交互の粘性慣性力噴射による インビトロ ヒドロゲルマイクロキャリアの3D印刷

当社は、良好な制御性と生体適合性を有するマイクロキャリアを調製するための穏やかなバイオプリントプロセスを提供します。細胞による封入後、担体は、インビトロでの細胞増殖および機能的な微小組織構築において使用することもできる。同様の条件下での厳しい力ではなく、限られた変位が印刷プロセス中にノズルに作用し、バイオインクの元の物理的/化学的特性を最大限に維持します。

従来のマイクロキャリアに加えて、内部細胞分布またはトリトシン内包カプセル構造を有するユニットを構築し、異なる組織構造の集合に適用することができる。ノズルの準備のために、製造元の指示に従ってガラスマイクロピペットをプーラーにロードし、プーラーの引っ張りパラメータを設定します。マイクロフォージを使用してノズルを指定直径で切断し、実験用の特定の先端直径を求め、ノズルをアルコールで5分間滅菌します。

その後、ノズルを滅菌水で3回すすぎ、残留アルコールを除去した。ヒドロゲルバイオインクを調製するために、滅菌した4%アルギン酸ナトリウム原液を0.9%塩化ナトリウムで0.5、1、1.5、および2%体積重量比濃度で希釈する。微小液滴形成のために、5ミリリットルのバイオインクを使い捨ての滅菌シリンジにロードし、シリンジをシリンジポンプに取り付ける。

内径1mmのホースを使用して、シリンジと印刷ノズルを接続します。クランプネジを締めてノズルを所定の位置に固定し、シリンジポンプを素早く押し下げてバイオインクをノズルにロードします。信号発生器のパラメータを設定し、必要に応じてドロップするように振動のモーションパスとトリガモードをプリセットします。

次に、事前に設計されたパターンに従って液滴を印刷します。マイクロキャリア形成のために、5ミリリットルの架橋溶液をシャーレに加え、ディッシュを基材としての印刷ノズルの下に置く。印刷後、マイクロキャリア懸濁液を遠沈管に移す前に、マイクロキャリアを3分間架橋する。

次いで、遠心分離によってマイクロキャリアを濃縮し、1ミリリットル当たり約600マイクロキャリアで適切な培養培地に再懸濁する。接種前に、A549 細胞培養の上清を、10 マイクロモルのセルトラッカー緑色 CMFDA 色素を添加した 5 ミリリットルの無血清培地と交換し、細胞培養インキュベーターで 30 分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、色素溶液を新鮮な培地と交換し、培地1ミリリットルあたり6個の細胞に対して10倍の1.6倍の密度で細胞を再懸濁する。

細胞に1ミリリットルのマイクロキャリア懸濁液を加え、低接着性6ウェル培養プレートの各ウェルに1ミリリットルのA549細胞を加える。プレートを細胞培養インキュベーター内のシェーカー上に毎分30回転で置く。インキュベーションの最後に、プレートをシェーカーから取り出し、マイクロキャリアを30分間沈降させてから、印刷ノズル、ペトリ皿、およびマイクロキャリア接種細胞を明視野および共焦点蛍光顕微鏡で観察および測定します。

30マイクロメートルの先端ノズルを使用して、PBS、1.5%アルギン酸塩、1.5%ゼラチンを含む複数種類のバイオインクをペトリ皿に安定して印刷することができます。インクの粘度が上昇するにつれて、印刷プロセスはますます困難になり、より大きな液滴を得るためにより大きな駆動力が必要となる。印刷パラメータは、この印刷実験で観察されるように、液滴を特定の2D配置で印刷するために設定することができる。

ノズル先端の直径は、印刷可能なマイクロキャリアのサイズに直接影響する。これらの明視野および共焦点画像で観察されるように、A549細胞は培養の2日後にアルギン酸コラーゲンマイクロキャリアに接着する。6日後、A549セルはマイクロキャリア表面をほぼ完全に覆います。

この手順に従って、マイクロキャリア表面をキトサンで被覆し、グルコン酸塩を用いてアルギン酸ゲルを溶解させ、肺胞などの中空構造の構築に適用できる嚢胞構造を形成した。マイクロキャリアを調製するための印刷プロセスは非常に穏やかであり、したがって、この方法は、細胞含有マイクロキャリアの印刷に広く使用することができる。