mechanosensory hair cells.</a> PLoS One. 7 (2), 29727(2012).</li>
<li>Oteiza, P., Odstcil, I., Lauder, G., Portugues, R., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mechanism+for+mechanosensory-based+rheotaxis+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel mechanism for mechanosensory-based rheotaxis in larval zebrafish.</a> Nature. 547 (7664), 445-448 (2017).</li>
<li>McHenry, M. J., Feitl, K. E., Strother, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Larval+zebrafish+rapidly+sense+the+water+flow+of+a+predator%27s+strike%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Letters%22%5BJournal%5D)">Larval zebrafish rapidly sense the water flow of a predator's strike.</a> Biology Letters. 5 (4), 477-479 (2009).</li>
<li>Stewart, W. J., Cardenas, G. S., McHenry, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+larvae+evade+predators+by+sensing+water+flow%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish larvae evade predators by sensing water flow.</a> The Journal of Experimental Biology. 216, Pt 3 388-398 (2013).</li>
<li>Mekdara, P. J., Schwalbe, M. A. B., Coughlin, L. L., Tytell, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+lateral+line+ablation+and+regeneration+in+schooling+giant+danios%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The effects of lateral line ablation and regeneration in schooling giant danios.</a> The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 8 175166(2018).</li>
<li>Palmer, L. M., Giuffrida, B. A., Mensinger, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+recordings+from+the+lateral+line+in+free-swimming+toadfish%2C+Opsanus+tau%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biological+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Neural recordings from the lateral line in free-swimming toadfish, Opsanus tau.</a> The Biological Bulletin. 205 (2), 216-218 (2003).</li>
<li>Ayali, A., Gelman, S., Tytell, E. D., Cohen, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+line+activity+during+undulatory+body+motions+suggests+a+feedback+link+in+closed-loop+control+of+sea+lamprey+swimming%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Zoology%22%5BJournal%5D)">Lateral line activity during undulatory body motions suggests a feedback link in closed-loop control of sea lamprey swimming.</a> Canadian Journal of Zoology. 87 (8), 671-683 (2009).</li>
<li>Mensinger, A. F., Van Wert, J. C., Rogers, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+line+sensitivity+in+free-swimming+toad+fish+Opsanus+tau%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Lateral line sensitivity in free-swimming toad fish Opsanus tau.</a> The Journal of Experimental Biology. 222, Pt 2 190587(2019).</li>
<li>Montgomery, J., Bodznick, D., Halstead, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hindbrain+signal+processing+in+the+lateral+line+system+of+the+dwarf+scorpionfish+Scopeana+papillosus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Hindbrain signal processing in the lateral line system of the dwarf scorpionfish Scopeana papillosus.</a> The Journal of Experimental Biology. 199, Pt 4 893-899 (1996).</li>
<li>Montgomery, J. C., Bodznick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adaptive+filter+that+cancels+self-induced+noise+in+the+electrosensory+and+lateral+line+mechanosensory+systems+of+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">An adaptive filter that cancels self-induced noise in the electrosensory and lateral line mechanosensory systems of fish.</a> Neuroscience Letters. 174 (2), 145-148 (1994).</li>
<li>Palmer, L. M., Deffenbaugh, M., Mensinger, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+the+anterior+lateral+line+to+natural+stimuli+in+the+oyster+toadfish%2C+Opsanus+tau+%28Linnaeus%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of the anterior lateral line to natural stimuli in the oyster toadfish, Opsanus tau (Linnaeus).</a> The Journal of Experimental Biology. 208, Pt 18 3441-3450 (2005).</li>
<li>Russell, I. J., Roberts, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+spontaneous+lateral-line+activity+of+efferent+nerve+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of spontaneous lateral-line activity of efferent nerve stimulation.</a> The Journal of Experimental Biology. 57, 77-82 (1972).</li>
<li>Lunsford, E. T., Skandalis, D. A., Liao, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efferent+modulation+of+spontaneous+lateral+line+activity+during+and+after+zebrafish+motor+commands%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Efferent modulation of spontaneous lateral line activity during and after zebrafish motor commands.</a> Journal of Neurophysiology. 122 (6), 2438-2448 (2019).</li>
<li>Russell, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pharmacology+of+efferent+synapses+in+the+lateral-line+system+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The pharmacology of efferent synapses in the lateral-line system of Xenopus laevis.</a> The Journal of Experimental Biology. 54 (3), 643-659 (1971).</li>
<li>Roberts, B. L., Russell, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+activity+of+lateral-line+efferent+neurons+in+stationary+and+swimming+dogfish%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The activity of lateral-line efferent neurons in stationary and swimming dogfish.</a> The Journal of Experimental Biology. 57 (2), 435-448 (1972).</li>
<li>Flock, A., Russell, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+post-synaptic+action+of+efferent+fibres+in+the+lateral+line+organ+of+the+burbot+Lota+lota%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The post-synaptic action of efferent fibres in the lateral line organ of the burbot Lota lota.</a> The Journal of Physiology. 235 (3), 591-605 (1973).</li>
<li>Montgomery, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+cancellation+in+the+electrosensory+system+of+the+thornback+ray%3B+common+mode+rejection+of+input+produced+by+the+animal%27s+own+ventilatory+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Noise cancellation in the electrosensory system of the thornback ray; common mode rejection of input produced by the animal's own ventilatory movement.</a> Journal of Comparative Physiology. 155, 103-111 (1984).</li>
<li>Tricas, T. C., Highstein, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+the+octavolateralis+efferent+system+upon+the+lateral+line+of+free-swimming+toadfish%2C+Opsanus+tau%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Action of the octavolateralis efferent system upon the lateral line of free-swimming toadfish, Opsanus tau.</a> Journal of Comparative Physiology. 169 (1), 25-37 (1991).</li>
<li>Weeg, M. S., Land, B. R., Bass, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vocal+pathways+modulate+efferent+neurons+to+the+inner+ear+and+lateral+line%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Vocal pathways modulate efferent neurons to the inner ear and lateral line.</a> The Journal of Neuroscience. 25 (25), 5967-5974 (2005).</li>
<li>Elgoyhen, A. B., Johnson, D. S., Boulter, J., Vetter, D. E., Heinemann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B19%3A+an+acetylcholine+receptor+with+novel+pharmacological+properties+expressed+in+rat+cochlear+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">α9: an acetylcholine receptor with novel pharmacological properties expressed in rat cochlear hair cells.</a> Cell. 79 (4), 705-715 (1994).</li>
<li>Masino, M. A., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fictive+swimming+motor+patterns+in+wild+type+and+mutant+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Fictive swimming motor patterns in wild type and mutant larval zebrafish.</a> Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3177-3188 (2005).</li>
<li>Hentschke, H. abfload. 1.4.0.0. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHentschke%2C+H+%22MATLAB+Central+File+Exchange%22">MATLAB Central File Exchange</a>. , (2020).</li>
<li>Harris, G. G., Milne, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Input-output+characteristics+of+the+lateral-line+sense+organs+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+Acoustical+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Input-output characteristics of the lateral-line sense organs of Xenopus laevis.</a> The Journal of the Acoustical Society of America. 40 (1), 32-42 (1966).</li>
<li>Liao, J. C., Haehnel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+afferent+neurons+in+larval+zebrafish+provides+a+functional+framework+for+lateral+line+somatotopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy.</a> Journal of Neurophysiology. 107 (10), 2615-2623 (2012).</li>
<li>Song, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mathematical+modeling+and+analyses+of+interspike-intervals+of+spontaneous+activity+in+afferent+neurons+of+the+zebrafish+lateral+line%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Mathematical modeling and analyses of interspike-intervals of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral line.</a> Nature Science Reports. 8, 14851(2018).</li>
<li>Liao, J. C., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+versus+specialized+glycinergic+spinal+interneurons+in+axial+motor+circuits+of+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Shared versus specialized glycinergic spinal interneurons in axial motor circuits of larval zebrafish.</a> The Journal of Neuroscience. 28 (48), 12982-12992 (2008).</li>
<li>von Holst, E., Mittelstaedt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+principle+of+reafference%3A+interactions+between+the+central+nervous+system+and+the+peripheral+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Die+Naturwissenschften%22%5BJournal%5D)">The principle of reafference: interactions between the central nervous system and the peripheral organs.</a> Die Naturwissenschften. 37, 463(1950).</li>
<li>Crapse, T. B., Sommer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corollary+discharge+across+the+animal+kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Corollary discharge across the animal kingdom.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 9 (8), 587-600 (2008).</li>
<li>Brichta, A. M., Goldberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+to+efferent+activation+and+excitatory+response-intensity+relations+of+turtle+posterior-crista+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Responses to efferent activation and excitatory response-intensity relations of turtle posterior-crista afferents.</a> Journal of Neurophysiology. 83 (3), 1224-1242 (2000).</li>
</ol>

著者らは、競合する財政的利益を宣言しない。

説明された実験プロトコルは、脊椎動物を無傷で動作させる運動行動全体の感覚入力の内因性変化を監視する可能性を提供する。具体的には、幼虫ゼブラフィッシュにおける側線の無気泡性ニューロンと腹側運動根の同時細胞外記録を行うためのインビボアプローチを詳述する。自発的な発泡活動は、潜在的な同時運動活動1、2、39、40、41を考慮せずにゼブラフィッシュで以前に特徴付けられてきた。腹側ルート記録で運動活動の存在を監視することなく、自発的な水泳中、さらには後のエフェレント阻害の影響により、発泡活動を解読することは過小評価される可能性が高い。
生体内電気生理学的記録は本質的に困難です。私たちの経験では、健康的な準備を維持することは、発送性ニューロンと腹側運動根の成功した、長期的...

メカノ感覚系の無透過ニューロンは、聴覚とバランスの間に毛細胞から脳に情報を伝達する。電気生理学は、直接録音を通じて、刺激性ニューロンの感受性を明らかにすることができる。毛髪細胞からの全細胞のパッチ適用は困難な場合がありますが、下流の不毛なニューロンからの記録は容易であり、制御された刺激1、2、3に応答して行動電位の評価を可能にする。毛細胞を刺激すると、そのたわみ、メカノ感覚構造を変更し、したがって、刺激性ニューロン4、5、6における作用電位(スパイク)の増加を引き起こす。外部刺激がない場合、無気泡性ニューロンはまた、毛細胞から無フェ性シナプス後末端7、8へのグルタミン酸漏れにより自発的にスパイクし、感度9,10の維持に寄与することが示されている。アフェレント活性のパッチクランプ記録は、マイクロフォニックス11、12、または機能的なカルシウムイメージング13、14、15など、より低い時間分解能を有する技術を用いて不可能なヘアセル感受性およびシグナルダイナミクスの観察を可能にする。次のプロトコルは、ヘアセル感度の瞬間的な変化を明らかにするために、モータコマンドと同時に、afferentアクティビティの記録を可能にします。
ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、体に対する水の動きを検出するために横線系を構成する神経マストに含まれる毛髪細胞を使用し、ナビゲーション16、17、18、捕食者回避、獲物捕獲19、20、および学校教育21に不可欠な神経信号に翻訳される。水の流れは、水泳22、23、24、呼吸22、25、26、および給餌27の動きによっても自己発生することができる。これらの行動は、毛髪細胞を疲労させ、センシングを損なう繰り返しの動きを含む。したがって、横線系は、外部(エクサフェレント)と自己生成(reafferent)流動刺激を区別することが重要です。副分泌はゼブラフィッシュの移動中に自己生成流動信号を減衰させる。この抑制性予測運動信号は、センサ受容体に降下ニューロンを介して中継され、入力を変更するか、または再送フィードバック28,29の処理を中断する。このフィードフォワードシステムの早期理解に寄与する精細な研究は、神経回路の接続性および内因性活性が維持されなかったインビトロ調製に依存していた28、30、31、32、33、34、35。このプロトコルは、内因性フィードバックダイナミクスが維持され、生体内のカロリー放電をよりよく理解できる無傷の神経回路を維持するアプローチを記述する。
ここで概説するプロトコルは、幼虫ゼブラフィッシュにおける後方線の受熱性ニューロンおよび運動ニューロン活性を同時に監視する方法を説明する。運動コマンドの前後にフェレントシグナルダイナミクスを特徴付けるので、移動中の毛細胞の感度を調節する中枢神経系からのリアルタイムの内因性フィードバックに関する洞察を得られます。このプロトコルは、実験の前にどのような材料を準備する必要があるかを概説し、ゼブラフィッシュの幼虫を麻痺させ、準備する方法を説明します。プロトコルは、運動ニューロンの不フェレントニューロンおよび細胞外腹側根(VR)記録の安定した緩いパッチ記録を確立する方法を説明する。このプロトコルを用いて得ることができる代表的なデータは、例示的な個体から提示され、実験プロトコルの複数の複製に対して分析を行った。データの前処理は、MATLABでカスタムのスクリプトを使用して実行されます。全体として、このin vivo実験パラダイムは、モデル脊椎動物の毛細胞系における移動中の感覚フィードバックをよりよく理解する準備ができている。

<table><tbody><tr><td>100mLビーカー</td><td>PYREX</td><td>1000</td><td>エッチャント用レセプタクル</td></tr><tr><td>10倍水浸対物レンズ</td><td>オリンパス</td><td>UMPLFLN10xW</td><td>幼虫の位置決めと記録電極のための低倍率</td></tr><tr><td>オ</td><td>リンパス</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td>位置電極チップの高倍率とパッチクランプ</td></tr><tr><td>abfload.m</td><td></td><td>補足コーディングファイル</td><td>生の電気生理学記録を.matファイルに変換するためのカスタム記述されたMATLABスクリプト</td></tr><tr><td>AffVR_preprocess.m</td><td></td><td>補足コーディングファイル</td><td>記録データの前処理のためのカスタム記述されたMATLABスクリプト</td></tr><tr><td>BNC同軸ケーブル</td><td>ThorLabs</td><td>2249-C-12</td><td>増幅器とデジタイザーチャネルの接続;</td></tr> 4つの<tr><td>ホウケイ酸ガラスキャピラリーとフィラメント</td><td>ワーナーが必要機器</td><td>G150F-3</td><td>内径:0.86、外径:1.50; 記録電極を形成するために使用される毛細管ガラス</td></tr><tr><td>burst_detect 補足コーディングファイル</td><td>AffVR_preprocess.m</td><td></td>コンピュータ<td>を実行するために必要なカスタムライティングMATLAB機能</td></tr><tr><td></td><td>N/A</td><td>N/</td><td>A 任意のコンピュータは、</td></tr><tr><td>電気エッチング解剖ピンに使用される</td><td>DC電源</td><td>Tenma</td><td>72-420</td>で動作する必要があります</tr><tr><td>電気生理学デジタイザー</td><td>Axon Instruments, Molecular Devices</td><td>Axon DigiData 1440A</td><td>は、パッチクランプデータ</td></tr><tr><td>フィラメント</td>の取得を可能にします <td>Sutter Instrument Company</td><td>FB255B</td><td>マイクロピペットプーラーファイン鉗子に使用される2.5mmボックスフィラメント</td></tr><tr><td></td><td>ファインサイエンスツール</td><td>デュモン#5(0.05×0.02mm) 商品番号11295-10</td> 幼<td>虫の操作とピン挿入</td></tr>の<tr><td>固定ステージDICに使用顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>BX51WI</td>顕微鏡は、<td>パッチクランプ記録を視覚化し、確立するために使用される</td></tr><tr><td>柔軟な、テーパーピペットチップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-707-169</td><td>柔軟なチップは、先端で細胞外溶液を分注するための記録電極への挿入を可能にします</td></tr><tr><td>FluoroDish</td><td>World Precision Instruments Inc.</td><td>FD3510-100</td><td>カバーガラス底皿記録皿</td></tr><tr><td>KimWipe KimTech</td><td></td><td>34155</td>タスク<td>ワイプは、幼虫から余分な液体を吸い上げるために使用されます</td></tr><tr><td>Kwik-Gard</td><td>World Precision Instruments Inc.</td><td>710172</td><td>セルフミキシングシルガードエラストマー</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>R2020b</td><td>データ前処理用コマンドラインソフトウェア</td></tr><tr><td>微小電極増幅器</td><td>Axon Instruments, Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td>デュアルチャネル記録用パッチクランプ増幅器</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>成重</td><td>MF-830 microforge</td><td>記録電極</td></tr><tr><td>マイクロマニピュレータを研磨制御ユニット</td><td>Siskiyou</td><td>MC1000-eR/T</td><td>マイクロマニピュレーターを制御するための4軸ダイヤルコーディネーター</td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Flaming/Brown P-97</td> キャ<td>ピラリーガラスを記録電極に引き込むための</td></tr>顕微鏡<tr><td>制御ユニット</td><td>Siskiyou</td><td>MC1000e</td><td>は、顕微鏡を固定ステージと準備</td></tr>電動<tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>の周りに配置しますSiskiyou</td><td>MX7600</td>は、<td></td></tr><tr><td>Axon MultiClamp 700Bコマンダーダウンロードページからダウンロード可能な</td>パッチクランプ記録<td>MultiClamp Commander</td><td>Molecular Devices</td><td>2.2.2をダウンロード</td>可能な</tr>ヘッドステージと付属の記録電極を配置します <tr><td>光学エアテーブル</td><td>ニューポートコーポレーション</td><td>VH3036W-OPT</td><td>ブレッドボードアイソレーションテーブル 顕微鏡を浮かべ、記録中の振動を最小限に抑えます</td></tr><tr><td>pCLAMP</td><td>Molecular Devices</td><td>10.7.0</td><td>は Axon pCLAMP 10 からダウンロード可能 Electrophysiology Data Acquisition &分析ソフトウェア ダウンロードページ</td></tr><tr><td>パーマネントインクマーカー</td><td></td><td>VR電極の前縁側をマーキングするための</td><td>amazon.com からの</td>注文</tr> ペトリディッシュに挿入する際に適切な向きを確保するための <tr><td>ペトリディッシュ</td><td>ファルコン</td><td>35-3001</td><td>麻痺性ピペットホルダーに幼虫を浸すために使用される</td></tr><tr><td></td><td>分子デバイス</td><td>1-HL-U</td><td>記録電極を保持し、ヘッドステージに接続します</td></tr><tr><td>空気圧トランスデューサ</td>ー <td>Fluke Biomedical Instruments</td><td>DPM1B</td><td>記録電極を制御するため 内圧</td></tr><tr><td>水酸化カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473-25G</td><td>エッチング用 解剖ピン</td></tr><tr><td>シリコンチューブ</td><td>Tygon</td><td>14-169-1A</td><td>空気圧トランスデューサーをピペットホルダーに接続するための</td></tr>チューブ <tr><td>spike_detect</td><td></td><td>補足コーディングファイル</td><td>AffVR_preprocess.m</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td>を実行するために必要なカスタム記述されたMATLAB関数は<td>、ピンの先端を視覚化し、幼虫の</td></tr><tr><td>ストレートエッジかみそりブレード</td>の準備中に<td>、amazon.com からのCanopus</td><td>の注文</td>は、補足コーディングファイル<td></td></tr><tr><td></td><td></td>swimbout_detect<td></td>解剖ピンを作成しながらタングステンワイヤーを<td>切断しますAffVR_preprocess.mシリンジを実行するために必要なカスタムメイドのMATLAB関数</td></tr><tr><td></td><td>Becton Dickinson Compoany</td><td>309602</td>、<td>記録電極に注入するための細胞外溶液で満たされ</td></tr>ています <tr><td>転送ピペット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z135003-500EA</td><td>使い捨て、幼虫を転送するための非滅菌ピペット</td></tr><tr>トリ<td>カインメタンスルホン酸</td><td>Syndel</td><td>12854</td><td>高用量で幼虫を安楽死させるために使用される医薬品麻酔薬。</td></tr><tr><td>タングステンワイヤー</td><td>ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ(株)</td><td>715500</td><td>0.002インチ、50.8 &mu;m直径;解剖ピンを作るために使用</td></tr><tr><td>真空ろ過ユニット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCGVU11RE</td><td>電気生理学用電極リンガー電圧クランプ電流クランプヘッドステージに使用される細胞外溶液を滅菌するために使用される単回使用、滅菌、真空ろ過ユニット</td></tr><tr><td></td><td>Molecular Devices</td><td>CV-7B</td><td>には、左右のヘッドステージとして使用されるMultiClamp 700Bアンプが付属しています</td></tr><tr><td>&alpha;-bungarotoxin</td><td>ThermoFisher</td><td>B1601</td><td>(記録前に幼虫を固定化するため</td></tr></tbody></table>)

ゼブラフィッシュで泳ぐ後側面線の発泡性ニューロンの活動

Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish

感覚システムは、行動を演出するために不可欠な手がかりを収集しますが、動物は生物学的に関連する情報を解読する必要があります。ロコモーションは、動物が周囲の環境の関連する感覚的手がかりから離れなければならないことの深い手がかりを生成します。例えば、魚が泳ぐと、体のうねりから発生した流れは、毛細胞を含むメカノ受容性ニューロマストによって検出され、横線系を構成する。その後、毛髪細胞は感覚的な感覚的なニューロンを介してセンサーから脳に流体運動情報を送信します。同時に、モータ指令のカロリー放電は、感覚過負荷を防ぐためにヘアセルに中継される。移動中の予測運動信号の抑制効果を考慮すると、横線系の感度を評価する際に重要である。我々は、数時間続くことができるゼブラフィッシュ幼虫(受精後4〜7日)における後側索神経および腹側運動根活性を同時に監視するin vivo電気生理学的アプローチを開発した。単一または複数のニューロンからの活性を検出することができる緩いパッチクランプ技術を使用して、細胞外のニューロンの記録が達成される。腹側根の記録は運動ニューロン活動を検出するためにガラス電極で皮膚を通して行われる。当社の実験プロトコルは、脊椎動物を無傷で動作させるモータ挙動全体の感覚入力の内因性または誘発変化を監視する可能性を提供します。

ゼブラフィッシュの幼虫が適切に固定化され、後方線の斜線が気になるガングリオンとVR記録が達成された後、同時に、アフェレントと運動ニューロンの両方で活性を測定することができます。記録チャンネルは、ギャップのない記録プロトコル(ステップ1.4)を使用して表示され、afferentおよびVRアクティビティを継続的に監視します。リアルタイムでは、自発的な無フェレントスパイク率の低下は、架空の泳ぎの発作を示すVR活動と同時に観察することができる(図1E)。最良の結果と正確なスパイク検出は、少なくとも0.5の信号対雑音比を達成した記録の製品であることがわかりました。カスタムの作成前処理スクリプトは、afferent および VR スパイク検出の視覚化を支援するプロットを生成します。自発的なスパイクは、しきい値、最小時間(0.01 ms)、最小スパイク間隔(ISI; 1 ミリ秒)などのスパイク パラメータの組み合わせを使用して識別されます。記録を確立しながら負圧を増加させることは、多くの場合、一度に複数の異なるユニットからの信号検出をもたらす。振幅によるフィルタリングは、独立したアフェレント...

我々は、モデル脊椎動物の毛細胞系における運動コマンド中の、無毛ニューロン活動の変化をモニターするプロトコルを記述する。

Sensory systems gather cues essential for directing behavior, but animals must decipher what information is biologically relevant. Locomotion generates ...

このプロトコルは、研究者が無傷の振る舞い椎骨の制御された刺激に対する単一の感覚ニューロンの活性および応答を監視することを可能にする。このパッチ電気生理学は、リアルタイムで個々のニューロンのスパイク活動から記録するための迅速かつ直接的な方法です。また、ほとんどの光学イメージング技術よりも低コストで、より優れた時間分解能と感度を提供します。横線の毛細胞は、人間の内耳のものと相同である。したがって、この技術は、人間の難聴や聴覚障害に適用される毛細胞回路の特性を明らかにする準備ができています。電気生理学は、見て、物理的に模倣する必要がある細かい運動能力を使用した工芸品です。テキストのみの指示は、誤解のためのあまりにも多くの余地を残します。まず、シルガードのような自己混合シリコーンエラストマーの薄い層をカバーガラス底の組織培養皿に分配し、シリコーンエラストマーボトムレコーディングディッシュを作ります。解剖ピンを作るために、DC電源を使用してエッチャントの100ミリリットルビーカーに5ボルトの負の電荷を提供し、正に帯電した出力にタングステンワイヤーを取り付けます。先端が鋭いポイントに狭くなるまで、ワイヤーの先端を繰り返しエッチャント浴に浸します。ステレオ顕微鏡の下で、ワイヤーを先端から約1ミリメートル切断し、ストレートエッジカミソリブレードで切断します。これを3回繰り返し、細かい鉗子を使用して硬化した録音皿にピンを挿入します。記録電極を準備するには、ボックスフィラメント付きマイクロピペットプーラーを使用してホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブを引っ張ります。電極は後部横線からの無気泡のニューロンを記録するために使用されるテーパーが付いている直径30マイクロメートルの先端を有するべきである。追加のホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブを、小さな1~5マイクロメートルの先端径の電極に引き込みます。各手に1つの電極を持ち、チップをそっと互いに横切って動かして先端を壊します。マイクロフォージを使用して、ベベジチップを滑らかになるまで磨きます。最終的な先端の直径は30から50マイクロメートルの間であるべきである。ゼブラフィッシュの幼虫を固定化し、ピペットを移すために大きな先端を使用して35ミリメートルのシャーレに移します。周囲のソリューションをできるだけ多く取り外します。幼虫を10マイクロリットルの0.1%α-ブンガロトキシンに約5分間浸す。麻痺した幼虫を細胞外液で10分間洗います。次いで、トランスファーピペットを使用して、幼虫を細胞外溶液浴からシリコーン底付き記録皿に移動させる。ステレオ顕微鏡の下で、このシリコーンマットの中央の上に細かい先端の鉗子で幼虫をそっと配置し、体の前部と後部端が左から右に走る横側を上に置きます。細かい先端鉗子を使用して、肛門に直接後ろ向きの幼虫の脊索を通してシリコーンに直交するエッジピンを挿入する。尾の端近くの脊索を通して2番目のピンを挿入し、ガス膀胱の脊索後回を通して3番目のピンを挿入します。4つ目のピンを大蓋小胞に挿入し、ピンがカプセル化剤に挿入する際にわずかな回転を提供します。わずかな回転が適用されると、クリースラムとオティック小胞の間の組織を監視して、発泡性ソマタのクラスターを明らかにする。DIC顕微鏡の固定ステージ上の目的の10倍の下にピン幼虫を置き、左ヘッドステージベクターに平行な筋肉ブロックのミオセプタル裂け目を向けます。地上線を浴室の溶液に入れ、それが左のヘッドステージに接続されていることを確認します。柔軟なゲルローディングピペットチップを使用してVR記録電極に30マイクロリットルの細胞外溶液を充填し、左ヘッドステージピペットホルダーに挿入します。空気圧トランスデューサで得られる正圧を加えながら、倍率を40倍にし、記録ピペットを皿溶液に下げます。2つのミオメア腹孔の間のミオセプチムの上に電極先端を持ってきて、裂け目がVR電極先端の開口部の中心になるまでピペットを下に下げて上皮にそっと接触させます。最初の接触の後、ピペットを斜めに操縦して、先端が接触し、シールを生成できることを確認します。空気圧トランスデューサで負圧を加え、保持します。パッチクランプソフトウェアで、ツールバーの再生ボタンをクリックしてVR信号を監視します。Wellsステレオタイプのバースト信号ダイナミクスを使用して運動ニューロンの活動が観察されたら、VR記録が達成されていることを確認します。30マイクロリットルの細胞外溶液でアフェレンス記録電極を充填し、右ヘッドステージピペットホルダーに挿入します。次に、空気圧トランスデューサーによって生成される陽圧を加えながら、皿溶液にそれを下げます。電極を見つけて、電極先端を試料の上に持って来なさい。マイクロマニピュレーターを使用して、クリースラムの上の位置を保持するまで、アフェレント電極先端を下げます。倍率を40倍の浸漬に増やし、後側線神経とクレイスラムの交点を見つけます。電極先端をアフェレントガングリオンの上に持ち込み、先端が上皮に接触するまでピペットを下げます。先端全体が帯の神経節に接触するように電極を穏やかに操縦する。空気圧トランスデューサで負圧を加え、保持します。パッチクランプソフトウェアで再生をクリックした後、スパイクがおよそ100〜200ミリ秒ごとに自発的に発生したときに、細胞全体の緩いパッチ記録が達成されることを確認してください。一度、発泡ニューロンと運動ニューロンの活動が検出されたら、ピーククランプ10のツールバーのRecordボタンをクリックして、両方のチャンネルで同時にギャップフリーの録音をキャプチャします。テキスト原稿に記載されているデータの前処理を行います。このギャップフリー記録プロトコルを使用して、afferentとVRニューロンのリアルタイム活動を同時に測定することができます。カスタム作成前処理スクリプトは、しきい値、最小期間、最小インタースパイク間隔などのパラメータを使用してスパイク検出の視覚化を支援するプロットを生成します。分離信号は、前処理スクリプトで下限検出変数と上限検出変数を調整することによって得られた。腹側根スパイク検出は、追加の入力を伴う同一のパラメータに従います。モーターコマンド内のバーストは、少なくとも5ミリ秒持続する0.1ミリ秒以内の最低2つのスパイクで定義され、200ミリ秒未満のインターバースト間隔を持つ最低3つのバーストによって線分化されます。この場合、平均自発活動は、時間がゼロに等しいとしてX軸に描かれた運動活動の発症に対する劇的な変化を示す。水泳前のスパイク率と水泳前と泳泳後期間の両方のスパイクレートの間の発泡スパイク率に有意な違いが検出されました。無フェレントスパイク率は泳ぐ期間と負の相関があった。相対的なスパイクレートと泳ぎの頻度の間には相関関係は検出されません。動物の健康は、この手順を試みるとき最も重要なものです。動物の福祉を確保するだけでなく、神経記録の成功の可能性を高めるために、速い血流を監視することが重要です。ゼブラフィッシュで利用可能な遺伝的ツールを活用することにより、この電気生理学プロトコルは、強力に強力にヘアセルシステムおよびそれ以降の解剖学的および機能的回路接続性を調査するためにトランスジェニックラインによって補完することができます。このパッチクランプ技術の簡単な変更により、生体内での感覚システムの機能を監視することができます。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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ゼブラフィッシュ<em&gt;その場での</em&gt;脊髄脊髄感覚運動ニューロンからの電気生理学的記録のための準備

ゼブラフィッシュは、光学的透明度、急速な外部の開発を含む多くの貴重な機能を持ち、聴力と平衡感覚のフィールドに、特定の重要な感覚の有毛細胞に位置する外部モデル システムです。この資料について説明どのようにトランスジェニックゼブラフィッシュ...

ゼブラフィッシュ稚魚における側線有毛細胞の生体内カルシウム イメージング

レーザーアブレーションは、生物系の再生を研究するための広く応用できる技術です。提示されたプロトコルは、ゼブラフィッシュ横線で神経間細胞を再生するレーザーアブレーションとその後のタイムラプスイメージングのための標準的なレーザー走査共焦点顕微鏡の使用を記述する。...

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ゼブラフィッシュ成魚の行動性における前脳活動の2光子カルシウムイメージング

ゼブラフィッシュの幼生の神経筋接合部は、シナプス生理学を研究するための魅力的なモデルです。電気生理学や光学イメージングなど、多くの実験技術に適しています。ここでは、直立した落射蛍光顕微鏡下でpHluorinベースのプローブを使用してシナプス伝達をイメージングするためのプロトコルについて説明します。...

解剖された幼生ゼブラフィッシュの神経筋接合部におけるシナプス小胞のリサイクルのライブイメージング

学ぶパッチクランプ電気生理学を用いて、ゼブラフィッシュの後側面線有毛細胞から求心性ニューロンの活動をリアルタイムで記録する方法です。感覚ニューロンと運動ニューロンの同時記録により、人の聴覚障害に関わる回路機構を解明できます。

ゼブラフィッシュで泳ぐ後側面線の発泡性ニューロンの活動

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