Name: 中枢神経系転移の患者由来異種移植モデルの確立と利用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: 学ぶ 中枢神経系転移の患者由来異種移植モデル確立法。皮下、脳内、心腔内の3つの移植法を用いて、転移カスケードの異なる側面を研究できます。これらのモデルは従来の細胞株モデルよりも人間の腫瘍を正確に再現し、前臨床研究に有用です。

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図3Aは、前回の出版物12 から取られ、メイヨークリニックのJann Sarkaria博士の研究室で生成されました。

以下は、皮下側面移植によるPDXモデルの確立と、生物学的変化と転移カスケードのさまざまなステップの評価に役立つ治療のテストを可能にする前臨床試験の設定の両方に使用される一連の段階的なプロトコルです。すべての研究およびモデルは、3〜8週齢の雌NOGマウスを使用した。すべての組織サンプルは、治験審査委員会(IRB)によって承認されたプロトコルに従って、インフォームドコンセントの下で収集されました。すべての動物実験は、施設動物管理使用委員会(IACUC)が承認したプロトコルに従って実施されました。
1. 側面移植によるPDXモデルの構築と伝播
<ol><li>PDXモデルの確立<ol><li>手術室で患者から腫瘍を外科的切除した後、新鮮な腫瘍組織を適切な溶液(DMEMなど)に保管し、すぐに氷上に置きます。過剰の保存溶液(>10 mL)を使用して、組織が完全に水没していることを確認します。.</li>
		<li>組織を組織培養皿に移し、5 mL DPBSですすいでください。 注:このステップは、無菌技術を使用してバイオセーフティキャビネットで実行する必要があります。可能性のあるヒト感染性病原体から保護するために、適切な個人用保護具(PPE)を着用して予防措置を講じる必要があります。</li>
		<li>腫瘍から壊死領域を取り除きます。 注:これは、組織の中心に向かって白いどろどろした領域として認識できます。</li>
		<li>残りの組織を約2 x 2 x 2 mmの小片に切ります。</li>
		<li>組織を成長因子還元基底膜マトリックスを含むマイクロ遠心チューブに移し、氷上に保存します。各組織片を完全に沈めるために、十分な基底膜マトリックス(>200 μL)が使用されていることを確認してください。</li>
		<li>ステップ1.3に記載されているプロトコルに従って移植されない残りの組織を凍結保存します。</li>
		<li>2〜5%のイソフルランと酸素を含む誘導チャンバーで動物を麻酔します。麻酔をかけたら、動物をノーズコーンに移し、継続的な酸素供給で麻酔を1.5〜2.5%イソフルランに維持します。ペダル反射の欠如によって麻酔の深さを確認します。手術中の目の乾燥を防ぐために、獣医用眼科用軟膏を塗布します。動物が回復するまで、手順全体を通して動物に熱サポートを提供します。</li>
		<li>マウスの移植部位を特定します。 注:これはマウスの右側または左脇腹にあり、通常は腹部の側面に横方向にマークされ、胸郭の尾側にある必要があります。</li>
		<li>手術領域を準備するには、毛皮を剃り、ポビドンヨードと70%エタノールの3つの交互のスクラブで消毒します。</li>
		<li>鉗子を使用して、マウスの皮膚を持ち上げ、皮膚を0.5〜1 cm切開します。</li>
		<li>切開部位の皮膚下に手術用ハサミをゆっくりと挿入し、皮下空間にポケット(深さ0.5〜1cm)を作ります。</li>
		<li>腫瘍片を慎重にポケットに入れ、腫瘍が滑り落ちないようにポケットの底に押し込みます。</li>
		<li>4-0ナイロン外科用縫合糸を使用して切開を閉じます。 注:非吸収性または吸収性の縫合糸や創傷クリップなどの他の創傷閉鎖方法も使用できます。</li>
		<li>マウスをケージに戻し、歩行可能になるまで動物の麻酔からの回復を監視します。 注:鎮痛薬は必要ありませんが、マウスに痛みが観察された場合は投与できます。</li>
		<li>毎週腫瘍の成長を監視します。マウス1匹につき1つの腫瘍が予想されます。 注:移植時の腫瘍の体積は最初は減少しているように見えますが、これは心配する必要はありません。腫瘍は、触知可能になり、対数成長期に入ると、腫瘍が採取されたと見なされます。この最初のパッセージは、F0 世代を表します。</li>
		<li>腫瘍が成長し始めたら、週に3回腫瘍を測定します。ノギスで腫瘍の長さと幅を測定します。腫瘍の体積を計算するには、長さx幅x幅/ 2の式を使用します。</li>
		<li>腫瘍の直径が15 mmを超える場合は、腫瘍の最長辺を使用してPDX腫瘍を移植したマウスを安楽死させます。CO2誘導室でCO2吸入による安楽死を行い、続いて二次的な方法として頸部脱臼を行う。</li>
		<li>切開することによって動物の脇腹から腫瘍を切除する。切除した腫瘍を鈍いハサミと鉗子でやさしく解剖します。これを行うには、まず腫瘍の上の皮膚を切り取り、次に腫瘍をその下の筋肉層から切り取ります。</li>
		<li>腫瘍組織を>10 mLの適切な保存溶液(DMEMなど)に移します。すぐに氷の上に置きます。この腫瘍は、凍結保存するか、別のマウスセットに継代することができます。この箇所をF1と考えてください。 注:再度継代すると、腫瘍の通過がF2などになります。</li>
	</ol></li>
	<li>PDXモデルの伝播<ol><li>切除した腫瘍をステップ1.1.19の保存溶液に保持することから始めます。</li>
		<li>組織を組織培養皿に移し、5 mL DPBSですすいでください。</li>
		<li>腫瘍から壊死領域を取り除きます。</li>
		<li>ティッシュを約2 x 2 x 2 mmの小片に切ります。</li>
		<li>組織を成長因子低減基底膜マトリックス(>200 μL)を含むマイクロ遠心チューブに移し、氷上に保管します。</li>
		<li>増殖に使用されない残りの組織を、ステップ1.3に記載のプロトコルに従って凍結保存します。</li>
		<li>2〜5%のイソフルランと酸素を含む誘導チャンバーで動物を麻酔します。麻酔をかけたら、動物をノーズコーンに移し、継続的な酸素供給で麻酔を1.5〜2.5%イソフルランに維持します。ペダル反射の欠如によって麻酔の深さを確認します。手術中の目の乾燥を防ぐために、獣医用眼科用軟膏を塗布します。動物が回復するまで、手順全体を通して動物に熱サポートを提供します。</li>
		<li>マウスの移植部位を特定します。 注:これは、マウスの右側または左脇腹、通常は腹部、胸郭の尾側にある必要があります。</li>
		<li>手術領域を準備するには、毛皮を剃り、ポビドンヨードと70%エタノールの3つの交互のスクラブで消毒します。</li>
		<li>マウスの片側を0.5〜1 cm切開します。</li>
		<li>切開部の皮膚の下に手術用ハサミをゆっくりと挿入し、皮下空間にポケット(深さ0.5〜1 cm)を作成します。</li>
		<li>腫瘍片を慎重にポケットに入れ、ポケットの底に押し込んで、腫瘍が滑り落ちないようにします。</li>
		<li>4-0ナイロン外科用縫合糸または他の創傷閉鎖方法を使用して切開を閉じます。</li>
		<li>マウスをケージに戻し、歩行可能になるまで麻酔からの回復を監視します。 注:鎮痛薬は必要ありませんが、マウスに痛みが観察された場合は投与できます。</li>
		<li>潜伏期(非増殖期)の間、腫瘍の成長を毎週監視する。マウス1匹につき1つの腫瘍が予想されます。 注:移植時の腫瘍の体積は最初は減少しているように見えますが、これは心配する必要はありません。腫瘍は、触知可能になり、継続的に成長し始めると、腫瘍が採取されたと見なされます。</li>
		<li>腫瘍が成長し始めたら、週に3回腫瘍を測定します。ノギスで腫瘍の長さと幅を測定します。式を使用して腫瘍の体積を計算します:長さx幅x幅/ 2。</li>
		<li>腫瘍の直径が15 mmを超える場合は、腫瘍の最長辺を使用してPDX腫瘍を移植したマウスを安楽死させます。CO2誘導室でCO2吸入による安楽死を行い、続いて二次的な方法として頸部脱臼を行います。</li>
		<li>動物の脇腹から腫瘍を切除し、切開を行い、鈍いハサミと鉗子で腫瘍を穏やかに解剖します。</li>
		<li>腫瘍組織を>10 mLの適切な保存溶液(DMEMなど)に移し、すぐに氷上に置きます。</li>
	</ol></li>
	<li>PDX腫瘍の凍結保存<ol><li>腫瘍の直径が15 mmを超える場合は、腫瘍の最長辺を使用してPDX腫瘍を移植したマウスを安楽死させます。CO2誘導室でCO2吸入による安楽死を行い、続いて二次的な方法として頸部脱臼を行う。</li>
		<li>動物の脇腹から腫瘍を切除し、切開を行い、鈍いハサミと鉗子で腫瘍を穏やかに解剖します。</li>
		<li>腫瘍組織を>10 mLの適切な保存溶液(DMEMなど)に移し、すぐに氷上に置きます。</li>
		<li>組織を組織培養皿に移し、5 mL DPBSですすいでください。</li>
		<li>腫瘍から壊死領域を取り除きます。</li>
		<li>ティッシュを約2 x 2 x 2 mmの小片に切ります。</li>
		<li>組織を20%のDMEM、70%のFBS、および10%のDMSOを含むクライオチューブに移します。</li>
		<li>クライオチューブを凍結保存容器に移し、-80°Cの冷凍庫に入れます。</li>
		<li>クライオチューブを-80°Cに冷却したら、液体窒素貯蔵庫に移します。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 前臨床試験の接種経路
<ol><li>皮下側面移植。 注:皮下側面移植は、簡単に使用でき、転移カスケードのすべてのステップを研究するのに役立ちます。<ol><li>最初の側面移植には、成長中のPDX腫瘍または凍結保存されたPDX腫瘍を使用します。</li>
		<li>PDX腫瘍を増殖させるには、腫瘍の長さが15 mmを超える場合は、IACUC承認の方法を使用してマウスを安楽死させます。腫瘍を切除し、腫瘍組織を適切な保存溶液(DMEMなど)に移し、直ちに氷上に置きます。</li>
		<li>凍結保存されたPDX腫瘍の場合、凍結保存されたPDX組織を37°Cの水浴に浸漬して迅速に解凍する。</li>
		<li>手順 1.2.2-1.2.19 に従います。</li>
	</ol></li>
	<li>脳内注射による同所性移植。 注:このモデルは、BBBを通過する薬の有効性をテストし、腫瘍のコロニー形成を研究するために使用できます。このセクションでは、主に腫瘍解離キットの使用について言及しています( 材料表).組織の種類が異なれば、必要な解離プロトコルも異なります。解離効率を最大化するために、ユーザーがプロトコルをテストして最適化することをお勧めします。<ol><li>腫瘍の長さが15 mmを超える場合は、IACUC承認の方法を使用してPDX腫瘍を移植したマウスを安楽死させます。</li>
		<li>バイオセーフティキャビネット内の無菌条件下で、PDX腫瘍を外科的に切除し、氷上のDMEMに保管します。</li>
		<li>製造元のプロトコルで示されているように、酵素ミックスをDMEMに追加することにより、適切なチューブで解離溶液を調製します。</li>
		<li>組織培養皿で5 mL DPBSで腫瘍を洗浄します。</li>
		<li>腫瘍から壊死領域を取り除きます。</li>
		<li>腫瘍を長さ2〜4 mmの小片に切ります。</li>
		<li>腫瘍片を酵素ミックスを含むチューブに移します。</li>
		<li>チューブを組織解離器に取り付け、組織の種類に適したプログラムを実行します。実行する適切なプログラムと必要な解離時間については、製造元のプロトコルを参照してください。</li>
		<li>プログラムが完了したら、70 μmの細胞ストレーナーを通して細胞を濾します。</li>
		<li>セルストレーナーを20 mLのDMEMで洗浄します。</li>
		<li>解離した細胞を300 x g で7分間遠心分離します。</li>
		<li>上清を吸引し、細胞をDPBSに再懸濁します。</li>
		<li>細胞を数え、必要な濃度に希釈します。</li>
		<li>製造元の指示に従って固定装置用フレームをセットアップし、マウス用の加熱パッドを準備します。70%エタノールですべての領域を消毒します。</li>
		<li>2〜5%のイソフルランと酸素を含む誘導チャンバーで動物を麻酔します。麻酔をかけたら、動物をノーズコーンに移し、継続的な酸素供給で麻酔を1.5〜2.5%イソフルランに維持します。ペダル反射の欠如によって麻酔の深さを確認します。手術中の目の乾燥を防ぐために、獣医用眼科用軟膏を塗布します。動物が回復するまで、手順全体を通して動物に熱サポートを提供します。</li>
		<li>頭皮を露出させるためにマウスの頭の毛皮を剃って手術領域を準備します。</li>
		<li>皮下注射で投与される1 mg / kgのブプレノルフィン徐放性(SR)の1回の投与など、適切な鎮痛薬をマウスに提供します。.</li>
		<li>マウスを脳定位固定装置フレームに移します。マウスがバイトブロックを噛んでいることを確認します。イヤーバーを使用して、マウスの頭をしっかりと固定します。 注意: 鉗子で軽く押しても頭が動かない場合は、マウスを適切に固定します。</li>
		<li>ポビドンヨードと70%エタノールの3つの交互のスクラブで剃った部分を消毒します。</li>
		<li>頭皮を5〜7 mm縦切開して頭蓋骨を露出させ、頭皮を引っ込めます。</li>
		<li>鉗子などの鈍い手術器具で骨膜をこすり落とします。</li>
		<li>頭蓋骨のブレグマを見つけます。</li>
		<li>定位フレームの針をブレグマの上に置き、座標を0にリセットするか、アームの座標をメモします。</li>
		<li>腕を正中線の右に1 mm後方(尾側)および1 mm横方向に動かします。</li>
		<li>この場所を永久マーカーでマークします。アームにシリンジ用のスロットが含まれている場合は、シリンジスロットにマーカーを取り付けて位置をマークします。</li>
		<li>この場所で頭蓋骨に小さなバリ穴を開けます。脳への穴あけを防ぐために、過度の圧力をかけないでください。</li>
		<li>5 μL、26 Gのハミルトンシリンジに5-10 x 104 セルを1-2 μLの容量でロードし、脳定位固定装置アームに取り付けます。</li>
		<li>ハミルトンシリンジ針を2mm脳にゆっくりと挿入します。</li>
		<li>希望の速度(通常0.2〜0.5 μL / min)で細胞の注入を開始します。</li>
		<li>注射が完了したら、ゆっくりと針を脳から引っ込めます。</li>
		<li>バリ穴を骨ワックスで埋めます。</li>
		<li>外科用縫合糸または外科用接着剤で切開部を閉じます。</li>
		<li>マウスをケージに戻し、麻酔からの回復を監視します。</li>
		<li>動物の状態を定期的に監視し、承認されたプロトコルで人道的エンドポイント基準に達したときに安楽死させます。 注:脳内の腫瘍増殖が成功すると、動物の状態が悪化し、頭の傾き、髪のコートが荒れ、体が丸くなり、目を細め、活動が低下し、体の状態スコアが低下することがよくあります(BCS < 2)。</li>
		<li>安楽死させた動物の剖検を行い、続いて組織学的分析を行って脳内の腫瘍の存在を確認します。着床から安楽死までの時間を記録します。</li>
	</ol></li>
	<li>心臓内注射によるPDXモデルの移植 注:このモデルは、腫瘍細胞が循環した後の臓器向性を研究するために使用できます。このセクションでは、腫瘍解離キットも使用しており、組織タイプによる最適化が必要です。<ol><li>手順 2.2.1-2.2.13 に従います。</li>
		<li>2〜5%のイソフルランと酸素を含む誘導チャンバーで動物を麻酔します。麻酔をかけたら、動物をノーズコーンに移し、継続的な酸素供給で麻酔を1.5〜2.5%イソフルランに維持します。ペダル反射の欠如によって麻酔の深さを確認します。手術中の目の乾燥を防ぐために、獣医用眼科用軟膏を塗布します。動物が回復するまで、手順全体を通して動物に熱サポートを提供します。</li>
		<li>次に、マウスを仰臥位に置きます。</li>
		<li>胸部の手術領域を準備するには、毛皮を剃り、ポビドンヨードと70%エタノールの3つの交互のスクラブで消毒します。</li>
		<li>0.5-10 x 105 細胞を28 G針のシリンジに最大100 μLの容量まで引き込みます。 注:必要なセルの数はモデルの攻撃性によって異なり、最適なセル数はモデルごとに経験的に決定する必要があります。</li>
		<li>注射部位(マウスの胸骨のわずかに左、胸骨ノッチと剣状突起の中間)を見つけます。</li>
		<li>注射部位のマウスに針を垂直に挿入します。</li>
		<li>注射器に入る血液の逆流を通して左心室への正常な侵入を観察してください。針を動かさずに細胞をゆっくりと左心室に分配します。</li>
		<li>針をマウスから垂直にゆっくりと引き出します。</li>
		<li>注射部位に滅菌ガーゼを塗り、出血が止まるまで約1分間圧力をかけながら、呼吸のために胸を動かします。</li>
		<li>マウスを麻酔から外し、加熱パッドで回復させます。 注:腫瘍の成長が成功すると、動物の状態が悪化し、フリルのヘアコート、猫背の体、目を細め、活動の低下、および低い体調スコアで現れることがよくあります(BCS < 2)。</li>
		<li>動物の状態を定期的に監視し、承認されたプロトコルで人道的エンドポイント基準に達したときに安楽死させます。</li>
		<li>剖検を行って安楽死させた動物の転移を特定し、続いて組織学的分析を行って標的臓器の腫瘍の存在を確認します。心臓内注射から安楽死までにかかる時間を記録します。</li>
	</ol></li>
</ol>

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現在の原稿では、PDXの確立と伝播の方法が詳しく説明されています。CNS転移を評価する際に前臨床試験を設定するために使用できる3つの異なる接種方法も実証されています。選択方法は実験の目的によって異なります。場合によっては、複数の接種経路を使用することが有益であろう。例えば、皮下側面移植は、腫瘍増殖に対する薬物の有効性を研究し、その標的上の薬物を評価するための簡単なアプローチを提供し、また、容易に監視および測定される腫瘍サイズの視覚的も提供する。しかし、目標の実現可能性と抗腫瘍増殖特性が確立されると、BBBを横断する生物学的製剤の有効性を評価し、脳腫瘍微小環境内でのその効果を研究するための同所性研究を設定することができます。また、生存率は同所性および心臓内注射研究でよりよく評価されます。
脳転移PDXモデルの頭蓋内注射は、脳微小環境およびBBBの存在のために選択される前臨床モデルであることが多い。しかしながら、研究は、脳転移が腫瘍への分子の透過性に影響を及ぼすBBBを修飾する能力を有することを示した16。BBBのこれらの変化は、頭蓋内移植された腫瘍には反映されず、このため、前臨床薬物研究は患者の腫瘍の反応を完全に反映していない可能性があります。この警告があっても、頭蓋内注射は、前臨床モデルでBBBを通過する薬物の透過性と有効性をテストするための最良の方法のままです。頭蓋内モデルのもう一つの課題は、腫瘍の成長を監視することが困難であり、画像技術の使用が必要であることです。蛍光マーカーまたは生物発光マーカーを用いたPDXのウイルス形質導入は伝統的に使用されてきましたが、実行が困難な場合があります。しかし、マーカーの導入を必要としないマウスで使用するためにいくつかのイメージング技術が開発されており、前臨床試験のためにこれらの同所性脳腫瘍を監視することの容易さを改善する可能性があります。これらには、磁気共鳴画像法(MRI)や陽電子放出断層撮影(PET)画像、マイクロコンピューター断層撮影(マイクロCT)などの画像技術が含まれます。最後に、頭蓋内注射は、軟髄膜転移などの脳外のCNS転移の微小環境を正確に反映していない可能性があります。この場合、大槽への注入は、軟髄膜転移をより正確に表すために行うことができます17。
PDXモデルの表現型と分子的特徴の両方を特徴づけることは、前臨床試験に最適なモデルを選択するために重要です。腫瘍潜伏期は7〜140日の範囲であり、服用率も非常に変動する可能性があります12。移植する動物の最適な数と治療を開始するタイミングは、各PDXモデルの特性に基づいて決定する必要があり、経験的に決定する必要があります。さらに、PDX腫瘍の分子プロファイルは、前臨床試験のための最も代表的なPDXモデルの選択にとっても重要です。モデルがドナー組織を分子的に近いほど、臨床反応をより予測できる可能性が高い。また、クローンの継承が現職の優性クローンの異なるゲノムプロファイルに関連していることが示されているように、ヒトデータから選択された標的が研究のために選択されるPDXに存在し、数世代にわたって維持されることを確認することが重要です。これに照らして、CNS転移PDX腫瘍の表現型および分子プロファイルは、複数世代にわたって広範囲に特徴付けられてきた12。
CNS転移PDXモデルを使用することには多くの利点がありますが、それらの使用に関連するいくつかの制限があります。第一に、代替の腫瘍微小環境、特に免疫系の欠如は、PDXモデル18の十分に文書化された限界である。ヒト腫瘍のマウスへの異種移植は、その後の継代ごとにヒト間質をマウス間質に置換し、ヒト間質は一般に数回継代後に完全置換される19。しかし、腫瘍微小環境の違いは、元の患者の腫瘍と比較して、側面移植PDX腫瘍の分子プロファイルに大きな違いをもたらすことはなく12、脇腹モデルがCNS転移を研究するための優れた実験モデルであることを示唆しています。第二に、免疫不全動物の使用は、腫瘍における免疫細胞浸潤の欠如および宿主による一般的な免疫応答をもたらし、宿主が癌増殖と闘おうとする基本的な方法を制限する12。ヒト免疫細胞を生着させたヒト化マウスは、特定の免疫細胞と腫瘍との相互作用を研究するために利用可能ですが、それらの結果のアプローチ、方法、および解釈についてはまだ多くの疑問と論争があります20。
PDXの大部分は遺伝的に安定であることが示されていますが、まれに、治療やその他の外部選択圧がない場合でも、マイナークローンの乗っ取りなど、腫瘍のクローンに変化がある可能性があることを示しました12,14,15。これは、分子プロファイルに劇的な変化をもたらす可能性があり、最終的には腫瘍が患者の腫瘍12の優性クローンを反映しなくなる。クローンサクセスを示すPDXは前臨床試験で使用できますが、ターゲティングを目的とした多くの遺伝子(Her2など)はクローンサクセシングで失われる可能性があります。したがって、PDXモデルを頻繁にスクリーニングして、それらが所望のクローンの分子プロファイルを依然として維持しているかどうかを判断することが奨励される。
要約すると、PDXモデルは、CNS転移だけでなく他の腫瘍タイプの研究のための優れたモデルシステムを表しています。これらのモデルの開発は、それらがヒトCNS転移の表現型、分子プロファイルおよび不均一性を大部分反映していることを示した8,9,10,12。これらは、CNS転移生物学の両方を研究するための効果的なモデルとして機能し、生理学的に関連する前臨床モデルとしても機能し、CNS転移のin vivo研究に歴史的に使用されてきた過剰使用された細胞株モデルに取って代わります。間違いなく、PDXとドナー患者腫瘍との間に差異が存在する12、18。これらの違いが何であるかを知ることは、前臨床試験の適切な計画と実行にとって重要です。最後に、いくつかの接種経路から選択することにより、PDXモデルはその用途が広く、病気の複数の側面の研究を可能にします。PDXモデルは、CNS転移の理解と新しい治療法の開発を進める上で重要な役割を果たすことは間違いありません。

中枢神経系(CNS)への転移の発生率は、近年増加しています1,2,3。腫瘍切除、全脳放射線療法、定位放射線手術などのCNS転移に対する従来の治療法は、主に緩和的であり、治癒することはめったになく、認知機能の低下などの衰弱性の副作用を引き起こす可能性があります1。最近、中枢神経系転移の治療のために多くの新しい標的療法および免疫療法が開発されており、副作用が少なく、より効果的な治療法であることが期待されています4。
前臨床結果を意味のある臨床エンドポイントに変換するには、多くの場合、効果的で予測的なモデリング戦略が必要です。歴史的に、細胞株異種移植片モデルは、CNS転移研究における前臨床研究の標準でした。しかしながら、これらの細胞株モデルは、宿主腫瘍の真の腫瘍挙動を反映しておらず、疾患の組織学的または分子的不均一性を表していない。さらに、細胞株モデルはin vitroの増殖条件に適応できるため、宿主腫瘍の元の特性を失います。患者の腫瘍を免疫不全マウスまたはヒト化マウスに生着させる患者由来異種移植片(PDX)は、トランスレーショナルガン研究でますます使用されています。研究者らは、PDXモデルが通常、腫瘍の成長、組織学的特徴を忠実に再現し、腫瘍の不均一性、転移の可能性、および分子遺伝学的特徴を維持できることを示しました。さらに、PDXモデルは予後であり、PDX腫瘍潜伏期間は患者の全生存期間と相関し、患者の試験において治療反応を正確に予測することも示されている5,6。
主に、これらは、非小細胞肺がん(NSCLC)7、乳がん8,9、および黒色腫10,11などの単一の起源に由来する腫瘍を表すように開発されています。最近では、8つの異なる組織学的サブタイプを表すPDXモデルの大規模で多様なコレクションが開発および特徴付けられています12。CNS転移のPDXモデルは、組織学的にも分子的にも元の患者の腫瘍によく似ており、組織学的にユニークな違いと類似性も示しています10,12。さらに、ほとんどのCNS転移PDXモデルはヒト腫瘍のクローン不均一性を維持していますが、クローン継承の証拠を示したものもあり12、治療後のクローン変化を監視することにより、治療に対する耐性を研究するのにも理想的です。
ここで説明するプロトコルは、PDX確立の方法と、CNS転移の前臨床試験で使用されるさまざまな接種経路を概説しています(図1)。これらの移植方法は、成長と転移を模倣する能力が異なります。ここでは、プロトコルは移植の各経路のアプリケーションを強調し、CNS転移の研究にそれらをどのように使用できるかを示しています。

<table><tbody><tr><td>25Gニードル</td><td>VWR</td><td>BD305122</td><td></td></tr><tr><td>70&micro;m セルストレーナー</td><td>VWR</td><td>21008-952</td><td></td></tr><tr><td>70% エタノールワイプ</td><td>VWR</td><td>470106-486</td><td></td></tr><tr><td>骨ワックス</td><td>MedVet</td><td>W31G-RL</td><td></td></tr><tr><td>CIEA NOG マウス</td><td>タコニック</td><td>NOG-F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>サーモフィッシャー</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>エチカ XR (ブプレノルフィン SR)</td><td>MWI</td><td>072117</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td><td></td>16000044</tr><tr><td>gentleMACS C チューブ</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Octo Dissociator</td><td>Miltenyi</td><td>130-095-937</td><td></td></tr><tr><td>ハミルトン シリンジ</td><td>シグマ</td><td>20919</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル成長因子減少 (GFR)</td> <td>コーニング</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>眼科用軟膏</td><td>MedVet</td><td>PH-PURALUBE-VET</td><td></td></tr><tr><td>PBS/DPBS</td><td>サーモフィッシャー</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>ポビドン ヨウ素スワブ</td><td>VWR</td><td>15648-906</td><td></td></tr><tr><td>固定装置フレーム</td><td>ストールティング</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>外科用ドリル</td><td>ストールティング</td><td>58610</td><td></td></tr><tr><td>外科用接着剤</td><td>MedVet</td><td>VG3</td><td></td></tr><tr><td>外科用縫合糸</td><td>MedVet</td><td>MMV-661-V</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>VWR</td><td>53548-001</td><td></td></tr><tr><td>腫瘍解離キット</td><td>Miltenyi</td><td>130-095-929</td><td></td></tr></tbody></table>

中枢神経系転移の患者由来異種移植モデルの確立と利用

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

中枢神経系(CNS)転移に対する新しい治療法の開発は、疾患を正確に表す前臨床モデルの欠如によって妨げられてきました。CNS転移の患者由来異種移植片(PDX)モデルは、ヒト疾患の表現型および分子特性をよりよく表し、過去の細胞株モデルと比較してヒト患者腫瘍の不均一性およびクローン動態をよりよく反映することが示されています。前臨床試験を設定する際に患者由来の組織を移植するために使用できる部位は複数あり、それぞれに長所と短所があり、それぞれが転移カスケードのさまざまな側面の研究に適しています。ここでは、プロトコルはPDXモデルを確立する方法を説明し、前臨床試験でCNS転移PDXモデルを利用するための3つの異なるアプローチを提示し、それぞれのアプリケーションと制限について説明します。これらには、側面移植、脳への同所性注射、および心臓内注射が含まれます。皮下腹腹移植は監視が最も簡単で、したがって前臨床試験に最も便利です。さらに、側面移植による脳および他の組織への転移が観察され、腫瘍が血管内、血管外漏出、およびコロニー形成を含む複数の転移段階を経ていることを示しています。脳への同所性注射は、脳腫瘍微小環境を再現するための最良の選択肢であり、血液脳関門(BBB)を通過する生物製剤の有効性を決定するのに役立ちますが、転移カスケードのほとんどのステップをバイパスします。心臓内注射は脳への転移を促進し、臓器向性の研究にも役立ちます。この方法は転移カスケードの以前のステップを省略しますが、これらの細胞は依然として循環を生き残り、血管外に出て、コロニーを形成する必要があります。したがって、PDXモデルの有用性は、腫瘍接種経路に影響され、どちらを利用するかの選択は、科学的な問題と実験の全体的な目標によって決定されるべきである。

側面伝播PDX腫瘍は、移植、モニタリング、切除が最も簡単で、PDX腫瘍の初期樹立と増殖に一般的に推奨されます(図1)。PDX腫瘍を確立または増殖させる場合、腫瘍の摂取率は異なる可能性があり、すべての腫瘍片が常にマウスに取り込まれるとは限らないため、複数の動物に腫瘍を移植することが賢明です。脳内で直接CNS転移PDXsを樹立および増殖させるための方法が開発されている13。ただし、これらの方法は、テイク率が低く、腫瘍の増殖と監視が側面移植よりも大幅に困難であるため、依然として困難です。
患者の腫瘍が容易に入手できない場合、CNS転移PDX腫瘍は、学術研究所や営利企業のリポジトリを含むさまざまなソースから入手することもできます。腫瘍を取得した後、最優先事項は、できるだけ多くの物質を増殖させて凍結保存し、多数の低通過腫瘍を確実に保存することです。これにより、PDXモデルを使用した無期限の後続の研究に十分な資料が利用可能になります。不死化細胞株と同様に、PDX腫瘍は、遺伝的浮遊が時間の経過とともにPDXの表現型と遺伝子型に変化をもたらすため、凍結保存し、低い継代数で使用する必要があります12,14,15。PDX腫瘍の発生源にかかわらず、ヒトではHIVや肝炎、マウスではコリネバクテリウム・ボビスなど、ヒトとマウスの両方の病原体についてPDXとマウスコロニーを頻繁にスクリーニングすることが重要です。これにより、PDXからの不要な病原体の拡散が、それらを扱う個人と、研究およびビバリウムの他のマウスの両方に制限されます。
ここで説明する移植方法は、腫瘍生物学の研究、転移カスケードの複数の側面の評価、および前臨床試験に使用できます。側面移植の主な利点は、腫瘍が見えるため、経時的な腫瘍モニタリングが容易であり、その成長はキャリパーを使用して簡単に測定できることです。この方法は、創薬標的の実現可能性を確立するための出発点として適しています。頭蓋内移植は、脳微小環境の存在が重要であり、腫瘍の成長または分子プロファイルを変化させる可能性がある場合に好ましい。さらに、頭蓋内移植は腫瘍を血液脳関門(BBB)の後ろに配置するため、BBBを通過するために必要な薬の有効性を調べる前臨床試験に不可欠です。しかし、PDX腫瘍の増殖を監視することは困難であり、細胞が標識されている場合は放射線イメージングまたは生物発光イメージングが必要です。前臨床で薬物治療を開始する時期を知るには、成長を監視するための画像データ、または特定のPDX腫瘍を有するマウスの平均生存期間に関する知識のいずれかが必要です。さらに、頭蓋内移植は転移カスケードのすべての重要なステップをバイパスするため、脳内の薬効と腫瘍微小環境の研究にのみ適しています。腫瘍微小環境の違いはあるものの、PDX腫瘍の形態は、小細胞肺癌原発巣に由来する脳転移に由来するこのPDX腫瘍(CM04)に見られるように、移植部位に関係なく類似しています(図2)。小細胞肺癌の形態は,脇腹腫瘍,頭蓋内腫瘍,心臓内注射による腹部転移にみられる.さらに、脇腹に移植された腫瘍からの自然転移は以前に観察されており12、血管内、血管外漏出、コロニー形成などの転移過程を、脳内の同所性腫瘍では不可能な脇腹腫瘍で再現して研究できることを示唆しています。一般に、側面移植はCNS転移生物学を研究し、前臨床試験を実施するのに適した方法であることが観察されています。
心臓内注射は、臓器向性および腫瘍の転移能を研究するために最もよく使用されます。注入された腫瘍細胞は、循環の存続、血管外漏出、転移部位のコロニー形成など、転移カスケードのいくつかのステップを経る必要があります。脳への同所性注射と同様に、放射線画像や細胞標識なしで腫瘍転移の進行を追跡することは困難な場合があります。しかし、同所性移植と同様に、接種が成功すると、腫瘍が広がるにつれて動物の状態が時間の経過とともに悪化します。 図3A は、黒色腫に由来するCNS転移PDXモデルM2における心臓内注射後の脳への転移を示す。PDX腫瘍(CM04)の心臓内注射は、腹腔および肝臓への転移をもたらした(図3B)。肺、腎臓、卵巣など、評価された他の臓器には目に見える転移はありませんでした。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62264/62264fig01.jpg"> 図1:前臨床試験のためのPDXの確立、伝播、および使用の一般的なワークフローを示すフローチャート。 各接種方法について、関与する転移カスケードのステップが各方法の下に列挙される。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62264/62264fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62264/62264fig02.jpg"> 図2:異なる接種方法によるPDX腫瘍の組織像。 3つの方法によって免疫不全マウスに移植された小細胞肺癌(CM04)に由来するCNS転移PDX腫瘍のヘマトキシリンおよびエオジン(H&amp;E)染色は、小細胞肺癌の腫瘍病理学的および形態学的特徴が類似しており、核が小さく細胞質が乏しい。心臓内注射パネルは腹部転移を示しています。小さな細胞の巣と高い核対細胞質の比率は、3つの画像すべてで明らかです。画像はスライドスキャナーで撮影され、10倍に拡大されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62264/62264fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62264/62264fig03.jpg"> 図3:心臓内注射後に観察された転移。 (A)M2および(B)CM04の心臓内注射後の剖検による評価中の目に見える転移を伴う組織のH&amp;E染色。画像はスライドスキャナーで(A)撮影し、通常の顕微鏡で1倍(左)または20倍(右)または(B)通常の顕微鏡で10倍の倍率で撮影しました。この図は、以前の出版物12から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62264/62264fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

中枢神経系転移PDXモデルは、ヒト転移の表現型および分子特性を表しており、前臨床試験の優れたモデルとなっています。ここでは、PDXモデルを確立する方法と、前臨床試験に最適な接種経路について説明します。

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...

CNS転移に対する新しい治療法の開発は、優れた前臨床モデルの欠如によって妨げられてきました。私たちの患者由来の異種移植片モデルは、歴史的に使用されていた細胞株モデルよりもCNS転移をよりよく再現します。腫瘍接種のさまざまな経路を利用することにより、転移カスケードのさまざまな側面を研究することができます。各ルートには、研究に活用できる利点があります。手順のデモンストレーションは、私の研究室のポスドクであるBen Yi Tewです。凍結保存されたPDX腫瘍の皮下側面移植の場合、凍結保存された腫瘍組織を摂氏37度の水浴中で迅速に解凍します。次に、組織培養皿で5ミリリットルのDPBSですすいでください。次に、3〜8週齢の雌NOGマウスで麻酔を確認した後、左右の脇腹を0.5〜1センチメートル切開し、2×2×2ミリの腫瘍組織片をポケットの奥深くに挿入します。切開部を閉じた後、マウスが外来になるまでモニタリングしながら麻酔から回復させます。腫瘍が成長し始めたら、キャリパーで週に3回腫瘍を測定します。適切な実験エンドポイントで、剖検によって転移を特定し、組織学的分析を通じて標的臓器内の腫瘍の存在を確認します。切除したPDX腫瘍を氷上のDMEMに入れます。組織培養皿で5ミリリットルのDPBSで腫瘍を洗浄し、壊死領域がある場合は除去します。腫瘍を2〜4ミリメートルの長さの小さな小片に切断し、解離溶液を含むチューブに移します。Dissociatorで適切なプログラムを使用して、組織を機械的に解離し、得られた細胞懸濁液を70マイクロメートルの細胞ストレーナーに通します。20ミリリットルのDMEMを使用して、ストレーナーから残りの細胞を洗浄し、解離した細胞懸濁液を遠心分離します。次いで、細胞およびDPBSを再懸濁し、DPBSを計数するために、DPBS1〜2マイクロリットルの細胞あたり10〜4番目の細胞を5〜10倍の濃度に調整する。手術領域を準備するには、マウスの頭の毛皮を剃って頭皮を露出させます。次に、マウスを定位固定装置フレームに入れ、イヤーバーを使用してマウスの頭をしっかりと固定します。適切な鎮痛剤も投与してください。ポビドンヨードと70%エタノールの3つの交互のスクラブで頭皮を消毒します。頭蓋骨を露出させ、頭皮を引っ込めるために5〜7ミリメートルの縦切開を行います。鉗子で骨膜をこすり落とし、ブレグマを見つけます。定位フレームの針をブレグマの上に置き、座標をゼロにリセットします。腕を正中線の右に1ミリメートル後方、横1ミリメートル動かし、この位置に永久マーカーで印を付けます。次に、脳に穴を開けないように注意しながら、マークされた場所の頭蓋骨に小さなバリ穴を開けます。1〜2マイクロリットルのセルを備えた5マイクロリットルの26ゲージハミルトンシリンジにロードし、シリンジを定位固定装置アームに取り付けます。針をゆっくりと2ミリメートル脳に挿入し、希望の速度で細胞を注入し始めます。すべての細胞が送達されたら、針をゆっくりと引っ込め、バリの穴を骨ワックスで埋め、切開部を閉じます。麻酔から回復するまで監視しながらマウスをケージに戻します。適切な実験エンドポイントで動物を安楽死させた後、組織学的分析を通じて脳内の腫瘍の存在を確認します。心臓内注射によってPDX腫瘍を移植するには、実証されたように腫瘍細胞を準備し、麻酔をかけたレシピエントマウスを仰臥位に置きます。動物の胸の毛皮を剃り、露出した皮膚をポビドンヨードと70%エタノールで消毒します。28ゲージの針を備えた注射器に、10〜5番目の腫瘍細胞の0.5〜10倍と最大100マイクロリットルのDPBSを引き込みます。胸骨ノッチと剣状突起の中間の胸骨のわずかに左に注射部位を配置します。次に、注射部位のマウスに針を垂直に挿入します。逆流が観察され、針が左心室にうまく進入したことを示すようになったら、針を動かさずに腫瘍懸濁液をゆっくりと左心室に分注します。すべての細胞が送達されたら、針をゆっくりと垂直に引っ込め、出血が止まるまで約1分間、滅菌ガーゼを注射部位に塗布します。マウスが歩行可能になるまで監視しながら、加熱パッド上でマウスを回復させます。適切な実験エンドポイントで、剖検によって転移を特定し、組織学的分析を通じて標的臓器内の腫瘍の存在を確認します。腫瘍の微小環境の違いにもかかわらず、PDX腫瘍は、移植部位に関係なく、小さな核と乏しい細胞質を持つ細胞を含む同様の形態を示します。この解析では、ヒトメラノーマ細胞の心臓内注射はマウス脳への腫瘍細胞の転移をもたらし、脳転移ヒト小細胞肺癌腫瘍細胞の心臓内注射はマウス腹腔および肝臓への転移をもたらした。これらのプロトコルは、新しい治療法と治療の組み合わせをテストするための前臨床試験の設定を可能にし、生物学的プロセスと腫瘍転移の研究に役立ちます。

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