Name: ターナー症候群(45XO)の胎児細胞による、その症候群に伴う神経障害の下流モデリングのための人工多能性幹細胞の生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 学ぶ ターナー症候群胎児線維芽細胞からエピソームプラスミドによる無統合iPSCを樹立し、多能性解析と神経細胞分化を行う方法。このプロトコルは遺伝性疾患の病態モデリングに有用です。

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上記の研究のための財政支援は、高等教育のマニパルアカデミーによって提供されました.ラインの特徴付けは、NCBSのM.Mパニッカーの研究室で部分的に行われました。アナンド診断研究所のカリョタイピングに関する支援に感謝します。

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

細胞遺伝学的に異常な胎児組織の安定した細胞モデルの生成は、欠陥表現型を永続させるために必要である。iPSC経路は、欠陥物20の永久保存のための細胞調製の最も効果的な方法である。
多能性幹細胞(PSC)は、初期の切断胚21を連想させる特殊な細胞への自己複製および分化の特性を示す。したがって、PSCは、早期に中絶された胎児の初期の分子、細胞および発達上の欠陥を研究するための優れたモデルとして役立つことができる。
本稿では、核分裂を用いたヒトiPSC生成と改善されたエピソームベクターについて説明した。この結果は、単一トランスフェクションがリプログラミングを成功させるために十分であったという事実によって証明されるように、この組み合わせは、統合のないヒトiPSCラインを生成するための堅牢な方法を含みであることを示している。我々は、FCV線維芽細胞から微小顕微鏡的に多能性細胞への進行性転換を追跡した。トランスフェクション後20日、我々は、非再プ...

無数化は、出生時欠損/先天性奇形およびヒトにおける妊娠喪失を引き起こす。妊娠喪失から50%~70%の検体が細胞遺伝学的異常を示す。妊娠初期に失われた無数胚は、ヒト胚発生を密接に表す他のモデルを開発する必要性を高める実験分析では容易には得られない。遺伝性疾患と診断された細胞由来の誘導多能性幹細胞(iPSC)は、胎児の発達における代表的な遺伝的不規則性とその結果をモデル化するために用いられてきた。これらのiPSCは、現像性胚のエピブラスト細胞に似ており、胚形成の初期の事象を再現することができる。これらは、初期の哺乳類胚における細胞系統およびパターニングの発達プログラムの理解と特徴付けを可能にする。iPSCは、単一体性X(ターナー症候群)、トリソミー8(ワルカニー症候群2)、トリソミー13(パタウ症候群)および部分トリソミー11のような無数数分解症候群の出生前診断試験から以前に由来する皮膚線維芽細胞およびアミオサイトから誘導された。22(エマニュエル症候群)は、失敗した開発4に関する貴重な洞察を提供しています。
ターナー症候群(TS)は、女性の不妊、低身長、内分泌および代謝障害、自己免疫疾患のリスクの増加、および心血管疾患に対する素因を特徴とする稀な状態である5。それは唯一の生存可能な単一体症候群であるが、それはまた、自発的な中絶を引き起こす発達中の胚に致命的である6.TSを有する生存者は、細胞内のX染色体物質の変化の程度を有する。核型は、1つのX染色体(45,XO)の完全な損失から45、XO / 46、XXのようなモザイクまで及ぶ。45、XO/47、XXX、環染色体の存在、Y染色体物質の存在、5.
この症候群の診断は、一般的に、症状のある個人の核型血液と、初期の異性数体症候群を検出するための絨毛絨毛サンプリング(CVS)によって行われる。無数性症候群は、自然流産の30%を占めるので、自然流産時に受胎(POC)の産物を核型化することは日常的である。これらの胎児細胞は、細胞遺伝学的異常を有する絨毛性絨毛およびそれらに由来するiPSCを含む、無数性症候群4,6を研究するための有用な生物材料源を提供する。TS iPSCは、レトロウイルスリプログラミング4を介してアニオサイトから以前に確立されており、レトロウイルスリプログラミング6を介して絨毛性絨毛絨毛菌の線維芽細胞(出生前診断を通じて得られる)、センダイウイルスリプログラミングを介した血液単核細胞7から、およびレンチウイルスリプログラミングを介したTS個体の皮膚線維芽細胞から4.私たちの研究室の主な焦点は発達障害を理解することなので、私たちはPOCからTS iPSC、特に自発的中絶の絨毛絨毛性絨毛成分を生成しました 8.この胎児組織から単離された細胞は全て45XOの核型を有し、同じ核型のiPSCを生み出した。これらのiPSCは、中絶された胎児から最初に生成され、妊娠障害に関連する妊娠障害を研究するための貴重なリソースを提供するので、ユニークです。この記事では、エピソームリプログラミングを通じて、このユニークな細胞源からのiPSCの生成の詳細な方法論を提供します。
iPSC生成の初期の方法では、ウイルス伝達とトランスポゾンを使用してリプログラミング因子を提供しました。細胞を多能性に誘導する方法は、レトロウイルスベクター9、切除可能なレンチウイルスベクター10、11およびトランスポゾンベースの方法12を用い、非統合型アデノウイルスベクター13およびセンダイウイルスベースベクター14に進化した。レトロウイルスおよびレンチウイルスベースのリプログラミングは、効率的ではあるが、宿主染色体へのリプログラミング因子の統合を伴い、iPSCに予期せぬ影響を及ぼす挿入突然変異を引き起こす。さらに、ウイルスベースのリプログラミングは、iPSCの翻訳適用を防ぎます。RNA系システム15および直接タンパク質送達16は、ウイルスおよびDNAトランスフェクションの使用に関連する潜在的なリスクを完全に排除するために検討されている。しかし、これらの方法は非効率的であることが証明されています。
2011年、沖田らは、shRNAを介したTP53抑制によって増強されたエピソームプラスミドによるリプログラミングの効率向上を報告した。彼らはまた、cMYCを非変形型LMYC(小細胞肺癌関連MYC)に置き換え、hipscの安全性を高めました。これらのエピソームプラスミドは、5つのリプログラミング因子を発現する:OCT4、LIN28、SOX2、KLF4、LMYCおよびSHRNA用TP5317,18。これらのベクターは、余分な染色体的に維持され、連続培養時に再プログラムされた細胞から失われ、10〜15の通過以内にラインをトランスジーンフリーにします。核細胞は、宿主細胞の核に直接核酸を送達するエレクトロポレーションの特殊な形態です。これは、様々な細胞タイプにリプログラミングプラスミドを送達するための効率的な方法です。上皮プラスミドは費用効果が高く、核の高い費用を補います。この方法は、様々な体細胞から安定したiPSCを生み出す最適化された条件下で効率的かつ再現可能です。本プロトコルでは、エピソームリプログラミングプラスミドの核形成によって胎児組織から単離された線維芽細胞からのiPSCの生成方法について述べている。ここでは、胎児絨毛絨毛絨毛、プラスミド精製、核整離、リプログラミングプレートからのコロニーの摘出、安定したiPSCの確立からの線維芽細胞の分離のための詳細なプロトコルを示します。
新たに生成されたiPSCにおける多能性特性の存在を確認することが不可欠である。これには、多能性関連因子のデモンストレーションが含まれます(例えば、 アルカリホスファターゼ発現、ナノグ、SSEA4、Tra 1-80、Tra 1-81、E-カドヘリン;通常、免疫蛍光または遺伝子発現アッセイで示される)、インビトロ分化アッセイによる3つの胚芽層の同定、染色体含有量を決定するための核型入力、染色体含有量を決定するためのカルギタイピング、同定を確立するためのSTRタイピング そして、テラトーマ形成および四数相補解のようなインビボアッセイでより厳しい。ここでは、核型の特徴付けプロトコル、生細胞アルカリホスファターゼ染色、免疫蛍光による多能性関連バイオマーカーの検出、外因性遺伝子19の喪失を実証する体外分化アッセイおよび方法について説明する。

<table><tbody><tr><td>0.15% トリプシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>27250018</td><td>G バンディング</td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>21985023</td><td>多能性および胚様体培地</td></tr><tr><td>4', 6 ジアミジノ-2-フェニルインド</td>ール <td>Sigma Aldrich</td><td>D8417</td><td>免疫細胞化学</td></tr><tr><td>アクチビン A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SRP3003</td><td>分化アッセイ</td></tr><tr><td>アルカリホスファターゼライブステイン</td><td>、サーモフィッシャーサイエンティフィック</td>、<td>A14353</td>、<td>AP染色、</td></tr><tr><td>AMAXAヌクレオフェクターII</td><td>、ロンザ</td><td>ヌ</td><td>クレオフェクション</td></tr><tr><td>、アムニオMAX IIコンプリートメディア</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック、ギブコ</td><td>11269016</td><td>胎児絨毛膜絨毛細胞培養に特化した培地</td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>HiMedia</td><td>TC021</td><td>プラスミド精製</td></tr><tr><td>抗マウスIgG(H+L)Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11059</td><td>免疫細胞化学</td></tr><tr><td>抗ウサギIgG (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td>免疫細胞化学</td></tr><tr><td>抗ウサギIgG (H+L) Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A11035</td><td>免疫細胞化学</td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌剤</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>15240096</td><td>コンタミネーションコントロール</td></tr><tr><td>Anti-E-Cadherin</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td><td>免疫細胞化学</td></tr><tr><td>抗ナノ</td><td>BD Biosciences</td><td>560109</td><td>免疫細胞化学</td></tr><tr><td>抗OCT3/4</td><td>BD Biosciences</td><td>611202</td><td>免疫細胞化学</td></tr><tr><td>抗SOX17</td><td>BD Biosciences</td><td>561590</td><td>免疫細胞化学</td></tr><tr><td>抗SOX2</td><td>BD Biosciences</td><td>561469</td><td>免疫細胞化学</td></tr><tr><td>抗SSEA4</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>560073</td><td>免疫細胞化学</td></tr><tr><td>抗TRA 1-81</td><td>ミリポア</td><td>MAB4381</td><td>免疫細胞化学</td></tr><tr><td>基礎 線維芽細胞増殖因子[FGF2]</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F0291</td><td>多能性中</td></tr><tr><td>骨形態形成因子 4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SRP3016</td><td>分化アッセイ</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>ブロッキングコラーゲン ヒトIV型</td><td>BD バイオサイエンス</td><td></td><td>354245分化アッセイ</td></tr><tr><td>コラゲナーゼブレンド</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8051</td><td>胎児絨毛膜絨毛の消化</td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td>分化アッセイ</td></tr><tr><td>DMEM F12</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11320033</td><td>分化アッセイ</td></tr><tr><td>FastDigest EcoR1</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0274</td><td>制限消化</td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2518</td><td>分化アッセイ</td></tr><tr><td>Giemsa Stain</td><td>HiMedia</td><td>S011</td><td>G Banding</td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>HiMedia</td><td>AS001</td><td>核型検査用固定剤</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7528</td><td>分化アッセイ</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>35050061</td><td>多能性および胚様体 培地</td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149</td><td>分化アッセイ</td></tr><tr><td>インスリン溶液 ヒト</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278</td><td>分化アッセイ</td></tr><tr><td>インスリントランスフェリン セレンライト</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1884</td><td>分化アッセイ</td></tr><tr><td>KAPA HiFi PCRキット</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KR0368</td><td>OriP, EBNA1 PCR</td></tr><tr><td>KaryoMAX コルセミド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15210040</td><td>核型検査のための有糸分裂停止</td></tr><tr><td>ノックアウト DMEM</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td>10829018 多能性および胚様体培地</td></tr><tr><td>ノックアウト 血清補充</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック 10828028</td><td></td><td>多能性および胚様体培地</td></tr><tr><td>ルリア・ベルタニ寒天</td>培地 <td>HiMedia</td><td>M1151F</td><td>プラスミド精製</td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td>BD バイオサイエンス</td><td></td><td>356234 分化アッセイ</td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11140035</td><td>多能性および胚様体培地</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>HiMedia</td><td>MB113</td><td>核型検査用固定剤</td></tr><tr><td>ミオシン心室重鎖 &α;/&beta;</td><td>ミリポア</td><td>MAB1552</td><td>免疫細胞化学</td></tr><tr><td>NHDF ヌクレオフェクターキット</td><td>ロンザ</td><td>VAPD-1001</td><td>ヌクレオフェクション</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (PFA)</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P6148</td><td>固定細胞</td></tr><tr><td>pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F</td><td>Addgene</td><td>27077</td><td>エピソームリプログラミングプラス</td></tr>ミド <tr><td>pCXLE-hSK</td><td>Addgene</td><td>27078</td><td>エピソームリプログラミングプラスミド</td></tr><tr><td>pCXLE-hUL</td><td>Addgene</td><td>27080</td><td>エピソーム リプログラミング プラスミド</td></tr><tr><td>ペニシリン ストレプトマイシン</td><td>&nbsp;サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック&<td>nbsp;15070063</td><td>多能性と胚様体培地</td></tr><tr><td>ファロイジン-テトラメチルローダミン B イソチオシアネート</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1951</td><td>免疫細胞化学</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td>1 X PBS 1錠 PBS 1錠を200mLの脱イオン水に溶解し、オートクレーブ滅菌 保存方法: 室温. PBST- 0.05% Tween 20 in 1X PBS. 保存方法: 室温。</td></tr><tr><td>プラスミド精製キット-ミディ調製</td><td>QIAGEN</td><td>12143</td><td>プラスミド精製</td></tr><tr><td>塩化カリウム溶液</td><td>HiMedia</td><td>MB043</td><td>核型検査用低張液</td></tr><tr><td>QIAamp DNA血液キット</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>ゲノムDNA単離</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11875093</td><td>肝細胞分化培地</td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム</td><td>HiMedia</td><td>RM255</td><td>核型検査用低張液</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>HiMedia</td><td>MB031</td><td>透過化</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.05%)</td> <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック、Gibco</td><td>25300054</td><td>のサブカルチャー &nbsp;胎児絨毛膜絨毛線維芽細胞</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>HiMedia</td><td>MB067</td><td>PBST</td></tr><tr><td>&βの調製;IIIチューブリン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8578</td><td>免疫細胞化学</td></tr><tr><td>Y-27632二塩酸塩</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td>分化アッセイ</td></tr></tbody></table>

ターナー症候群(45xo)の胎児細胞による、その症候群に伴う神経障害の下流モデリングのための人工多能性幹細胞の生成

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome (45XO) Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndrome

染色体の無数化は、中枢神経系奇形や胎児死を含む重度の先天性奇形を引き起こす。出生前の遺伝子スクリーニングは純粋に診断であり、疾患メカニズムを解明するものではありません。無数性胎児の細胞は染色体異数化を有する貴重な生物学的物質であるが、これらの細胞は短命であり、下流の研究実験への使用を制限している。誘導多能性幹細胞(iPSC)モデルの生成は、無数形質の永久保存のための細胞調製の有効な方法である。彼らは自己更新し、胚発生を連想させる特殊な細胞に分化しています。したがって、iPSCは初期の発生事象を研究するための優れたツールとして機能します。ターナー症候群(TS)は、完全にまたは部分的に欠けているX染色体に関連する稀な状態である。この症候群は、不妊症、低身長、内分泌、代謝、自己免疫障害および心血管障害および神経認知障害を特徴とする。以下のプロトコルは、TS(45XO)胎児組織からの線維芽細胞の単離および培養、核整形によるエピソームリプログラミングプラスミドの送達を介した統合自由TSiPSCの生成、その後の特徴付けについて説明する。TSiPSCのリプログラミングは、最初は生細胞アルカリホスファターゼ染色によってスクリーニングされ、続いて多能性バイオマーカーの広範な調査が行われました。選択したコロニーを機械的に解剖し、数回通過し、安定した自己更新細胞を更なる実験に使用した。細胞は、多能性転写因子OCT4、NANOG、SOX2、細胞表面マーカーSSEA 4およびTRA1-81の多能性幹細胞の典型的な転写因子を発現した。元の45XOの核型はポストリプログラミングを保持していた。TSiPSCは胚体を形成し、系統特異的バイオマーカー((SRY BOX17)(ミオシンヴェントリーキュラーヘビーチャイエンα/β)(βIII TUBULIN)を発現する内胚体、中胚および外胚の細胞に分化することができた。外因性エピソームプラスミドは、細胞内で15を通過した後、自発的に失われ、検出されなかった。これらのTSiPSCは、ターナー症候群に関連する神経認知障害を引き起こす欠陥のある分子および細胞性神経発達をモデル化するための貴重な細胞資源である。

45XO核型を用いた自発的に中止された胎児からの統合自由なiPSCの生成 我々は、ターナー症候群(TS)特異的な45XO核型を有するFCVから線維芽細胞を単離し、エピソームリプログラミングプラスミドでこれらを核感染させ、症候群の下流モデリングに使用できるTSiPSC、特に関連する神経学的欠損を生成した(図1a&amp;b)。トランスフェクション実験に非インテクティングエピソームベクターと核分裂を用いた(図1 c&amp;d)。我々は、リプログラミングの成功を監視するために細胞の形態学的変化に従った。線維芽細胞から上皮形態への移行は、続いて、縮合コロニー形成を示した。.図2a)。TSiPSCは、トランスフェクション20日目頃に、異なるエッジと高い核対細胞質比を有する形態のようなヒト胚性幹細胞を獲得した(図2b)。<...

このプロトコルは、核軟部によるエピソームプラスミドの送達を通じた胎児組織線維芽細胞からの統合自由なiPSCの生成と、iPSC特性評価および神経分化に用いられる方法の記述を記述する。

ターナー症候群(45XO)の胎児細胞による、その症候群に伴う神経障害の下流モデリングのための人工多能性幹細胞の生成

Chromosomal aneuploidies cause severe congenital malformations including central nervous system malformations and fetal death. Prenatal genetic screening ...

ターナー症候群は、完全にまたは部分的に欠けているX染色体に関連する稀な状態である。この症候群は、不妊症、低身長、心血管障害、および神経認知障害を特徴とする。場合によっては、胎児の死を引き起こす。無数胎児の体細胞は生物学的に価値があるが、それらは短命であり、研究における使用を制限する。iPSCの生成は、したがって、無数形質の永久保存のための細胞調製の有効な方法である。彼らは自己更新であり、初期の胚発生を連想させる特殊な細胞型に分化することができる。核小説を通じた非統合エピソームリプログラミングプラスミドの提供は、完全に再プログラムされた安定したiPSCを生成するための効率的で再現可能な方法です。この方法は、プログラミングが困難なセルにも使用できます。このプロトコルでは、胎児物質からのiPSCのアネプリオドによる再生について説明する。収集した胎児絨毛絨毛を滅菌ペトリ皿に移します。1X抗生物質抗ミキサン溶液を含むPBSで数回洗浄してください。ピペット処理でPBSを完全に取り除く。ビリにコラゲターゼブレンド1mlを加え、摂氏37度で10分間、または組織が崩壊するまでインキュベートします。インキュベーション後、10%の牛血清を含む培地を添加してコラゲターゼを中和する。ペトリ皿の内容物を15mlのチューブに移します。崩壊した絨毛と放出細胞を収集するために消化を遠心分離する。上清を慎重にデカントします。プレートは、T25培養フラスコおよびAmnioMAX培地中で放出された細胞と共に絨毛を崩壊させ、コンフルエント線維芽細胞培養が得られるまで増殖する。繊維芽細胞と培養を展開し、その後のトランスフェクションおよび特性評価実験で使用するための在庫を準備します。リプログラミングプラスミドを含むアルカリの培養物を準備する。メーカーの指示に従って、ミディプラスミド精製キットを使用してプラスミドを分離します。各パレットを適切な量のDNAse RNAseフリー水で再中断し、1ミリリットル当たり1マイクログラムの最終濃度を得る。メーカーの指示に従って、ECoR1制限消化キットを使用してプラスミドを確認します。絨毛性絨毛線維芽細胞をトリプシン化する。中和し、遠心分離機を使用して細胞を採取する。上清をデカントし、細胞を5mlOPTI-MEMで再懸濁する。ヘモサイトメーターを使用して細胞を数え、核の100万個の細胞を除去します。遠心分離機は、セルパレットを取得します。アマキシNHDFニュークレオフアクターキットを使用して核切除を行います。キットに用意されている0.5 mLサプリメントと2.25 mL核級の核を混合して、中性硬化剤試薬を調製します。100マイクロリットルの核を除去し、各プラスミドを1マイクログラムずつ加えます。このミックスで100万個の細胞を穏やかに再懸濁する。細胞DNA懸濁液をキュ

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JoVE Journal

Developmental Biology

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学ぶ ターナー症候群胎児線維芽細胞からエピソームプラスミドによる無統合iPSCを樹立し、多能性解析と神経細胞分化を行う方法。このプロトコルは遺伝性疾患の病態モデリングに有用です。

ターナー症候群(45XO)の胎児細胞による、その症候群に伴う神経障害の下流モデリングのための人工多能性幹細胞の生成

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