Name: 細胞および薬物送達用途のための注射可能な高分子ポリマーナノ粒子ヒドロゲル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 学ぶ高分子ポリマーナノ粒子ヒドロゲルの調製法。ナノ沈殿法でナノ粒子を合成し、シアノジメタクリル酸メチルセルロースと混合して注射可能なゲルを作製します。シアリングシンと自己修復性を持ち、薬物送達や細胞封入に応用可能です。

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この研究は、ビル&メリンダ・ゲイツ財団(OPP1113682)とビル&メリンダ・ゲイツ財団(OPP1211043)と人間システム免疫学センターによって財政的に支援されました。C.M.Mは、スタンフォード大学大学院フェローシップとスタンフォードバイオXウィリアムとリンダ・スティーア・フェローシップによってサポートされました。A.K.G.は、国立科学財団大学院研究フェローシップとスタンフォード大学理工学大学院フェローシップのガビランフェローシップに感謝しています。S.Cは、国立衛生研究所の国立がん研究所の支援を受け、F32CA247352賞を受賞しました。著者らはまた、ギリー・ロス博士、アンソニー・ユー博士、リンゼイ・ステープルトン博士、ヘクター・ロペス・ヘルナンデス博士、アンドレア・ダキーノ博士、ジュリー・バイレット博士、セリーヌ・ライオン、ベン・オウ、エミリー・ミーニー、エミリー・ゲイル、アントン・スミス博士を含むアッペル・ラボのメンバーが長年にわたってこれらのプロトコルを開発するのを助ける努力と時間を温かく認めたいと考えています。

これらの著者は開示するものは何もありません。

ポリマーナノ粒子(PNP)ヒドロゲルは、容易に製造され、直接注射またはカテーテル送達を介して低侵襲投与を通じて治療細胞および薬物の長期局所送達を可能にする。これらのプロトコルは、PNPヒドロゲルの処方と、得られた材料の品質を保証するための特性評価方法を記述する。上分子PNPヒドロゲルは製造にスケーラブルであり、改変セルロースポリマーとポリマーコアシェルナノ粒子の簡単な混合によって形成されます。本手法は、簡単な肘混合プロトコルを介して注射器にあらかじめロードされたゲルを形成する簡単な手順を説明する。NPサイズと分布を監視するDLSなどの各コンポーネント部品の品質管理メトリックを通じて、一貫したレオロジー特性を持つPNPヒドロゲル材料を再現的に作り出すことができます。HPMC-C12またはNPの量を変化させることによって、1つは得られるPNPヒドロゲルのメッシュサイズおよび剛性を調節することができる。これらの特性は、特定の生物医学的用途に最も適するように調整することができ、ここで詳述されているレオロジー的方法を使用すると、研究者はPNPヒドロゲルのせん断薄化および自己治癒特性を特徴付けることができ、特定の用途に合わせてプラットフォームを最適化することができます。in vitro リリース研究の方法も説明されています。研究者は、これらの研究を使用して、関心のある薬物の放出の相対的なタイムスケールを特徴付けることができ、将来のインビボ研究に知らせる。安定性試験を用いて、研究者は、これらの材料の能力を評価して、時間と極端な温度の経過とともに敏感なバイオ医薬品の生物学的構造と安定性を維持するのに役立ち、バイオ医薬品のコールドチェーン依存性を低下させる魅力的な潜在的な用途を有する。最後に、簡単な細胞生存アッセイを用いて、PNP材料内の細胞増殖および移動を評価することができ、細胞療法および足場における潜在的な用途を有する。
私たちのグループは、PNPハイドロゲルプラットフォーム27のための多くの魅力的なアプリケーションを発見しました.PNPヒドロゲルは、サブユニットワクチンの遅い送達のために使用されており、抗原およびアジュバントの一致した運動放出プロファイルを可能にして、体液性免疫応答31の大きさ、持続時間、および品質を高める。PNPヒドロゲルは、最も一般的に使用されるヒドロゲルよりもメッシュサイズが小さいことが判明しているので、拡散を遅くし、ゆっくりと分子貨物を放出するのに効果的です。PNPヒドロゲルの独特な組織付着特性および機械的特性は、手術後の臓器の大きな表面積にヒドロゲルを噴霧することによって手術から生じる癒着を防ぐために物理的障壁を形成するために利用されている30。PNPヒドロゲルは、効果的な細胞送達車であることが示されており、また、機械的特性は、実際に注射中に注射針に生じる機械的力から細胞を遮蔽し、細胞生存率29を向上させる。NPが細胞接着ペプチドと共役する場合、細胞はPNPマトリックスを結合して係合して生存可能なままにすることができます。この手法を用いて、PNPヒドロゲルは、液体車28を用いた方法と比較して、注入幹細胞の局所保持を改善することが示されている。さらに、PNPヒドロゲルは、カプセル化されたインスリンの熱誘起凝集を防止することが示されており、過酷なストレスエージング条件下でも、これらの材料が温度感受性薬物38を冷蔵する必要性を低減することができる可能性があることを示唆している。
全体として、ここで説明する方法論は、研究グループが生体材料としてPNPヒドロゲルを製造し、探求することを可能にする。これらのプロトコルは、インビトロおよびインビボ研究の両方を追求するのに十分なヒドロゲル材料を製造するためのラボスケール合成技術を提供します。上記の研究は、これらの材料の動的架橋が、分子貨物の受動的拡散を制限しながら、生体内細胞の活動的な運動性を可能にすることにより、生物医学的用途の範囲に適していることを示している。研究者は、PNPプラットフォームが制御された薬物送達を通じて臨床結果を改善し、細胞の採用やメカノバイオロジーなどの基本的な生物学的メカニズムを研究するためのアクセス可能で強力なツールを見つけることが期待されています。

注射用ヒドロゲルは、制御された方法で体に治療細胞や薬物を送達するための新たなツールです 1.これらの材料は、薬物または細胞を装填することができ、表面組織への直接注射または深部組織へのカテーテル送達によって、低侵襲的な方法で投与することができる。一般に、注入可能なヒドロゲルは、一過性の物理的相互作用によって架橋される水増増ポリマーネットワークで構成されています。安静時には、これらの架橋はゲルに固体状の構造を提供するが、十分な機械的な力を印加するとこれらの架橋が一時的に破壊され、物質を液体状に変えて、容易に流れ易い2。物理的なヒドロゲルが薄く、注射中に小さな針径を流れるようにするこれらのレオロジー特性です 3.注射後、材料改質のポリマーネットワークは、自己治癒し、かつ迅速に自傷的に形成することを可能にする4、5。これらの構造は、組織再生6,7のための薬物または足場のための徐放デポとして機能することができる。これらの材料は、薬物送達技術、再生医療、および免疫工学1、8、9、10、11、12を含む多様な用途で使用されてきた。
天然素材(例えば、アルギン酸およびコラーゲン)および合成材料(例えば、ポリ(エチレングリコール)(PEG)または類似の親水性ポリマー)の両方が生体適合性の注入性ヒドロゲル材料13、14、15として開発されている。多くの天然材料は、再現性4、16に影響を与えるバッチ間の変動を示す。これらの材料は、多くの場合、温度に敏感です, 生理学的温度に達すると硬化;したがって、これらの材料を取り扱う追加の技術的および物流上の課題17.合成材料は、より精密な化学的制御と優れた再現性を可能にするが、これらの材料は、生体適合性を制限する有害な免疫応答を受ける場合があり、生体内治療用途6、18、19に対する重要な特徴である。最近の取り組みでは、機械的特性の最適化、ポリマーネットワークメッシュサイズ、生理活性分子キュー、生分解性、および材料20、21、22、23、24、25、26の免疫原性の最適化を含む、注入可能なヒドロゲル材料のエンジニアリングに関わる多くの複雑な設計基準が示されている。これらの要因はすべて、対象の用途に応じて考慮する必要があり、モジュール式で化学的に調整可能なプラットフォームは、幅広いアプリケーションを満足させるのに理想的です。
本方法は、調整可能な機械的特性、高い生体適合性および低免疫原性を示す注入可能なポリマーナノ粒子(PNP)ヒドロゲルプラットフォームの使用との製剤及び使用を記載し、生理活性分子手掛かり27、28、29、30、31、32、33を結合するための部位を提示する。これらのPNPヒドロゲルは、疎水性修飾セルロースポリマーとポリ(エチレングリコール)-ブロック-ポリ(PEG-PLA)27、34を含む自己組み立て型コアシェルナノ粒子で構成され、この相互作用を有する、過剰分子ネットワークを生成する。より具体的には、ドデシル修飾ヒドロキシプロピルメチルセルロースポリマー(HPMC-C12)は、PEG-PLAナノ粒子の表面とこれらのナノ粒子間の架橋とを動的に相互作用し、このポリマーネットワーク27,34を形成する。これらの動的な多価相互作用により、材料は注入中に薄くせん断し、投与後に急速に自己治癒する。このPNPヒドロゲル成分は、簡単なワンポット反応を経て容易に製造され、PNPヒドロゲルは、2つの成分35を簡単に混合することによって穏やかな条件下で形成される。製造の容易さのために、このヒドロゲルのプラットホームはスケールで非常に翻訳可能である。PNPヒドロゲルの機械的特性およびメッシュサイズは、製剤中のポリマーおよびナノ粒子成分の重量パーセントを変化させることによって制御される。このプラットフォームでの以前の研究は、PNPヒドロゲルが高い生体適合性、生分解性、および非免疫原性28、30、31であることを示しています。全体として、これらのヒドロゲルは、術後接着防止、組織工学および再生、持続的な薬物送達および免疫工学を含む生物医学的用途において広い有用性を示す。

<table><tbody><tr><td>21Gニードル</td><td>BD</td><td>305165</td><td>PNPハイドロゲル注射</td></tr><tr><td>22G、皮下注射針4本</td><td>Air-Tite</td><td>N224</td><td>体外放出研究</td></tr><tr><td>384ウェルプレート、黒、クリアボトム</td><td>コーニング</td><td>3540</td><td>動的光散乱(DLS)</td></tr><tr><td>96ウェルプレート、黒</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>07-200-627</td><td>バイオスタビリティ研究</td></tr><tr><td>96ウェルプレート、クリア</td><td>Corning</td><td>3599</td><td>細胞生存率と沈降研究</td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C3100MP</td><td>細胞生存率と沈降研究</td></tr><tr><td>キャピラリーチューブ</td><td>McMaster-Carr</td><td>8729K66</td><td>In vitro放出研究</td></tr><tr><td>遠心フィルターユニット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>UFC901024</td><td>NP濃度</td></tr><tr><td>キュベット</td><td>ミリポアシグマ</td><td>BR759015-100EA</td><td>細胞生存率と沈降研究</td></tr><tr><td>DLSプレートリーダー</td><td>ワイアットテクノロジー</td><td>DynaPro IIプレートリーダー</td><td>動的光散乱(DLS)</td></tr><tr><td>エポキシ</td><td>VWR International</td><td>300007-392 (EA)</td><td>In vitro放出研究</td></tr><tr>皮<td>下注射針</td><td>Air-Tite</td><td>8300015027</td><td>ル</td></tr><tr><td>アーエルボーコネクター</td><td>コールパーマー</td><td>EW-30800-12</td><td>PNP ハイドロゲル製剤</td></tr><tr><td>ルアーロックシリンジ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-955-456</td><td>PNP ヒドロゲル製剤</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (1x)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>10010049</td><td>PNP ヒドロゲル製剤</td></tr><tr><td>プラスチックスパチュラ</td><td>トーマスサイエンティフィック</td><td>1229F13</td><td>レオロジー特性評価</td></tr><tr><td>プレートリーダー</td><td>BioTek</td><td>Synergy H1 ハイブリッドマルチモードプレートリーダー</td><td>バイオスタビリティ研究</td></tr><tr><td>プレートシール</td><td>エクセルサイエンティフィック</td><td>TS-RT2-100</td><td>バイオスタビリティ研究</td></tr><tr><td>組換えヒトインスリン</td><td>ギブコ</td><td>A11382II</td><td>バイオスタビリティ研究</td></tr><tr><td>レオメータ</td><td>TAインスツルメンツ</td><td>DHR-2 レオメータ</td><td>レオロジー特性評価</td></tr><tr><td>チオフラビン T</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>T3516-5G</td><td>バイオスタビリティ勉強</td></tr></tbody></table>

細胞および薬物送達用途のための注射可能な高分子ポリマーナノ粒子ヒドロゲル

Injectable Supramolecular Polymer-Nanoparticle Hydrogels for Cell and Drug Delivery Applications

これらの方法は、生体材料として使用するための注射可能な、上分子ポリマーナノ粒子(PNP)ヒドロゲルを処方する方法を説明する。PNPヒドロゲルは、ネットワークポリマーとして疎水性改変セルロースと、動的で多価な相互作用を通じて非共有クロスリンカーとして機能する自己組み立てコアシェルナノ粒子の2つの成分で構成されています。これらの方法は、ナノ沈降を介してこれらの自己集合ナノ粒子の形成だけでなく、調整可能な機械的特性を有するヒドロゲルを形成するための2つの成分の製剤および混合を記述する。合成された材料の品質を特徴づけるための動的光散乱(DLS)とレジロジーの使用についても詳しく説明しています。最後に、薬物の放出、バイオ医薬品安定化、および細胞のカプセル化および送達のためのこれらのヒドロゲルの有用性は、薬物放出、熱安定性、および細胞の沈降および生存率を特徴付けるインビトロ実験を通じて実証される。生体適合性、注射性、および穏やかなゲル形成条件により、このヒドロゲルシステムは、さまざまな生物医学用途に適した容易に調整可能なプラットフォームです。

PNPヒドロゲル製造と特性評価 PNPヒドロゲルは、疎水性修飾HPMCポリマーとPEG-PLAナノ粒子の2つの主要成分の混合を介して形成される(図1a)。治療用貨物は、ヒドロゲル調製前にナノ粒子成分を希釈するために使用される追加のバッファーに最も容易に組み込まれる。下流の生物医学的特性解析では、2つの成分の簡単で再現可能な混合を可能にする肘混合法を使用すると便利です(図1b)。十分な混合後、ヒドロゲルはシリンジにしっかりと感じるべきであるが、圧力下で収率を得て、標準的な針から押し出す(図1c)。注入後、ヒドロゲルは重力からの流れに抵抗する固体状の材料に急速に設定する必要があります。ヒドロゲルを完全に特徴付け、一貫したバッチからバッチ製品を確保するために、サンプルは、レオメータ上のいくつかの異なる実験を使用して分析する必要があります。ゲルのせん断と自己修復の機能は、それぞれフロースイーププロトコルとステップシェアプロトコルを使用して容易に観察されます(図2a、b)。2:10配合などの硬いゲルの場合、注入時の機械的条件をシミュレートするせん断速度が0.1から100s-1に増加するため、フロースイープ中に少なくとも2桁の粘度を求める必要があります。ステップせん断プロトコルは、高剪断ステップ下での粘度の桁違いの減少と、低剪断ステップ中のベースライン粘度への迅速な戻り(&lt;5s回復時間)を明らかにするべきである。線形粘弾性体の振動剪断周波数スイープ実験を用いた記憶および損失モジュリの特性評価は、0.1-100 rads-1の周波数範囲で固体状の特性を明らかにするべきである(図2c)。特に、通常、2:10ヒドロゲルのような硬質製剤の低周波数で観察可能なせん断貯蔵と損失モジュライのクロスオーバーは存在しないはずです。このようなクロスオーバーイベントは、出発物質の品質、修飾HPMCまたはPEG-PLAポリマー、またはPEG-PLAナノ粒子のサイズおよび分散性の問題を示す可能性がある。なお、クロスオーバーイベントは、1:5ヒドロゲルのようなより弱いヒドロゲル製剤に対して期待できる。PNPヒドロゲル上の振動剪断振幅スイープは、高い応力値が適用されるまで材料が降伏しないことを明らかにし、これらの材料が降伏応力を有することを示し、材料が流れるのに必要な応力の閾値量である。
PNPヒドロゲルからの放出キネティックスの特性 薬物送達のためのPNPゲルを設計する上で不可欠なステップは、選択された製剤からの薬物放出動態の特徴付けである。これにはいくつかの手法がありますが、単純な in vitro 方法論は、初期の製剤開発中に有用なデータを提供します (図 3a)。HPMC-C12またはNPsの量を調節することによってPNPヒドロゲルのポリマー含有量を変化させることは、これらのヒドロゲルの機械的特性とメッシュサイズを調整する最も簡単な方法であり、ポリマーネットワークを介した貨物の拡散および材料からの放出速度に直接影響を与える可能性がある(図3b)。動的メッシュサイズ(すなわち、高分子量または大きな流体力学的半径)よりも大きい貨物の場合、研究者はヒドロゲルデポからの貨物のゆっくりとした溶解媒介放出を期待すべきである。動的メッシュサイズが貨物のサイズ以上の製剤は、貨物拡散の従来のモデルを使用して記述することができる拡散媒介放出を可能にし、46、47、48、49。放出曲線の形状に基づいて、研究者はヒドロゲルを再配合して、より遅い(例えば、ポリマー含有量を増加させる)またはより速く(例えば、ポリマー含有量を減少させる)放出に向けて調整することができる。
治療貨物の安定性の評価 ヒドロゲル製剤中の治療貨物の安定性を決定することは、前臨床または細胞研究を開始する前に重要です。カプセル化剤の他の合成方法と比較して、PNPヒドロゲルはバルク材料に混合することによって穏やかな方法で貨物を組み込み、カプセル化が貨物を損傷する可能性は低い。これらの研究は、PNPヒドロゲルがインスリンなどの熱不安定性の影響を受けやすい貨物を安定化させることができ、貯蔵寿命を大幅に延ばし、冷蔵および流通への依存を減らすことも示している(図4)。ヒドロゲルへのカプセル化後、および長期間の保管後に、すぐに貨物の状態を評価することが重要です。これらのデータは、インスリン凝集を測定するための単純な蛍光アッセイを用いて、連続的な熱および機械的ストレスの下で28日間の貯蔵後にヒドロゲル中でインスリンが安定していることを示している。適切なプレートアッセイが利用できない場合の代替技術は、貨物の循環二色測定を行うことであり、これはタンパク質薬物の二次構造を決定するのに特に有用である。
PNPヒドロゲルにおける細胞の生存率と分散の決定 多くの治療細胞は、生存可能であり続けるために接着モチーフを必要とし、したがってアルギニン-グリシン-アスパラギン酸(RGD)ペプチドのようなインテグリンモチーフを含めることは、細胞療法のためのPNPヒドロゲルを細胞療法に適応させる上で重要なステップである50。このNPsを含むモジュラーPEG-PLAポリマーは、簡単な「クリック」化学28、51を通じてPEGコロナの化学的機能化を可能にする。この例では、細胞接着RGDペプチドをPEG-PLAポリマーに結合させ、PNPヒドロゲル構造との細胞関与を促進した。接着部位を欠いた製剤は、これらの接着モチーフを有する製剤にカプセル化された細胞と比較して、カプセル化された細胞が増殖しにくいため、細胞生存率が低い(図5a、b)。カプセル化された細胞は、カルセインAMまたは別の適切な蛍光色素(例えば、CFSE)で標識することができ、蛍光顕微鏡で細胞を計る。最適化の間、生存率は、インテグリン機能化製剤が高められた生存率および増殖を提供することを保証するために、未修飾のPNPヒドロゲルと比較されるべきである。インテグリン機能化製剤が非修飾ヒドロゲルと同様の有効性を提供している場合、これは接着モチーフを組み込むために使用される共役化学における失敗を示す可能性がある。
研究者は、適切なヒドロゲル製剤を使用する場合、封入された細胞がヒドロゲル培地を通じて均等に分散されることを期待する必要があります。これは、ヒドロゲル投与中に細胞の一貫した予測可能な投与を可能にし、投与後にヒドロゲル中の細胞の局所的な保持に翻訳する必要があります。細胞の分布は、蛍光顕微鏡技術を用いて容易に決定することができる。細胞は適切な色素で標識し、次に共焦点顕微鏡を用いて画像化することができる。画像は、画像の縦軸に沿った平均蛍光強度を測定するために ImageJ ソフトウェアを使用して視覚的に評価することができます (図 5c) (図 5d)は、画像の垂直軸に沿って蛍光強度の平均を測定します (または重力による細胞の沈降が予想される軸に沿って)。ヒドロゲル製剤が長期間にわたって懸濁液中の細胞を支持するには弱すぎると、 図5の1:1製剤で観察されるように細胞の沈降が起こる。ポリマー含有量を増加させることで、沈降による不均一な細胞分散の問題を解決できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig1v4.jpg"> 図1:ポリマーナノ粒子(PNP)ヒドロゲルは、2つの成分を混合して容易に形成される。(a)第1成分はドデシル修飾ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC-C12)の溶液であり、第2成分はポリ(エチレングリコール)-ブロック-ポリ(乳酸)(PEG-PLA)ナノ粒子と任意の治療貨物と共に溶液である。これら2つの成分の穏やかな混合は、HPMC-C12ポリマーがPEG-PLAナノ粒子との動的、多価相互作用によって物理的に架橋される注射ハイドロゲルをもたらす。(b)2つの注射器と混合してゲル製剤を示す写真、それぞれ1個がPNPヒドロゲルの1成分を含む。2つのシリンジをLuer-lock肘コネクタと接続することで、2つの成分を無菌条件下で容易に混合し、すぐに使用するために注射器にあらかじめロードされた気泡のないヒドロゲルを得ることができます。NP溶液はデモのために青色に染めます。(c)PNPヒドロゲルの注入とその再凝固のデモンストレーション。(i)21G針を付けた注射器中のPNPヒドロゲル。(ii) 注入は、ポリマーとナノ粒子の相互作用を一時的に破壊するシアー下にヒドロゲルを配置し、流体のような一貫性を作り出す。(iii)ポストインジェクションは、動的ポリマーナノ粒子相互作用を急速に改変し、ヒドロゲルを固体に自己治癒することを可能にする。(iv)固体ヒドロゲルは重力などの降伏応力よりも弱い力下で流れません。PNPヒドロゲルはデモのために青く染める。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig2v3.jpg"> 図2:2つのPNPハイドロゲル製剤のレオロジー特性製剤は、ポリマーwt%として表される。:NP wt.%。() PNP ヒドロゲルの低い剪断速度から高いせん断速度に安定したせん断流が掃引される。せん断速度の関数としての粘度は、せん断間の特性を特徴付けます。(b) 低剪断速度(白い背景;0.1s−1)から高剪断率(赤の背景;10s−1)の間の振動剪断率の関数としての粘度は、PNPヒドロゲルの自己治癒特性を示す。せん断料金はそれぞれ30 sに課されます。(c)様々なPNPヒドロゲル製剤のための一定1%株での周波数の関数として弾性記憶弾性G′および粘性損失係数G"。(d) 振幅スイープは、10のrad/sの一定の周波数でスイープし、ストレスの関数としてPNPヒドロゲルの弾性記憶弾性率G'および粘性損失係数G"を特徴付ける。このレオロジー特性は、品質管理の比較として使用できます。この図は、Grosskopfら28<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig2v2large.jpg" target="_blank">より大きなバージョンのこの図を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig3v2.jpg"> 図3:PNPヒドロゲルからのウシ血清アルブミン(BSA)のインビトロ放出製剤は、ポリマーwt%として表される。:NP wt.%。() 実験in vitroリリースプロトコルを記述する回路図。アリコートは、PNPヒドロゲルにロードされた毛細管チューブから時間の経過とともに除去される。(b) BSAの1:10 PNP、2:5 PNPおよび2:10 PNPからのインビトロ放出は、アッセイ中に収集された総質量で割った指定された時点で収集された質量として報告された(平均±SDとして示されるデータ;n = 3)。BSAは吸光度測定を通じて検出された。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig3v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig4v2.jpg"> 図4:ThTアッセイによりPNPヒドロゲルに封入されたインスリンの熱安定性 製剤は、ポリマーwt%として表される。:NP wt.%。1:5および2:10の両方でカプセル化されたインスリンは、37°Cのストレス老化状態および一定の攪拌において28日以上にわたって無凝集したままでした。PBSで製剤化されたインスリンに対する凝集時間は20±4時間であった(平均 ±SD、アグリゲーション閾値750,000 AFU)。 n=4 実験複製(AFU、任意の蛍光単位)の平均として提示されるデータ。この図はMeisらから適応されています38<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig4v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig5v2.jpg"> 図5:PNPヒドロゲルにおける細胞生存率および細胞沈降性(a,b)ヒト間葉系幹細胞(hMSC)を有するPNPヒドロゲルにおける細胞生存率試験。(a)細胞接着アルギニングリシンアスパラギン酸(RGD)モチーフをPEG-PLA NPsに結合させた細胞接着アルギニン-グリシンアスパラギン酸(RGD)モチーフの有無を問わず、1:5 PNPヒドロゲル中の生存可能なhMSCの代表的な画像は、共焦点イメージングの前に30分間カルセイン染色された。スケールバーは100μm(b)6日目の細胞生存率を、1日目の蛍光細胞数に対する画像内の蛍光細胞数として定義(SD±平均値として示すデータ)n = 3)。(c,d)hMSCを用いた細胞カプセル化および沈降実験(c) セルセトリングを定量化するために、1:1 PNPヒドロゲル(上段)および1:5 PNPヒドロゲル(下段)にカプセル化されたカルセインAM染色hMCSの最大強度画像。スケールバーは、ヒドロゲルの垂直プロファイルに沿ったhMSCの平均水平ピクセル強度を1mm(d)で表します。この図は、Grosskopfら28<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig5v2large.jpg" target="_blank">より大きなバージョンのこの図を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、注射可能な、上分子ポリマーナノ粒子(PNP)ヒドロゲルバイオマテリアルの合成および処方を記述する。これらの物質の薬物送達、バイオ医薬品安定化、細胞カプセル化および送達への応用が実証されている。

These methods describe how to formulate injectable, supramolecular polymer-nanoparticle (PNP) hydrogels for&#160;use as biomaterials. PNP hydrogels are ...

我々のプロトコルは、生体材料として使用するためのポリマーナノ粒子ヒドロゲルの処方を容易にする。研究者が翻訳アプリケーションのためにこの資料を開発し、基本的な生物学的問題を探求することを願っています。PNPヒドロゲルは、小径の針とカテーテルを介して容易に注入されるが、注射後すぐに自己治癒する。これは、長いタイムスケール上の薬物および細胞の非侵襲的制御された送達を可能にする。この技術は、がんから組織再生、受動的な予防接種にまで広範な荒れ狂う状態に影響を及ぼす、局所的な治療と拡張薬物放出の境界を押し広げる。ナノ沈殿によってナノ粒子を合成するには、PEG-PLAポリマーの50ミリグラムを8ミリリットルガラスシンチレーションバイアルに加え、バイアルに1ミリリットルのアセトニトリルを加える。完全に溶解する渦。次に、小さな攪拌バーを備えた20ミリリットルのガラスシンチレーションバイアルに10ミリリットルの超純水を加え、1分間に600回転に設定された攪拌プレートにバイアルを置きます。200マイクロリットルのピペットを使用して、水のバイアルに滴下するポリマー溶媒溶液の1ミリリットルを加えます。コアシェルナノ粒子は、ポリマー溶媒溶液が水全体に急速に分散されるように形成されます。標準プロトコルに従って動的光散乱により粒子サイズを検証します。次にナノ粒子溶液を遠心フィルタユニットに移し、溶液を250マイクロリットル未満に濃縮し、適切なバッファー内のナノ粒子を再懸濁させる。ヒドロゲルを調製するには、6%HPMC-C12ストック溶液の333ミリグラムを1ミリリットルのルアーロックシリンジに加え、20%ナノ粒子ストック溶液の500マイクロリットルとPBSの167マイクロリットルを8ミリリットルバイアルに加えます。混合した後、注射針を使用して、希釈されたナノ粒子溶液で別の1ミリリットルルアーロックシリンジを充填し、2つの注射器を肘ミキサーに取り付けます。均質で不透明な白いヒドロゲル材料が形成されるまで、約60サイクルの2つの溶液を混合します。配合されたハイドロゲルのレオロジー特性を測定するには、選択した幾何学的ギャップに従って適切な量のハイドロゲルを鋸歯状のレオメータプレートの中央に注入し、振動試験と流量試験を使用してサンプルの機械的特性を測定します。ヒドロゲルからの薬物放出を特徴付けるには、まず、エポキシを用いて各チューブの一端をシールしてガラス毛細血管を調製する。エポキシが設定されている場合は、4インチ22ゲージの皮下注射針を使用して、1サンプルあたり最低3本のチューブに100〜200マイクロリットルのヒドロゲルを注入し、200〜300マイクロリットルのPBSをヒドロゲルの各体積に慎重に加えます。適切な時点で、薬物放出の予想タイムスケールに応じて、針を使用して、ヒドロゲル表面を乱すことなく各毛細血管からPBSを慎重に除去し、PBSの新鮮な量を追加する。研究が完了したら、収集したPBSアリコートを適切な方法で分析し、各時点で放出される薬物の量を定量化する。ゲルカプセル化されたインスリンの熱安定性を特徴付けるために、示されているようにインスリンとチオフラビンTの両方をヒドロゲルにロードし、21ゲージ針を使用して、200マイクロリットルの貨物およびプローブロードヒドロゲルをサンプル当たり黒い96ウェルプレートの少なくとも3つの井戸に注入する。その後、蒸発を防ぐために光学的に透明な粘着板シールでプレートを密封し、温度制御、振盪および運動読み取りプログラミングを備えたプレートリーダーにプレートを挿入します。ヒドロゲルカプセル化細胞の生存率を評価するには、21ゲージ針を使用して、透明な底96ウェルプレートのサンプル当たり3つのウェルそれぞれに適切な濃度の細胞を含む150マイクロリットルのヒドロゲルを注入し、適切な細胞培地の100マイクロリットルをヒドロゲルの各体積に加える。培養の1日目に、各サンプル群の適切な時点で各ヒドロゲル上の上清を2ミリモルカルセインAM溶液の50マイクロリットルで交換します。30分間のインキュベーションの後、共焦点顕微鏡で各ウェルの中心を画像化します。封入された細胞が注射器に沈着する能力を評価するために、目的の細胞をPBS濃度で1ミリリットル当たり6個の細胞に10倍に希釈し、室温で10分間2ミリモルカルセインAMの50マイクロリットルで細胞を染色する。インキュベーションの最後に、実証したように500〜700マイクロリットルのヒドロゲルと細胞を混合し、21ゲージ針を使用して、ヒドロゲルを含む100〜200マイクロリットルの細胞をサンプルあたり少なくとも1つのキュヴェットの底に注入する。次に、注入直後と播種後1時間と4時間後に共焦点顕微鏡のステージで横たわっているキュベットを画像化して、細胞がヒドロゲルに落ち着いたか、または懸濁したままであるかどうかを観察します。ゲルのせん断薄化および自己治癒機能は、それぞれフロースイープおよびステップせん断プロトコルを使用して観察することができる。線形粘弾性体の周波数範囲での振動剪断周波数スイープ実験を用いた記憶および損失モジュリの特性評価は、1秒あたり0.1〜100ラジアンの範囲で固体状の特性を明らかにする。一般的に、より硬い製剤の低周波数で観察されるせん断貯蔵と損失モジュリのクロスオーバーはあってはならないが、クロスオーバーイベントは、より弱いヒドロゲル製剤のために期待することができる。PNPヒドロゲルのポリマー含有量を変化させることは、ポリマーネットワークを介した貨物の拡散および材料からの放出速度に直接影響を与える可能性があります。PNPヒドロゲルは、熱不安定の影響を受けやすい貨物を安定化させ、貨物の貯蔵寿命を大幅に延ばし、コールドチェーンの貯蔵と流通への依存を低減します。インテグリンモチーフを含めることは、細胞療法のためのPNPヒドロゲルを適応させるために有用であり得る。カプセル化された細胞は、その可視化および定量化を容易にするために蛍光標識することができる。例えば、接着部位を欠いた製剤は、カプセル化された細胞がカプセル化された細胞およびRGDなどの接着モチーフを有する製剤と比較して増殖しないため、細胞生存率が低い。製剤の変化が、ポリマーマトリックスのレオロジー特性と動的メッシュにどのように影響するかをまだ探っています。また、FRAPを用い、ヒドロゲル内の分子の拡散を研究しています。これらの材料は、持続的な送達が薬物送達、ワクチン開発または癌免疫療法にどのような影響を与えるかについて新しい生物学的質問をするために使用することができる。

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