Name: ウイルス様粒子(「ナノブレード」)を介した不死化細胞および初代細胞におけるCas9/sgRNAリボヌクレオタンパク質複合体の送達 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 学ぶナノブレードを用いたCas9/sgRNA複合体の送達法。ウイルス様粒子により不死化細胞および初代細胞で迅速かつ効率的なゲノム編集を実現し、オフターゲット効果を抑制する革新的な手法です。

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この研究は、フランス国立研究庁(ANR)、フィノヴィ財団、Agence Nationale des Recherches sur SIDA et les Hépatites Viloles(ANRS-ECTZ3306)、および欧州連合のHorizon 2020研究およびイノベーションプログラムの下での欧州研究評議会(ERC-StG-LS6-805500からE.P.R.)が運営するプログラムInvestissements d'Avenir(ANR-11-IDEX-0007)内のLabex Ecofect(ANR-11-LABX-0048)によって資金提供されました。

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<li>Zuris, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipid-mediated+delivery+of+proteins+enables+efficient+protein-based+genome-editing+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome-editing in vitro and in vivo.</a> Nature Biotechnology. 33, 73-80 (2015).</li>
<li>Mangeot, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+primary+cells+and+in+vivo+using+viral-derived+Nanoblades+loaded+with+Cas9-sgRNA+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Genome editing in primary cells and in vivo using viral-derived Nanoblades loaded with Cas9-sgRNA ribonucleoproteins.</a> Nature Communications. 10 (1), 45(2019).</li>
<li>Cai, Y., Bak, R. O., Mikkelsen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+editing+by+lentiviral+protein+transduction+of+zinc-finger+and+TAL-effector+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Targeted genome editing by lentiviral protein transduction of zinc-finger and TAL-effector nucleases.</a> eLife. 3, 01911(2014).</li>
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<li>Gee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+nanovesicles+for+packaging+of+CRISPR-Cas9+protein+and+sgRNA+to+induce+therapeutic+exon+skipping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Extracellular nanovesicles for packaging of CRISPR-Cas9 protein and sgRNA to induce therapeutic exon skipping.</a> Nature Communications. 11, 1334(2020).</li>
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<li>Lyu, P., Javidi-Parsijani, P., Atala, A., Lu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivering+Cas9%2FsgRNA+ribonucleoprotein+%28RNP%29+by+lentiviral+capsid-based+bionanoparticles+for+efficient+%27hit-and-run%27+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Delivering Cas9/sgRNA ribonucleoprotein (RNP) by lentiviral capsid-based bionanoparticles for efficient 'hit-and-run' genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 47 (17), 99(2019).</li>
<li>Gheysen, D., Jacobs, E., de Foresta, F., Thiriart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+release+of+HIV-1+precursor+Pr55gag+virus-like+particles+from+recombinant+baculovirus-infected+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Assembly and release of HIV-1 precursor Pr55gag virus-like particles from recombinant baculovirus-infected insect cells.</a> Cell. 59 (1), 103-112 (1989).</li>
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<li>Marnef, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cohesin%2FHUSH-+and+LINC-dependent+pathway+controls+ribosomal+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">A cohesin/HUSH- and LINC-dependent pathway controls ribosomal DNA double-strand break repair.</a> Genes & Development. 33 (17-18), 1175-1190 (2019).</li>
</ol>

Philippe E. MangeotとEmiliano P. Ricciは、ナノブレード技術に関する特許の発明者として指名されています(特許出願人:国立サンテ研究所(INSERM)、国立科学研究センター(CNRS)、リヨンノルマルスーパーリュール、クロードベルナールリヨン1大学、ヴィルルバンヌセデックス、出願番号:WO 2017/068077 Al、特許ステータス: 2017年4月27日発行。原稿のすべての側面は特許出願によってカバーされています。残りの著者は、競合する利益を宣言していません。

ナノブレードは、細胞株および初代細胞におけるCas9/sgRNA RNP複合体の迅速かつ用量依存的な送達を可能にする。従来のトランスフェクションおよび他のウイルス送達ベクターとは対照的に、タンパク質エレクトロポレーションと同様に、ナノブレードは、導入遺伝子を含まない方法でCas9/sgRNA RNAを一過性送達するという利点を有する。ナノブレードは、拡大し続けるCRISPRバリアントファミリーに簡単かつ迅速に適合させることができる、タンパク質送達のための非常に汎用性が高く、シンプルで安価なプラットフォームを提供します。ナノブレードは、HEK293T細胞株またはその誘導体において製造することができる。ここで使用されるHEK293T細胞株は、レトロウイルスおよびレンチウイルス粒子産生を最大化するために開発されている( 材料表を参照のこと)。しかしながら、HEK293T細胞の他の供給源が適しているかもしれないが、HEK293T細胞源によって粒子産生における大きな違いが観察されているため、ユーザーは異なる供給源からのHEK293T細胞を試験および比較しなければならない。また、細胞はマイコプラズマ汚染を頻繁にチェックし、粒子産生に悪影響を及ぼす過剰合流を避けるために3日ごとに継代(古典的には1/8希釈)する必要があります。
細胞は20回以上の継代にわたって維持されるべきではない。グルコース、ペニシリン/ストレプトマイシン、グルタミン、および10%脱相補ウシ胎児血清を添加したDMEMを細胞培養に使用した。血清起源はナノブレード製剤の品質に影響を与える可能性があるため、大規模生産の前に異なるバッチの血清を試験する必要があります。ナノブレードは、RPMIなどの他の培地、またはトランスフェクションの翌日にDMEMを置き換えることができる最小限の必須培地の無血清修飾で効率的に製造することができます。以下に示すように、トランスフェクション後の培地置換はいくつかのDNAトランスフェクション試薬による任意であるが、VLPが放出される培地を改変することは、特に粒子調製物中の血清微量を制限するために有益であり得る。しかしながら、トランスフェクションの前日に低血清最小必須培地で細胞を培養することは未だ試みられていない。
前述のように、ナノブレードは、産生細胞におけるプラスミドの混合物の過剰発現時に産生される。過剰発現は、最適な生産のために必要であるように思われる。実際、この研究室では、Gag-Pol発現コンストラクトが抗生物質選択によって安定化された産生細胞株を開発しました。しかし、このシステムは大量のナノブレードを生産できませんでした。sgRNAコード構築物が産生細胞のゲノムに安定に組み込まれた場合にも同様の観察が行われた。他の粒子産生系について記載されるように、ナノブレード産生に関与する少なくともいくつかの構築物を発現する安定な細胞株が有用であり得る;しかし、これには確かに大量の上清の処理と粒子を精製するための適切な技術が必要です。上記のプロトコルは、特定のトランスフェクション試薬を利用するナノブレードを製造するための好ましい手順を概説しています( 材料表を参照)。
他のメーカーのトランスフェクション試薬も成功裏にテストされていますが、ナノブレードを使用したこのグループの結果の大部分は、ここに記載されている手順に従います。リン酸カルシウム試薬を使用して低コストのトランスフェクションを達成し、良好な生産効率を得ることができます。しかしながら、この方法は、トランスフェクションの翌日にトランスフェクション培地の交換を絶対に必要とし、沈降粒子調製物中にリン酸カルシウム残基を残す可能性がある。産生細胞内でのナノブレード成分の高発現レベルの必要性と一致するのは、Cas9タンパク質に関連するsgRNAの量が効率的なゲノム編集のための制限因子となり得るという観察である。sgRNAローディングを改善するために、ナノブレードに類似したタンパク質送達ベクターを使用する独立したグループによって、2つの技術的アプローチが最近開発されている。これらは、sgRNA6のT7ポリメラーゼ依存性細胞質発現の使用、またはGagポリタンパク質6への結合を媒介するsgRNA配列へのレトロウイルス捕捉シグナルの付加に依存している。これらのアプローチは、ナノブレード内のsgRNAローディングを実際に改善する可能性がありますが、まだテストされていません。
標的細胞の形質導入は、この手順における重要なステップである。ほとんどの不死化細胞株において、ナノブレードによる形質導入は、細胞変性効果をほとんどまたは全く有さない。しかし、初代細胞では、毒性が問題になる可能性があります。したがって、形質導入は細胞タイプごとに最適化されなければならない。具体的には、ナノブレードへの曝露時間は、形質導入プロトコルを最適化する際に変更する重要な要素である。初代ニューロンや骨髄細胞などの敏感な細胞の場合、培地を交換する前にNanobladesで4〜6時間インキュベーションすることで、細胞毒性を最小限に抑えながらCas9タンパク質を効率的に送達できます。さらに、カチオン性ポリマーなどのアジュバントは、とりわけ、いくつかの細胞における形質導入の効率を有意に改善することができる( 材料表を参照のこと)。ナノブレードはVLPであり、免疫原性応答を誘導することができることに注意することが重要です。これは、マクロファージや樹状細胞などの特定のタイプの初代細胞で作業する場合、ナノブレードとのインキュベーションが遺伝子発現および細胞の表現型に重要な変化を誘導する場合、制限となり得る。マクロファージおよび樹状細胞が造血幹細胞前駆体(マウス骨髄細胞など)に由来する場合、ナノブレードに対する細胞応答を誘導することを避けるために、細胞が完全に分化する前にナノブレードで形質導入することが好ましい。さもなければ、Cas9タンパク質エレクトロポレーションは、分化した免疫細胞を扱う際に実行可能な代替手段を表すことができる。
ナノブレードは、インビボでマウス接合体または胚を形質導入してトランスジェニック動物を生成するために使用することができる。古典的なレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターと同様に、成体動物由来の組織に直接注射することもできる。しかしながら、ナノブレード(レトロウイルスおよびレンチウイルスベクターに類似)は、宿主動物の免疫応答によって不活性化され得る。したがって、注射する用量は、アプリケーションごとに最適化する必要があります。この免疫応答はまた、注射部位に近い組織への機能的VLPの分布を制限することができる。最後に、レンチウイルスベクターとは異なり、ナノブレードは導入遺伝子フリーであり、限られた時間枠でCas9を送達する。したがって、細胞の選択時にsgRNAのハイスループットシーケンシングを必要とするゲノムワイドな機能スクリーニングの実行には使用できません。ナノブレードは、迅速で用量依存的で、導入遺伝子を含まないゲノム編集が必要な場合に有用です20。さらに、タンパク質エレクトロポレーションと同様に、ナノブレードは、DNAトランスフェクションまたは古典的なウイルスベクターを介したCas9/sgRNAの長期発現よりもオフターゲット効果が少なくなります3。ナノブレードの将来の開発は、塩基編集やRNAターゲティングなどのさまざまな技術アプリケーション向けにCas9バリアントを組み込むことに焦点を当てています。

他のプログラム可能なヌクレアーゼと比較して、CRISPR-Casシステムは、真核細胞における配列特異的ゲノムターゲティングおよび切断の手順を劇的に簡素化し、民主化しました。sgRNAの単純な発現により、ユーザーはほぼすべての細胞遺伝子座に対してCas9タンパク質(または最適化されたバリアント)をプログラムできます1。このシナリオでは、Cas9タンパク質およびsgRNAの送達が、部位特異的変異誘発を行う際の主な制限となる。不死化細胞では、sgRNAおよびCasタンパク質をトランスフェクトプラスミドから容易に発現させ、ほとんどの細胞で効率的なゲノム標的化を達成することができる。しかし、Cas9/sgRNA複合体の構成的発現は、Cas9タンパク質のオフターゲット活性を増加させ、非特異的遺伝子座2に望ましくない変化をもたらす可能性がある。初代細胞では、DNAトランスフェクションを達成することは技術的に困難であり、発現不良またはトランスフェクトされた細胞のわずかな割合につながる可能性がある。古典的なDNAトランスフェクションに代わるものは、Cas9およびsgRNAをコードする導入遺伝子を送達するウイルスベクターの使用、または合成sgRNAに結合された組換えCas9タンパク質のエレクトロポレーションを含む。しかしながら、これらのアプローチは、細胞宿主ゲノム内での導入遺伝子組込み(古典的なレトロウイルスおよびレンチウイルス発現ベクターの場合と同様)、細胞因子による制限、およびCas9タンパク質およびsgRNAの構成的発現をもたらし得る。
Cas9/sgRNP 複合体のエレクトロポレーションは、これらの問題のほとんどを克服し、初代細胞およびインビボでの効率的かつ一過性の送達をもたらし、用量依存性応答を可能にすることができる。それにもかかわらず、それは通常高価な装置と試薬に依存しており、多数の細胞を処理する必要がある場合、高級化することも困難です。上記の技術の代替として、これらの著者らは、他のウイルス由来のカプシドタンパク質送達系と概念的に類似したCas9タンパク質およびsgRNA3用のレトロウイルス送達ベクターである「ナノブレード」を開発しました4,5,6,7,8。ナノブレードは、レトロウイルス由来のGagポリタンパク質の自然な能力を利用して、培養細胞で単独で発現すると、細胞外培地中に放出されるVLPを産生します9。Cas9タンパク質をマウス白血病ウイルス(MLV)Gagポリタンパク質のC末端末端に融合させ、sgRNAおよびウイルスエンベロープ糖タンパク質を共発現させることにより、Cas9タンパク質を放出されたVLPまたはナノブレード内に包埋することができる。精製時に、ナノブレードを標的細胞と共にインキュベートするか、インビボで注射して、Cas9/sgRNA RNP複合体の迅速、一過性、および用量依存的な送達を媒介することができます3。
ナノブレードは、複数のsgRNAでプログラムして異なる遺伝子座で同時に編集したり、Cas9バリアントを使用して標的特異的転写活性化や抑制などの他のアプリケーションを実行することができます3。組換え発現に依存するタンパク質エレクトロポレーションとは対照的に、文献から新たに記載されたCas変異体は、Gag融合発現ベクターに容易にクローニングすることができ、汎用性の高いプラットフォームとなる。ナノブレードをさらに複合化または一本鎖および二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド(ssODN)と装填して、相同性指向性修復を行うことができます3。ナノブレードの生産は比較的簡単で安価です。さらに、ナノブレードは、4°Cで何日間も保管することも、-80°Cで長期保管することもできます。通常、ナノブレードは、ほとんどの不死化および初代培養細胞において、効率的で導入遺伝子を含まないゲノム編集を媒介します。しかし、一部の初代細胞はウイルス粒子の存在に敏感である可能性があり、その結果、死亡率が増加する。自然免疫系の細胞はまた、ナノブレードの存在に反応し(ウイルス起源のため)、活性化され得る。このような場合、形質導入プロトコルを最適化して、ナノブレードへの曝露時間を制限し、非特異的な影響を最小限に抑える必要があります。ナノブレードは、他の利用可能なCRISPR送達方法に代わる実行可能で実装が容易な代替手段です。

<table><tbody><tr><td>13.2 mL、薄壁ポリプロピレンチューブ、14 x 89 mm - 50Pk</td><td>ベックマン・コールター ライフサイエンス</td><td></td><td>331372 ナノブレード精製用超遠心チューブ</td></tr><tr><td>アマシャム プロトラン プレミアム ウェスタンブロッティングメンブレン、ニトロセルロース</td><td>メルク</td><td>GE10600004</td><td>精製ナノブレード内のCas9レベルを定量化するためのニトロセルロースメンブレン</td></tr><tr><td>BIC-Gag-CAS9</td><td>Addgene</td><td>119942</td><td>GAG(F-MLV)-CAS9(sp)融合をエンコードします。過剰発現gRNAおよび適切なエンベロープと関連して、生産者細胞からのGAG-CAS9ウイルス様粒子の生成を可能にする</td></tr><tr><td>BICstim-Gag-dCAS9-VPR</td><td>Addgene</td><td>120922</td><td>標的転写活性化のためのGAG-dCAS9-VPR融合をコードする</td></tr><tr><td>BLADE</td><td>Addgene</td><td>134912</td> NanobladesシステムBsmBI-v2で使用される<td>sgRNA配列をクローニングするための空のバックボーン</td></tr><tr><td>BsmBI-v2</td><td>New England Biolabs</td><td>R0739S</td><td>Restriction enzyme to digest the BLADE and SUPERBLADES vectors for sgRNA cloning</td></tr><tr><td>Cas9 (7A9-3A3) Mouse mAb (HRP Conjugate) #97982</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>97982S</td><td>Anti-Cas9 antibody for Cas9 quantification by dot-blot</td></tr><tr><td>Cas9 Nuclease, S. pyogenes</td><td>New England Biolabs</td><td>M0386T</td><td>Recombinant Cas9 protein to be used as a reference for a absolute quantification of Cas9 loaded within Nanoblades</td></tr><tr><td>エチジウムブロマイド溶液 (10 mg/mL in H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510-10ML</td><td>アガロースゲルの染色とDNAの可視化用</td></tr><tr><td>Fisherbrand Wave Motion Shakers</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-028</td><td>遠心分離時にナノブレードを再懸濁する攪拌テーブル</td></tr><tr><td>gelAnalyzer</td><td></td><td></td><td>http://www.gelanalyzer.com; 消化後のバンド強度の定量化</td></tr><tr><td>Gesicle Producer 293T</td><td>Takara</td><td>632617</td><td>Nanoblades Producer 細胞株</td></tr><tr><td>Gibco DMEM, high glucose, pyruvate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>41966052</td><td>Gesicle Producer 293T cells</td></tr><tr><td>GoTaq G2 DNA ポリメラーゼ</td><td>Promega</td><td>M7848</td><td>Taq ポリメラーゼ T7 エンドヌクレアーゼアッセイ前のゲノム</td></tr> DNA の増幅用 <tr><td>jetPRIME DNAおよびDNA用トランスフェクション試薬キット/siRNA</td><td>Polyplus</td><td>POL114-15</td><td>Gesicle Producer 293T cells</td></tr><tr><td>Millex-AA, 0.80 & micro でのナノブレード生産用トランスフェクション試薬;m、シリンジ</td><td>フィルターMillipore</td><td>SLAA033SS</td> Nanoblades Millex-GS、0.22 &microの<td>濃縮前に細胞の破片を除去するためのシリンジフィルター</td></tr><tr><td>。m、シリンジ</td><td>フィルターMillipore</td><td>SLGS033SS</td><td>ショ糖クッション溶液を滅菌するためのシリンジフィルター</td></tr><tr><td>Millex-HP、0.45 & micro;m、ポリエーテルスルホン、シリンジフィルター</td><td>ミリポア</td><td>SLHP033RS</td><td>ナノブレード濃度の前に細胞の破片を除去するシリンジフィルター</td></tr><tr><td>モナークDNAゲル抽出キット</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>T1020L</td><td>DNAゲル抽出キット BsmBIによる消化時にpBLADESまたはpSUPERBLADESプラスミドフラグメントを精製するための</td></tr><tr><td>安定した有能な大腸菌 (高効率)</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>C3040I</td><td>プラスミドの形質転換と増幅のためのコンピテントバクテリア</td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra トランスフェクショングレードのプラスミドDNA用ミディキット</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410.50</td><td>培養細菌からのプラスミドDNA精製用マキシプレパレーションキット</td></tr><tr><td>Nucleospin gDNA抽出キット</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740952.50</td><td>形質導入細胞からのゲノムDNAの抽出</td></tr><tr><td>NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740588.50</td><td>培養細菌からのプラスミドDNA精製用ミニ調製キット</td></tr><tr><td>NucleoSpin Tissue, 細胞および組織からのDNA用ミニキット</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740952.5</td><td>ゲノムDNA抽出キット</td></tr><tr><td>Optima XE-90</td><td>ベックマン・コールター ライフサイエンス</td><td>A94471</td><td>超遠心分離機</td></tr><tr><td>pBaEVRless</td><td>Els Verhoeyen (Inserm U1111)</td><td></td><td>els.verhoyen@ens-lyon.frGirard-Gagnepain, A. et al. Baboon envelope pseudotyped LVs outperform VSV-G-LVs for gene transfer into early-cytokine-stimulated and resting HSCs. Blood 124, 1221&ndash;1231 (2014)</td></tr><tr><td>pBS-CMV-gagpol</td><td>Addgene</td><td>35614</td><td>Enocdes the Mouseine Leukemia Virus gag and pol genes</td></tr><tr><td>pCMV-VSV-G</td><td>Addgene</td><td>8454</td><td>Envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles</td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14200091</td><td>10X PBS to dilute in millipore water</td></tr><tr><td>Polybrene Transfection Reagent</td><td>Millipore Sigma</td><td>TR-1003-G</td><td>カチオン性ポリマーは、特定の哺乳類細胞におけるレトロウイルス形質導入の効率を高めます。また、オリゴデオキシヌクレオチド(ODN)のウイルス依存性エントリーを可能にし、相同性指向修復</td></tr><tr><td>ショ糖、分子生物学、&ge;99.5% (GC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389-5KG</td><td>スクロース 超遠心によるナノブレード精製のためのクッションを調製</td></tr><tr><td>SUPERBLADE5</td><td>Addgene</td><td>134913</td><td>ナノブレードシステムで使用されるsgRNA配列をクローニングするための空のバックボーン (Optimized for increased genome editing efficiency via Chen B et al., 2013)</td></tr><tr><td>SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34076</td><td>Cas9ドットブロット用強化化学発光(ECL) HRP基質</td></tr><tr><td>SW 41 Ti Swinging-Bucket ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td>ライフサイエンス 超遠心分離用331362ローター</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>S33102</td><td>アガロースゲルの染色とDNA</td></tr> T4 DNAリガーゼの可視化のための臭化エチジウムの代替品 <tr><td></td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>M0202S</td><td>DNAリガーゼは、sgRNA T7エンドヌクレアーゼIの可変領域に対応する二本鎖DNAオリゴでBLADEまたはSUPERBLADESベクターをライゲーション</td></tr>します <tr><td></td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0302S</td><td>T7エンドヌクレアーゼIは、完全に一致しないDNAを認識して切断します。特定の遺伝子座でのゲノム編集の程度を監視することができます</td></tr><tr><td>Triton含有溶解バッファー</td><td>Promega</td><td>E291A</td><td>Nanobladeを破壊し、Cas9定量を可能にする溶解バッファー</td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td>TBSTの調製用</td></tr></tbody></table>

ウイルス様粒子(「ナノブレード」)を介した不死化細胞および初代細胞におけるcas9/sgrnaリボヌクレオタンパク質複合体の送達

Delivery of the Cas9/sgRNA Ribonucleoprotein Complex in Immortalized and Primary Cells via Virus-like Particles ("Nanoblades")

クラスター化された規則的に間隔をあけた短い回文反復(CRISPR)-Casシステムは、真核細胞におけるゲノム編集を民主化し、数多くの革新的なアプリケーションの開発につながった。しかしながら、Cas9タンパク質およびシングルガイドRNA(sgRNA)の標的細胞への送達は、技術的に困難な場合がある。レンチウイルス(LV)またはアデノ随伴ウイルス(AAV)に由来するものなどの古典的なウイルスベクターは、Cas9タンパク質およびその関連sgRNAをコードする導入遺伝子を多くの初代細胞およびインビボで効率的に送達することを可能にする。それにもかかわらず、これらのベクターは、標的細胞ゲノムにおける導入遺伝子の組み込み、限られた貨物容量、および標的細胞におけるCas9タンパク質およびガイドRNAの長期発現などの欠点に苦しむ可能性がある。
これらの問題のいくつかを克服するために、マウス白血病ウイルス(MLV)に基づく送達ベクターが開発され、コード導入遺伝子の非存在下でCas9タンパク質およびそれに関連するガイドRNAをパッケージ化した。MLV由来の構造タンパク質GagのC末端にCas9タンパク質を融合させることにより、Cas9タンパク質とsgRNA(ナノブレードと命名)をロードしたウイルス様粒子(VLP)が形成された。ナノブレードは、産生細胞の培養培地から収集し、精製、定量し、標的細胞を形質導入し、活性Cas9/sgRNA複合体を送達するために使用することができる。ナノブレードは、リボヌクレオタンパク質(RNP)の貨物を広範囲の初代および不死化細胞に一過性かつ迅速に送達し、修飾Cas9タンパク質を使用して、標的遺伝子の一過性転写活性化などの他の用途向けにプログラムすることができます。ナノブレードは、注射された成体マウスの肝臓および卵母細胞においてインビボゲノム編集が可能であり、トランスジェニック動物を生成することができる。最後に、ドナーDNAと複合化して、「トランスフェクションフリー」相同性指向修復を行うことができます。ナノブレード調製は、簡単で、比較的低コストであり、そして任意の細胞生物学実験室で容易に実施することができる。

ナノブレード調製のプロトコルは非常に簡単で、組織培養フード、CO2インキュベーター、スイングバケット遠心分離機または超遠心分離機へのアクセスに加えて、簡単な実験装置が必要です。しかしながら、いくつかのステップは、産生細胞の供給源および取り扱い、ならびに形質導入条件など、特に注意を必要とする。図 1A に示すように、細胞をプレート内に均質に分布させ、トランスフェクション当日に約 70 ~ 80% の合流点に達するように細胞をシードすることが重要です (細胞の凝集塊は避けてください)。トランスフェクションの24時間後(図1B、C)、産生細胞は合胞体を形成し、複数の核を持つより大きなサイズの細胞につながります。トランスフェクションの40時間後(図1D)、プレート内のほとんどの細胞はシンシチアを形成し、プレートから剥離し始めます。
これは完全に正常であり、隣接する細胞間の融合を誘導するエンベロープ糖タンパク質の発現によって引き起こされる。遠心分離による濃縮(または生産者細胞の上清からの直接)により、ナノブレード内に装填されたCas9の量は、組換えCas9を基準として使用してニトロセルロース膜上のドットブロットによって絶対的に定量することができる(図2)。このステップは、標的細胞の形質導入に使用するナノブレードの正しい量を決定するために重要です。ドットブロットアッセイを行う場合、標準曲線の直線範囲内にある読み取り値のみを考慮することが重要です。しかし、ナノブレード内に存在するCas9の量とは無関係に、T7エンドヌクレアーゼアッセイ(図3)またはサンガーシーケンシングを使用して、標的細胞上で直接ゲノム編集の効率をテストすることが不可欠です。
図3に示すように、ナノブレードの効率はバッチごとに異なる可能性がありますが、通常はCas9の量と相関しています。図 3 に示す例では、レーン 1 からのバッチは全体の編集効率が 20% になり、レーン 3 からのバッチは 60% の効率になります。この場合、バッチ1から使用されるナノブレードの体積を増やして、バッチ3からの編集と同様の編集効率を達成することができる。図4は、異なるタイプの初代細胞においてナノブレードを用いて得られた最大編集効率を示す。効率は、使用されるsgRNAの配列および標的のアクセシビリティに応じて変化し得ることに注意することが重要です。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62245/62245fig01.jpg"> 図1:ナノブレード生産中の産生細胞の形態 。 (A)めっき後24時間で70〜80%コンフルエントでのHEK293T細胞。(B および C)トランスフェクション後24時間後のHEK293T細胞形態。(d)トランスフェクション後40時間後のHEK293T細胞形態。スケール バー = 400 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62245/62245fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62245/62245fig02.jpg"> (A)組換えCas9または100倍濃縮(超遠心分離による)ナノブレードサンプル(#1、#2、および#3)は、2倍順次希釈され、抗Cas9 HRP結合抗体とインキュベートされる前にニトロセルロース膜上にスポットされる。シグナルは、増強された化学発光によって明らかにされる。(b)化学発光シグナルを取得し、ニトロセルロース膜上にスポットした既知量のCas9に対してプロットした組換えCas9希釈物およびシグナル強度について定量化する。回帰曲線は、線形範囲内にある希釈(青い十字を参照)について、線形範囲外にあるすべての濃度(赤い十字を参照)を除いて計算されます。(c)各ナノブレード調製物におけるCas9濃度(nM)は、(B)で得られた線形回帰から式を用いて外挿した。このためには、回帰曲線の線形範囲内にあるナノブレード希釈からの定量化された信号のみを使用することが重要です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62245/62245fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62245/62245fig03.jpg"> 図3:形質導入時の編集効率のモニタリング。 (A)ナノブレード処理細胞における切断効率を測定するT7エンドヌクレアーゼアッセイ。 EMX1 遺伝子を標的とするナノブレードで形質導入された細胞を、T7エンドヌクレアーゼアッセイによって分析した。レーン1:ナノブレード調製バッチ#1(20%の切断効率);レーン2:コントロールセル;レーン3:ナノブレード調製バッチ#2(60%の切断効率)。(B) DDX3 オープンリーディングフレーム内のフラグタグシーケンスのノックイン。 DDX3 遺伝子座を標的とするsgRNAでプログラムされた濃縮ナノブレードを、異なるHEK293Tクローン(#1、#2)から作製し、Flag-DDX3 ssODNテンプレートの用量の増加と、HEK293T標的細胞の形質導入に使用される得られた複合体とを複合化した。形質導入時に、細胞を3日間増殖させてから、それらを収集してゲノムDNAおよび総タンパク質を抽出した。Flag-DDX3タンパク質を抗Flagアガロースビーズを用いて免疫沈降させ、続いて抗Flag抗体を用いて回収したタンパク質のウェスタンブロット解析を行った(トップパネル)。 Ddx3 遺伝子座におけるFlagタグの部位特異的挿入も、挿入部位に隣接するプライマー(中央パネル)、またはFlagタグ配列を認識するフォワードプライマーおよびFlag挿入部位の下流の Ddx3 遺伝子座に特異的なリバースプライマー(下部パネル)を用いたPCRによってアッセイされた。略語: EMX1 = 空のスパイラクルホメオボックス 1;DDX3 = デッドボックスRNAヘリカーゼ3;PCR = ポリメラーゼ連鎖反応;ODN = オリゴデオキシヌクレオチド;ssODN = 独り立ち ODN;sgRNA = シングルガイドRNA;IP = 免疫沈降。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62245/62245fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62245/62245fig04.jpg"> 図4:ナノブレードを使用して、異なる一次細胞タイプで達成された編集効率。 略語:PBL =末梢血リンパ球;IL = インターロイキン;CD = 分化のクラスター;iPSC = 人工多能性幹細胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62245/62245fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

我々は、Cas9/シングルガイドRNA(sgRNA)リボヌクレオタンパク質複合体をウイルス様粒子内にロードするためのシンプルで安価なプロトコルを開発しました。「ナノブレード」と呼ばれるこれらの粒子は、不死化および初代細胞ならびにインビボでCas9/sgRNA複合体の効率的な送達を可能にする。

ウイルス様粒子(「ナノブレード」)を介した不死化細胞および初代細胞におけるCas9/sgRNAリボヌクレオタンパク質複合体の送達

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas system has democratized genome-editing in eukaryotic cells and led to the ...

ナノブレードは、不死化細胞および初代細胞の両方において、および抗導入遺伝子の非存在下で、Cas9およびガイドRNA複合体の迅速、効率的、かつ用量依存的な送達を可能にした。この方法の主な利点は、ナノブレードが調製が容易で比較的安価であることです。それらは、Cas9を送達し、RNA複合体を用量依存的かつ一過性の方法で誘導することができ、したがって、効率的なゲノム編集を可能にしながら、オフターゲット効果を制限することができる。ナノブレードの準備プロトコルは非常に簡単です。しかし、産生細胞の品質、ならびにそれらの起源およびトランスフェクション前の播種は、ウイルス様粒子を高収率で得るために不可欠である。手順を実演するのは、私の研究室のエンジニアであるLaura Guiguettazです。初日に、10センチメートルの細胞培養皿に10ミリリットルの改変DMEMおよびペニシリンストレプトマイシンに350万〜400万個のHEK 293T細胞を播種する。24時間後、細胞が70%コンフルエントに達したら、培地を新鮮なDMEMと交換し、P-1000ピペットを使用してトランスフェクション試薬溶液を滴下して加える。4日目にナノブレードの採取を開始するには、培養液上清を10ミリリットルのピペットで回収します。この段階で培養液の色が黄色に変わるのは正常です。回収した上清を500Gで5分間遠心分離して細胞破片を除去し、細胞ペレットを乱すことなく9ミリリットルの上清を回収した。ナノブレードを209、490Gの超遠心分離機で摂氏4度で75分間ペレット化する。遠心分離後、培地をゆっくりと吸引し、白色ペレットを100マイクロリットルの冷たいPBSで再懸濁する。チューブをパラフィルムで覆い、穏やかな攪拌で摂氏4度で1時間インキュベートする。その後、ペレットを上下にピペッティングして再度懸濁させる。PBS中の10%スクロース溶液を調製し、0.2マイクロメートルのシリンジフィルターでろ過する。2.5ミリリットルの10%スクロースを超遠心管に入れます。チューブを傾け、チューブを徐々に垂直位置まで持ち上げながら、低速ピペットで9ミリリットルのVLP含有サンプルをゆっくりと加えます。チューブをローターバケットに入れ、サンプルを209、490 Gで摂氏4度で90分間遠心分離します。遠心分離後、上清を慎重に取り出し、チューブをティッシュペーパーの上に逆さまに置き、残りの液体を除去した。教訓的な目的とウイルスペレットのより良い視覚化のために、蛍光タンパク質mCherryをロードしたナノブレードを調製することができる。1分後、100マイクロリットルのPBSを加える。パラフィルムカバー付きのチューブを攪拌テーブル上のチューブホルダーに摂氏4度で1時間置き、ペレットを上下にピペッティングして再懸濁します。4倍量のPBSに非イオン性界面活性剤を含む溶解緩衝液を1倍量加えて希釈緩衝液を調製する。2マイクロリットルの濃縮ナノブレードを50マイクロリットルの希釈緩衝液で希釈し、ボルテックスで短時間希釈する。25マイクロリットルの混合物を25マイクロリットルの希釈緩衝液を含む新しいチューブに移し、ナノブレード希釈の6本のチューブを有するように手順を繰り返す。50マイクロリットルの希釈バッファーに2マイクロリットルの組換えCas9ヌクレアーゼを加え、それを短時間ボルテックスし、8つの段階希釈を行うことによって、標準対照を作る。各VLP希釈液の2.5マイクロリットル、および各標準液の2.5マイクロリットルをマルチチャンネルピペットでニトロセルロース膜上に注意深くスポットします。粒子が吸収されたら、TBSTに5%の脱脂粉乳を室温で45分間補充して膜をブロックします。TBSTを廃棄し、Cas9西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体と共に膜を摂氏4度で一晩インキュベートする。TBSTでメンブレンを3回洗浄し、強化された化学発光基質キットを使用してシグナルを視覚化します。ナノブレードによる標的細胞の形質導入のために、細胞培養培地を精製ナノブレードを含む500マイクロリットルの培地と交換する。細胞インキュベーションの4〜6時間後、培地を通常の量の新鮮な培地に交換する。プロトコールでは、トランスフェクションの日に細胞を70〜80%のコンフルエントで均質な分布のために播種し、24時間後に複数の核を有するより大きな細胞につながる合胞体を形成した。トランスフェクションの40時間後、ほとんどの細胞がシンシチアを形成し、プレートから剥離し始めた。ナノブレード内に装填されたCas9の量をニトロセルロース膜上のドットブロットを用いて定量し、これは、参照組換えCas9と比較して増強された化学発光を示した。既知量のCas9に対する組換えCas9希釈物についての定量化された化学発光シグナルについて検量線をプロットした。次に、各ナノブレード調製物中のCas9タンパク質濃度をマッピングし、バッチごとに異なる濃度のCas9を明らかにした。T7エンドヌクレアーゼアッセイは、ナノブレードの効率がバッチごとに異なる可能性があることを実証した。たとえば、1つのバッチは全体的な編集効率が20%で、もう1つのバッチは60%の効率を示すことが観察されました。Flag−DDX3タンパク質を抗フラグアガロースビーズを用いて免疫沈降させ、続いて抗フラグ抗体を用いて回収したタンパク質のウェスタンブロット分析を行った。DDX3遺伝子座におけるフラグタグの部位特異的挿入も、挿入部位に隣接するプライマー、またはフラグ挿入部位の下流のDDX3遺伝子座に特異的なフォワードプライマーおよびリバースプライマーのいずれかを用いたPCRによってアッセイされた。細胞を正しい合流点に置き、細胞の均一な分布を得ることが重要です。ナノブレード遠心分離に際し、ペレットを再懸濁し、濃縮ウイルス粒子の均質なサンプルを得ることも重要である。ナノブレードにより、科学者はCas9を送達し、RNA複合体を特定のゲノム遺伝子座に迅速かつ協調的に導くことによって、二本鎖DNA切断修復のメカニズムを研究することができました。彼らはまた、自然免疫系の初代細胞で長いノンコーディングRNAを不活性化し、その役割を研究することを可能にしました。

delivery-cas9sgrna-ribonucleoprotein-complex-immortalized-primary

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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Generation of Recombinant Viral Particles Using Embryonic Kidney Cells

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