中枢神経系転移の患者由来異種移植モデルの確立と利用
2021年5月7日
中枢神経系転移PDXモデルは、ヒト転移の表現型および分子特性を表しており、前臨床試験の優れたモデルとなっています。ここでは、PDXモデルを確立する方法と、前臨床試験に最適な接種経路について説明します。
CNS転移に対する新しい治療法の開発は、優れた前臨床モデルの欠如によって妨げられてきました。私たちの患者由来の異種移植片モデルは、歴史的に使用されていた細胞株モデルよりもCNS転移をよりよく再現します。腫瘍接種のさまざまな経路を利用することにより、転移カスケードのさまざまな側面を研究することができます。
各ルートには、研究に活用できる利点があります。手順のデモンストレーションは、私の研究室のポスドクであるBen Yi Tewです。凍結保存されたPDX腫瘍の皮下側面移植の場合、凍結保存された腫瘍組織を摂氏37度の水浴中で迅速に解凍します。
次に、組織培養皿で5ミリリットルのDPBSですすいでください。次に、3〜8週齢の雌NOGマウスで麻酔を確認した後、左右の脇腹を0.5〜1センチメートル切開し、2×2×2ミリの腫瘍組織片をポケットの奥深くに挿入します。切開部を閉じた後、マウスが外来になるまでモニタリングしながら麻酔から回復させます。
腫瘍が成長し始めたら、キャリパーで週に3回腫瘍を測定します。適切な実験エンドポイントで、剖検によって転移を特定し、組織学的分析を通じて標的臓器内の腫瘍の存在を確認します。切除したPDX腫瘍を氷上のDMEMに入れます。
組織培養皿で5ミリリットルのDPBSで腫瘍を洗浄し、壊死領域がある場合は除去します。腫瘍を2〜4ミリメートルの長さの小さな小片に切断し、解離溶液を含むチューブに移します。Dissociatorで適切なプログラムを使用して、組織を機械的に解離し、得られた細胞懸濁液を70マイクロメートルの細胞ストレーナーに通します。
20ミリリットルのDMEMを使用して、ストレーナーから残りの細胞を洗浄し、解離した細胞懸濁液を遠心分離します。次いで、細胞およびDPBSを再懸濁し、DPBSを計数するために、DPBS1〜2マイクロリットルの細胞あたり10〜4番目の細胞を5〜10倍の濃度に調整する。手術領域を準備するには、マウスの頭の毛皮を剃って頭皮を露出させます。
次に、マウスを定位固定装置フレームに入れ、イヤーバーを使用してマウスの頭をしっかりと固定します。適切な鎮痛剤も投与してください。ポビドンヨードと70%エタノールの3つの交互のスクラブで頭皮を消毒します。
頭蓋骨を露出させ、頭皮を引っ込めるために5〜7ミリメートルの縦切開を行います。鉗子で骨膜をこすり落とし、ブレグマを見つけます。定位フレームの針をブレグマの上に置き、座標をゼロにリセットします。
腕を正中線の右に1ミリメートル後方、横1ミリメートル動かし、この位置に永久マーカーで印を付けます。次に、脳に穴を開けないように注意しながら、マークされた場所の頭蓋骨に小さなバリ穴を開けます。1〜2マイクロリットルのセルを備えた5マイクロリットルの26ゲージハミルトンシリンジにロードし、シリンジを定位固定装置アームに取り付けます。
針をゆっくりと2ミリメートル脳に挿入し、希望の速度で細胞を注入し始めます。すべての細胞が送達されたら、針をゆっくりと引っ込め、バリの穴を骨ワックスで埋め、切開部を閉じます。麻酔から回復するまで監視しながらマウスをケージに戻します。
適切な実験エンドポイントで動物を安楽死させた後、組織学的分析を通じて脳内の腫瘍の存在を確認します。心臓内注射によってPDX腫瘍を移植するには、実証されたように腫瘍細胞を準備し、麻酔をかけたレシピエントマウスを仰臥位に置きます。動物の胸の毛皮を剃り、露出した皮膚をポビドンヨードと70%エタノールで消毒します。
28ゲージの針を備えた注射器に、10〜5番目の腫瘍細胞の0.5〜10倍と最大100マイクロリットルのDPBSを引き込みます。胸骨ノッチと剣状突起の中間の胸骨のわずかに左に注射部位を配置します。次に、注射部位のマウスに針を垂直に挿入します。
逆流が観察され、針が左心室にうまく進入したことを示すようになったら、針を動かさずに腫瘍懸濁液をゆっくりと左心室に分注します。すべての細胞が送達されたら、針をゆっくりと垂直に引っ込め、出血が止まるまで約1分間、滅菌ガーゼを注射部位に塗布します。マウスが歩行可能になるまで監視しながら、加熱パッド上でマウスを回復させます。
適切な実験エンドポイントで、剖検によって転移を特定し、組織学的分析を通じて標的臓器内の腫瘍の存在を確認します。腫瘍の微小環境の違いにもかかわらず、PDX腫瘍は、移植部位に関係なく、小さな核と乏しい細胞質を持つ細胞を含む同様の形態を示します。この解析では、ヒトメラノーマ細胞の心臓内注射はマウス脳への腫瘍細胞の転移をもたらし、脳転移ヒト小細胞肺癌腫瘍細胞の心臓内注射はマウス腹腔および肝臓への転移をもたらした。
これらのプロトコルは、新しい治療法と治療の組み合わせをテストするための前臨床試験の設定を可能にし、生物学的プロセスと腫瘍転移の研究に役立ちます。
概要
本記事では、皮下側腹部移植、脳への正位注入、および心内注入という3つの異なる移植手法を用いた、中枢神経系（CNS）転移の患者由来異種移植（PDX）モデルの確立プロトコルについて詳述します。これらのモデルは、従来の細胞株モデルと比較してヒトCNS転移の表現型および分子生物学的特性をより正確に再現しており、腫瘍生物学や治療効果に関するより適切な前臨床研究を可能にします。
研究の主要構成要素
科学分野
- がん生物学
- 神経科学
- 前臨床モデリング
背景
- CNS転移療法の開発は、不十分な前臨床モデルによって制限されています。
- PDXモデルは、細胞株モデルよりもヒト腫瘍の不均一性とクローン動態をより適切に反映します。
- 異なる移植経路を用いることで、転移カスケードのさまざまな側面を研究することが可能です。
- 移植部位の選択は、特定の研究課題に対するモデルの有用性と妥当性に影響を与えます。
研究目的
- 3つの植え込み方法を用いて、中枢神経系（CNS）転移PDXモデルを構築するためのプロトコルを記述する。
- 各アプローチの適用範囲と限界を比較する。
- 研究者が実験目的に合わせて最適なモデルを選択できるようガイドを提供する。
使用方法
- 免疫不全マウスへの凍結保存PDX腫瘍組織の皮下側腹部移植。
- 定在手術を用いたマウス脳への解離腫瘍細胞の同所性注入。
- 全身転移を促進するための、左心室への腫瘍細胞の心腔内注入。
- 腫瘍増殖のモニタリング、剖検、および転移の組織学的確認。
主な結果
- 側腹部への移植はモニタリングが容易であり、脳やその他の臓器への転移を引き起こすため、転移の複数の段階をモデル化できます。
- 脳への正位移植（オルソトピック注入）は、脳腫瘍の微小環境を最も正確に再現し、血液脳関門の透過性の研究に適していますが、初期の転移段階を飛び越えることになります。
- 心腔内注入は、臓器親和性と転移の後期段階の研究を可能にし、観察される転移部位は腫瘍細胞の型に依存します。
- PDX腫瘍は移植部位に関わらず同様の形態を維持するため、モデルの一貫性が裏付けられています。
結論
- 異なる植込み経路を通じて構築されたPDXモデルは、前臨床の中枢神経系（CNS）転移研究において多目的なプラットフォームを提供します。
- 接種方法の選択は、具体的な科学的課題および実験目的に合わせて決定する必要があります。
- これらのプロトコルは、臨床的に関連性の高いモデルにおける腫瘍生物学、転移、および治療試験の研究を促進します。
よくある質問
産業界における重要性
中枢神経系（CNS）転移の患者由来がん異種移植（PDX）モデルは、ヒト腫瘍の不均一性と転移挙動をより正確に反映させることで、前臨床腫瘍学における重要な課題を解決します。これらのモデルにより、治療効果、血液脳関門の透過性、および転移の進行について翻訳的に意義のある評価が可能となり、初期探索および前臨床パイプラインにおけるリスク調整済みの意思決定を支援します。移植経路を戦略的に選択することで、モデルの出力とポートフォリオ固有の課題を整合させ、CNS標的薬開発における予測の信頼性を高めることができます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 疾患に関連するシステムにおいて、転移メカニズムおよび腫瘍と宿主の相互作用の解析を可能にします。
- 患者の腫瘍表現型を再現することで、CNS転移ターゲットの機能的検証をサポートします。
- 臨床現場で観察されるクローンのダイナミクスと不均一性をモデル化することにより、メカニズム面でのリスク低減を促進します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 腫瘍の増殖および転移の広がりの定量的評価のための、検証済みin vivoシステムを提供します。
- 移植経路に応じた治療反応および転移エンドポイントの再現性のあるモニタリングを可能にします。
- 血液脳関門の透過性および臓器親和性を評価するためのアッセイ標準化をサポートします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 前臨床での有効性試験を臨床的な疾患の複雑さと整合させ、トランスレーショナルな連続性を向上させます。
- 患者の多様性を反映したモデルを用いて、治療薬の併用療法や生物学的プロセスの研究を可能にします。
- 転移の進行と治療反応をモデル化することで、リスクを調整した開発推進の意思決定に寄与します。
パイプラインおよびワークフローの統合
CNS転移のPDXモデルは、創薬から前臨床に至る一連の流れに組み込まれており、仮説の検証、ターゲットの妥当性確認、および候補療法のトランスレーショナル評価を可能にします。
- 探索生物学：転移、腫瘍微小環境、およびクローン進化のメカニズム研究を支援します。
- スクリーニング：化合物評価のための、定量的な腫瘍増殖および転移のリードアウトを提供します。
- 分析：比較分析のため、転移エンドポイントの組織学的および表現型的な確認を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：血液脳関門の課題や臓器特異的な転移をモデル化することで、前臨床所見を臨床シナリオへとつなげます。
- エンタープライズ再利用：多様な腫瘍タイプや実験目的に適応可能な、汎用性の高いプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 中枢神経系（CNS）転移研究における予測の信頼性を高め、生物学的な曖昧さを軽減します。
- 運用の価値： 生体内（in vivo）モデリングを標準化し、再現可能で拡張性のある前臨床研究を可能にします。
- 戦略的価値： モデルを臨床的な疾患の複雑さに適合させることで、go/no-go判断および資本配分を改善します。
- ポートフォリオへの影響： リスク調整済みの優先順位付けと、CNS標的アセットの推進を支援します。
実施上の注意点
- 動物手術、定位固定技術、および組織学的解析の専門知識が必要です。
- 免疫不全マウスコロニーおよび特殊な手術器具へのアクセスが必要です。
- 植え込みプロトコルとエンドポイント解析のチーム間での標準化が必要です。
- 腫瘍の種類や転移部位による適応には、プロトコルの最適化が必要な場合があります。
- 植え込みルートの選択は、科学的な問いおよび実験目的と一致している必要があります。
