経頭蓋機能超音波画像を用いたマウスにおける脳全体3D活性化と機能結合性マッピング
February 24th, 2021
このプロトコルは、機能的超音波(fUS)を用いたマウス脳における容積脳血力学的変動の定量化を記述する。感覚刺激に続く3D機能活性化マップの手順と安静状態機能接続性は、麻酔および覚醒マウスにおける例示例として提供される。
機能性超音波は、生きているげっ歯類の脳の脳の血液量のマッピングを可能にする新しい神経画像のモダリティです。超高速面波画像を使用して、我々は比類のない特別な一時的な分解能と感度で脳全体の血行力学応答を測定することができます。このプロトコルは、麻酔と覚醒動物実験の両方のために、マウスで経頭蓋機能超音波画像診断を行う方法を説明します。
FMRIなどの他の全脳機能イメージング技術と比較して、機能的超音波は高い可搬性、使いやすさを提供し、目を覚まし、自由に動く被験者の実験を可能にし、麻酔バイアスを回避し、行動研究を可能にする。最近まで、FUSイメージングは超音波の専門家とのコラボレーションでのみ使用されていました。現在、この技術は、市販のスキャナと前臨床脳イメージングのための専用ソフトウェアのおかげで、広い神経科学コミュニティに利用可能であり、FUSは超音波の背景なしではかなり使いやすくなっています。
麻酔付きイメージングセッションでは、角膜損傷を避けるためにマウスの目に眼軟膏を塗布し、振戦を使用してマウスヘッドを剃ります。数分後に脱毛クリームを塗り、すすいでください。ヘアが完全に削除されるまで、この操作を繰り返します。
心電図記録のために手足に皮下ピンを挿入し、頭部に遠心超音波ゲルを置く。目覚めのマウスの実験では、頭部固定のために予備手術が必要です。麻酔マウスと立体性フレームを摂氏37度の加熱パッドの上に置きます。
目に保護ジェルを塗布し、皮下に26ゲージ針を使用して頭皮の下にリドカインを投与し、数分待ちます。後頭部骨の後ろから鼻骨の始まりまで矢状縫合糸に続いて切開し、手術用はさみを使って両半球の皮膚を切除する。1%のヨウ素溶液で頭蓋骨をきれいにし、残りの骨膜を取り除きます。
ヘッドプレートをテンプレートとして使用し、頭蓋骨に2つの穴をマークして固定ネジを配置します。ヘッドプレートをネジに置き、インプラントの良好なグリップを維持するために、歯のセメントを使用して、フレームの前後のネジとヘッドプレートを固定します。セメントが乾燥した後、立体性フレームから動物を取り除き、アトミペゾールのキログラムあたり1ミリグラムの皮下注射を介して麻酔を逆にします。
術後の痛みのために予防的なメロキシカムを投与する。保護のためにヘッドプレートの上に磁気3Dプリントキャップを置き、マウスがモバイルホームケージへの習慣の開始前に4〜6日間回復できるようにします。数時間加熱パッドの回復ケージに動物を置き、その後、ごみの仲間と自宅のケージにマウスを戻します。
4日目と5日目のポストリカバリでは、マウスをモバイルホームケージに繰り返しクランプし、頭の固定時間を5分から30分まで徐々に増やします。マウスを習慣化するために、画像窓に生理食い物と超音波ゲルを塗布します。6日目の復旧後にこのプロセスを繰り返します。
ソフトウェアを起動し、実験セッションを作成します。ナビゲーションキーボードを使用して超音波プローブの位置を調整するには、移動プローブメニューに移動します。ライブビューの取得を開始し、必要に応じて、動物の脳の血液量、またはCBVのリアルタイムイメージングを介してプローブの位置を調整します。
画像の中央に脳を揃え、画像化パラメータを最適化して、最高の信号対ノイズ比をキャプチャします。取得ソフトウェアの[Angio 3D]オプションを開きます。プリセットパネルで、最初のスライス、最後のスライス、ステップサイズのスキャンパラメータを調整して、脳全体をスキャンして取得を開始します。
取得したソフトウェアを開いたまま、データ分析と可視化のためにソフトウェアを起動し、Angio 3Dスキャンをロードします。3つのビューパネルを使用して取得ボリュームをナビゲートし、コロナスキャン方向、後部または姿勢前部を選択します。脳登録パネルに移動し、登録プロセスのマウス参照テンプレートを読み込みます。
全自動または手動登録モードを使用して、アレン マウス共通座標フレームワークでスキャンを登録します。Angio 3D スキャンと参照テンプレートの重ね合わせを確認するか、またはアトラスマネージャパネルを使用してスキャンとアレン参照アトラスの重ね合わせを確認します。登録を BPS ファイルとして保存します。
ICOスタジオソフトウェアで、血管造影スキャンとそのBPSファイルがロードされていることを確認してください。脳ナビゲーションパネルに移動します。[アトラスマネージャ]パネルで、親子ツリーナビゲーターを使用して、マウスのアレン・ブレイン・アトラスをナビゲートします。
解剖学的ターゲット領域を見つけ、それらを選択して3つのビューでスキャンに重ね合わせる。3 つのビュー パネルで対象領域を視覚化し、対象領域を含むコロナ位置に 2 つのマーカーを手動で設定して、実験の対象領域と重なるイメージング平面を選択します。脳位置決めシステム(BPS)をクリックして、プローブの位置に対応する結果のモーター座標を抽出し、対象となる平面を画像化します。
アンジオスキャンから計算された画像のプレビューを確認します。ICOスキャンソフトウェアで、プローブの位置パネルに入り、BPS座標を入力してクリックし、抽出された座標を適用して、プローブがターゲットのイメージングプレーン上を移動して整列させます。ライブビュー取得を実行し、現在の撮像面が予測に対応していることを確認します。
刺激の時間、興味刺激時間、繰り返し回数を含む刺激シーケンスを事前定義します。取得の合計時間、ポジション数、およびポジション間のデッドタイムを定義して、3D FUS シーケンスを実行します。TTL入力を介して集録システムと同期する自動刺激の場合、取得を開始する前に、トリグインオプションを選択します。
ICO studioソフトウェアで取得を開き、アクティベーションマップメニューに入り、開始時間と終了時間でアクティベーションパターンフィールドを入力し、アクティベーションマップを計算します。視覚化の表示パラメータを調整し、オフライン解析用の H5 ファイルとしてアクティベーション マップをエクスポートします。取得の合計時間、撮像平面の位置数、および位置間のデッドタイムを定義して、3D FUS シーケンスを実行します。
取得を保存し、ICOスタジオソフトウェアにロードします。必要に応じて、BPS ファイルとアレン マウス脳協調フレームワークを読み込みます。アトラスマネージャで、対象地域としてアトラスのリージョンを選択します。
機能伝導度メニューを入力し、希望する領域と ROI マネージャを選択します。結果を接続マトリックスまたはシードベースの相関マップとして視覚化し、必要に応じて帯域幅フィルターを選択して調整し、統計分析用の相関結果をエクスポートします。このプロトコルは、マウス脳における脳血血力学的変化の3D定量に使用された。
ウィスカ刺激は、感性刺激誘発応答の例として選択した。有意な活性化は、マウスの血行力学的応答関数を使用して、一般的な線形モデル(GLM)の解像度で決定された。試験期間は760秒で、60秒のベースライン、80秒の刺激、60秒の回復時間が5回繰り返された。
逆側の一次体性感覚皮質のボクセル賢明な時間経過を使用して、バレルフィールド領域、またはS1BFは、ベースラインと比較してCBVの15〜20%の増加を明らかにした。同じパラダイムは、ICOスキャンの目覚めのプリセットを使用して、モバイルホームケージ内のヘッド固定動作マウスに適用されました。複数のウィスカー刺激実験後の活性化マップを以下に示します。
有意な活性化は、デフォルトのマウス血行力学的応答関数を使用してGLMの解像度で決定された。一時的な相関は、ケタミンキシラジン麻酔マウスにおける3D脳領域間の低周波自発的なCBV変動を正規化した。種子ベースの分析と背部海馬は、右海馬と左海馬の間の有意な半球間伝導性だけでなく、より深いレトロ海馬領域およびpiriform礼儀を明らかにした。
S1BFで選択されたシード領域も対称相関パターンをもたらした。実験を成功させるための重要なポイントは、動物の調製、特に麻酔動物を含む実験のための麻酔のレベルと、覚醒動物の実験における頭蓋骨の保護である。米国が睡眠、学習、行動に関する基本的な質問だけでなく、創薬のための機能的な接続性の薬理学的変調を扱う目を覚ます動物の重要な脳機能を研究することを可能にした場合。
概要
このプロトコルは、マウスの脳における血行動態の変化を定量化するための機能的超音波（fUS）の使用を概説しています。感覚刺激後の3D機能活性マッピングと、麻酔状態と覚醒状態のマウスの両方での安静時機能接続性を紹介しています。
主要な研究構成要素
科学分野
- ニューロイメージング
- 脳血行動態
- マウスモデル
背景
- 機能的超音波は、生きたげっ歯類の脳における血行動態の変化のマッピングを可能にします。
- 従来の方法と比較して、比類のない空間的および時間的解像度を提供します。
- 商用のスキャナの利用により、大規模な神経科学コミュニティーでfUSが利用可能になりました。
- 麻酔に関連するバイアスを減らすため、覚醒した自由に動く被験者での研究を容易にします。
研究目的
- マウスにおける経頭蓋機能的超音波イメージングのプロトコルを示す。
- 感覚活性時の脳血行動態応答を捉える方法を説明する。
- 安静時機能接続性分析の手順を確立する。
使用方法
- 超高速平面波イメージングを利用した機能的超音波イメージングシステム。
- イメージングセッションのために麻酔状態と覚醒状態の両方のマウスを含む実験モデル。
- 目薬の塗布、頭髪の剃毛、外科的頭部固定などの準備に焦点を当てています。
- イメージングパラメータの最適化とデータ取得プロセスの詳細な手順。
- Allen Mouse Common Coordinates Frameworkにおけるデータ分析と可視化の技術を含みます。
主要な結果
- 脳血液量の高解像度イメージングを実行する能力を示しています。
- 麻酔なしで血行動態応答を研究するfUSの有効性を詳細に説明しています。
- 感覚刺激と安静時接続性のモニタリングの両方に対する適用を検証しています。
- 覚醒した動物研究の術後急性ケアと回復プロトコルを強調しています。
結論
- この研究は、脳のダイナミクスの理解を向上させる強力なイメージング技術を紹介しています。
- 覚醒した被験者の非侵襲的イメージングを通じて、行動研究の新たな道を開いています。
- ニューロンのメカニズムと機能的脳接続性の理解を促進するfUSの可能性を明らかにしています。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Functional ultrasound (fUS) imaging enables non-invasive, high-resolution mapping of cerebral hemodynamic responses in awake and behaving mice, reducing anesthesia-related confounds in preclinical neuroscience studies. This capability supports target validation and mechanistic de-risking by linking neuronal activity to vascular responses in disease-relevant systems. The method enhances predictive confidence in early discovery by providing reproducible, quantifiable readouts of brain activation and functional connectivity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through sensory-evoked activation mapping in defined brain regions.
- Operational Value: Provides reproducible 3D functional connectivity patterns for network identification and target engagement assessment.
- Strategic Value: Supports biological de-risking by validating target modulation effects on brain-wide hemodynamic responses.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative cerebral blood volume (CBV) measurements as a hemodynamic proxy for neuronal activity.
- Operational Value: Enables standardized, whole-brain 3D activation mapping with high spatiotemporal resolution for assay readiness.
- Strategic Value: Facilitates scalable screening of pharmacological compounds on functional brain networks in awake animals.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Captures resting-state functional connectivity in disease-relevant brain networks, such as hippocampal-cortical circuits.
- Operational Value: Enables longitudinal monitoring of functional connectivity changes in preclinical models.
- Strategic Value: Advances translational biomarker alignment by linking hemodynamic signatures to neuronal network function.
Pipeline & Workflow Integration
fUS imaging integrates into the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to lead optimization through quantifiable brain activation and connectivity readouts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via sensory stimulation paradigms and GLM-based activation mapping.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible hemodynamic responses with defined stimulation and recovery timelines.
- Analytics: Provides voxel-wise time courses and correlation matrices for statistical analysis of brain-wide responses.
- Translational Research: Connects hemodynamic changes to anatomical structures via Allen Mouse Common Coordinates Framework registration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for cross-functional teams to assess target modulation in awake, behaving animals.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through hemodynamic response quantification.
- Operational Value: Standardization and reproducibility across anesthetized and awake experimental conditions.
- Strategic Value: Reduced late-stage biological risk via early functional connectivity profiling.
- Portfolio Impact: Informed go/no-go decisions based on brain network engagement and modulation.
Implementation Considerations
- Expertise in neuroscience and ultrasound-based imaging techniques.
- Instrumentation including motorized linear transducer and fUS acquisition software.
- Cross-team standardization of head fixation, anesthesia levels, and stimulation protocols.
- Adaptation considerations for different mouse strains and disease models.
- Practical limitations including surgical preparation for awake imaging and signal depth constraints.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:22
Animal Preparation
3:58
Probe Positioning
4:34
Angiographic Scan and Atlas Registration
5:49
Brain Positioning System (BPS)
7:14
Task-Evoked Experiment: Whisker Stimulation
8:14
4D Functional Connectivity
9:08
Results: Transcranial Activation Maps and rCBV Time Course Following Whiskers Stimulation in an Anesthetized and Awake Behaving Mouse
11:08
Conclusion
