Name: げっ歯類とヒト脳組織におけるアクチン重合状態評価のための時間効率の高い蛍光分光法ベースアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: 学ぶ 蛍光分光法ベースアッセイでげっ歯類とヒト脳組織のアクチン重合状態を評価する方法。高速・高スループットでF-actinを定量し、神経科学研究に応用可能です。

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この研究は、ニュージーランド神経学財団(1835-PG)、ニュージーランド保健研究評議会(#16-597)、ニュージーランドのオタゴ大学解剖学学科によって支援されました。私たちは、人間の脳組織のためのHCB-IDIBAPSバイオバンク(スペイン)の神経組織銀行にお世話になっています。私たちは、ビデオの記録と編集で彼女の助けをしてくれたジアシアン・ザンに感謝します。

実験動物のケアと使用における倫理に関するオタゴ大学委員会の規則に従って、すべての実験的手続きが行われました(倫理議定書第1項。AUP95/18およびAUP80/17)およびニュージーランド議会。ヒト脳組織は、スペイン・バルセロナの病院クリニックIDIBAPSバイオバンクの神経組織銀行から得られた。すべての組織収集プロトコルは、病院クリニック、バルセロナの倫理委員会によって承認され、インフォームドコンセントは、家族から得られました。
1. バッファーおよび試薬の調製
<ol><li>脳組織の均質化とシナプス末端の濃縮された分率の調製のために、次のバッファーを準備します。 ホモジナイゼーションバッファー: 5 mM HEPES, pH 7.4 0.32 M スクロースを補った リサスペンションバッファー:5 mMトリス、pH 7.4 0.32 Mスクロースを補充 洗浄バッファー: 5 mM トリス、pH 8.1 1.2 Mスクロース 1.0 M スクロース 0.85 Mスクロース</li>
	<li>プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤の自家製または商業的なミックスを追加します。 注:完全なプロテアーゼ阻害剤ミックス(10 mLバッファーあたり1錠)とホスファターゼ阻害剤カクテルIV(1:100;ボリューム:ボリューム)のEDTAフリーバージョンを使用しています。</li>
	<li>以下のバッファーと試薬を準備して、ファロイジンの固定、透過性、結合を行います。 クレブスバッファー: 118.5 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgCl2,2 mM CaCl2,0.1 mM KH2PO4,5 mM NaHCO3,10 mM グルコース, 20 mM HEPES, pH 7.4 1 M KCl 25% グルタルアルデヒド (ストック溶液) 0.1 % トリトン X-100 および 1 mg/mL NaBH4を含むクレブス バッファー 400x アレクサフルオール 647 ファロイジンイン DMSO 0.32 Mスクロースを含むクレブスバッファー 50 μM ラトランクリン A イン DMSO (ストックソリューション) 1 M KCl (ストックソリューション) 注意:ファロイジンは有毒(LD50 = 2mg / kg)であり、注意して取り扱う必要があります。グルタルアルデヒドの吸入は有毒であり、それはフームフードで処理する必要があります。</li>
	<li>長期保存のために-20 °Cで4°CおよびファロイドンおよびラトランクリンAで緩衝液を貯えてください。 メモ: バッファの長期保存はお勧めしません。プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
</ol>2. 脳組織均質化
<ol><li>陶芸器-エルベジェム ガラス管および氷上の害虫の均質化バッファーの10体積で凍結保存または分解されたばかりのラットの脳組織を均質化する。 注:最適な均質化は、脳組織のために手で15〜20ストロークの害虫によって達成される。正常な均質化はガラス管を通る懸濁液の滑らかな流れによって確認することができる。プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
	<li>ブラッドフォードアッセイ31を用いてホモジネート中のタンパク質濃度を決定する。 注:タンパク質推定のための代替自家製または商業アッセイも使用することができます。</li>
	<li>50 μLの体積で2-3 mgタンパク質/mLの濃度でクレブスバッファー内の均質化サンプルを希釈します。 注:いくつかの実験では、37°Cで2μMラトランクリンAまたはDMSO(コントロール)を1時間インキュベートします。このために、ホモジナートは48 μLのクレブスバッファに再懸濁され、2 μLの50 μMラトランクリンAまたは2 μLのDMSOが加えられました。さらに免疫ブロッティングのために、少量のサンプル(10 μg)をインキュベーション後に回収する。</li>
	<li>ホモジネートサンプル(セクション5)を固定します。</li>
</ol>3. 隔離された神経終末の準備
<ol><li>シナプトソームの調製 注: シナプトソーム用の代替プロトコル32,33も使用できます。<ol>
<li>遠心分離機脳は、4°Cで10分間1,200xgでホモゲネートする。 </li>
		<li>粗核分画であるペレットを捨てる。</li>
		<li>さらに遠心分離機(S1)をステップ3.1で得た12,000xgで4°Cで15分間用いた。</li>
		<li>上清(S2)を除去し、これは可溶性の細胞分画である。</li>
		<li>ステップ3.1.3で得られたペレット(P2)を再懸濁し、リサスペンション緩衝液中の粗シナプトソーム分画である。 注:再懸濁液の量は、開始組織の量と得られるペレットの量に依存します。例えば、150〜300mgの脳組織で始まる場合、得られたペレットを200μLの再懸濁液バッファーに再懸濁させることができる。</li>
		<li>0.85-1.0-1.2 Mショ糖の等しい量で作られた不連続なスクロース勾配に再懸濁された粗シナプトソームをロードします。 注:我々は通常、スクロース溶液のそれぞれ1 mLを使用します (150-300 mgの組織のために).これは、より大きな組織量に応じて変更することができます。不連続勾配は、超遠心チューブの内壁に押し付けられた25Gシリンジとショ糖層の優しい層を使用して作ることができます。</li>
		<li>遠心分離機は4°Cで2時間85,000xgで。 注:遠心分離の高速のため、加熱を減らすために真空を作成することができる超遠心分離機が必要です。</li>
		<li>200 μL のピペットチップを使用して、1.0 M と 1.2 M のスクロースの間のインターフェイスでシナプトソーム分画を収集します。</li>
		<li>シナプトソーム分率を氷冷洗浄バッファーで18,000 x gで10分間4°Cで10分間洗浄します。 注:洗浄のために、1.0および1.2 Mのスクロースの界面で得られたシナプトソーム分画を新鮮な1.5mLチューブに集め、等量の洗浄バッファーを加え、培地から高いショ糖の除去を確実にする。</li>
		<li>シナプトソームペレットを、氷冷均質化バッファーで12,000 gで4°Cで10分間再度洗浄します。</li>
		<li>シナプトソームを氷上の均質化バッファーに再懸濁します。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
		<li>ブラッドフォードアッセイを用いてタンパク質濃度を決定します。</li>
		<li>50 μLの体積で2〜3mgのタンパク質/mLの濃度でクレブスバッファー内のシナプトソームを再中断する (シナプトソームが KCl によって脱分極化する場合は 47.5 μL; セクション 4 を参照)。 注意:再懸濁のために、シナプトソーム分画は、最初に4°Cで5分間12,000 x gで紡球され、上清(緩衝液)が除去されます。シナプトソームペレットは、200 μL ピペットチップを使用して穏やかなピペッティングを行い、クレブスバッファーに再懸濁します。</li>
		<li>脱分極を進めます(セクション4)。</li>
	</ol></li>
	<li>シナプトニューロソームの調製 注:シナプトニューロソーム用の代替プロトコル34、35も使用できます。<ol>
<li>1 mL シリンジを使用して、フィルターホルダーに 100 μm の細孔径のあらかじめ湿ったネットフィルターを通して脳ホモジネートを通過させます。 注:すべてのフィルタの事前湿潤は、サンプルの損失を避けるために重要であり、均質化バッファを使用して行う必要があります。このために、ホモジナイゼーションバッファーは、バッファーが流出するまで1 mLシリンジを使用してフィルタホルダ内のフィルタを通過する。</li>
		<li>氷の上に冷やされた1.5 mLチューブに濾液(F1)を集める。</li>
		<li>F1 分数に対して手順 (ステップ 3.2.1 および 3.2.2) を繰り返して、2 番目の濾過液 (F2) を取得します。</li>
		<li>5 μmの細孔サイズのネットフィルターを通してF2の濾液を渡す。</li>
		<li>氷の上に冷やされた1.5 mLチューブに濾液(F3)を集める。</li>
		<li>遠心分離機はF3を1,500 x gで4°Cで10分間濾液する。</li>
		<li>50 μLの体積で2〜3mgのタンパク質/mLの濃度で氷上のクレブスバッファー中のペレット(シナプトニューロソーム)を再懸濁する(シナプトソームがKClによって脱分極される場合は47.5 μL;セクション4参照)。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
		<li>ブラッドフォードアッセイを使用してタンパク質濃度を推定します。</li>
		<li>脱分極を進めます(セクション4)。</li>
	</ol></li>
</ol>4. 分離シナプス末端のKCl媒介脱分極化
<ol><li>シナプトソーム/シナプトニューロソームを37°Cで5〜10分間平衡化する。</li>
	<li>37 °Cで30 sの細胞外K+ を50mMに増加させ、それぞれの非刺激制御セットに等量のクレブスバッファーを加えるためにKClを加えることによってシナプトソーム/シナプトニューロソームを刺激する。 注:例えば、クレブスバッファの47.5 μLに再中断されたシナプトソームに1 M KClの2.5 μLを追加します。各非刺激制御シナプトソームに2.5μLのクレブスバッファーを加えます。多数のサンプルが関与する実験では、脱分極時間が30sを超えないように、一度に2個以下のサンプルを使用して進めます。</li>
	<li>グルタルアルデヒド(セクション5)を添加して刺激を終了する。</li>
</ol>5. 試料の固定とファロイジン染色
<ol><li>室温で2〜3分間の最終濃度2.5%にホモゲネート/シナプトソーム/シナプトニューロソームサンプルにグルタルアルデヒドを加えます。 注:50μLサンプル(ホモジネート/シナプトソーム/シナプトニューロソーム)中のグルタルアルデヒドの最終濃度が2.5%になるように、25%グルタルアルデヒド溶液の6 μLを添加しました。固定は重要であり、速く、グルタルアルデヒドを添加した直後に、サンプルは激しく渦を流す必要があります。</li>
	<li>サンプルを20,000 x gで5分間沈めます。</li>
	<li>上清を取り除く。 注:グルタルアルデヒドが有毒であるため、ヒュームフードに上清を捨てます。</li>
	<li>0.1%トリトンX-100と1 mg/mL NaHB4 を含むクレブスバッファーの100 μLで室温で2〜3分間再懸濁してペレットを透過させます。</li>
	<li>サンプルを20,000 x gで5分間沈めます。</li>
	<li>パーメビル化バッファーを取り外します。</li>
	<li>ペレットを200 μLのクレブスバッファーで200 μLで洗浄し、20,000 x g で 5 分間遠心分離します。</li>
	<li>クレブスバッファーの100 μLで1x Alexa Fluor 647ファロビン(500 μUに対応)でペレットを再中断して、室温で暗く10分間染色します。 注:他の種類の蛍光ファロイジンアナログは市販されており、アッセイ用に交換することができます。ファロイジンの濃度およびインキュベーションの総サンプル量は、検査対象の組織/サンプルの量と種類に応じて変更する必要があり、それに応じて最適な条件を標準化する必要があります。</li>
	<li>5分間20,000 x gで染色したサンプルを遠心分離します。</li>
	<li>非結合ファロイジン(上清)を取り除きます。</li>
	<li>200μLのクレブスバッファーでサンプルを20,000 x gで5分間遠心して洗浄します。</li>
	<li>0.32 Mショ糖を含むクレブスバッファの200 μLで再中断します。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
</ol>6. 蛍光分析と光散乱
<ol><li>黒い96ウェルの版でアレクサのFluor 647ファロジン染色されたサンプルを分配する。</li>
	<li>室温でプレートリーダーで645nmの励起波長と発光波長670nmの蛍光強度を測定します。</li>
	<li>200 μL ピペットチップを使用して、黒色の 96 ウェルプレートから透明な 96 ウェルプレートにサンプルを移します。</li>
	<li>540 nmで光散乱を測定し、固定、透過、染色の前のステップで発生した損失を修正します。 注: 染色されたサンプルに保持される生物材料の変動は、少量の開始物質の場合より顕著である可能性があります(説明を参照)。</li>
	<li>異なる濃度(0.05x、0.1x、0.25x、0.35x、0.75x、0.5xおよび1x)の異なる濃度のクレブスバッファーにAlexa Fluor 647ファロイジンのセットを標準として含める。 注:これはオプションのステップであり、特にF-アクチンレベルが相対的な方法で発現されている場合(セクション7)のアッセイの結果には影響しません。プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
</ol>7. データ分析
<ol><li>試料中のF-アクチンの量は、結合ファロイジンの蛍光強度に直接比例する。タグ付きファロイジン標準の直線曲線から計算されたファロイジン結合の単位の絶対換算での発現。 注: 例として、図 2A-B、3A、4A-B および補助図 2を参照してください。</li>
	<li>コントロールサンプルの一部としてF-アクチンレベルを発現する。 注: 例として、 図 5A-Bを参照してください。</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここで説明するアッセイは、本質的に改変を伴う以前の研究30から適応し、ファロトキシン、ファロイジンを蛍光標識でタグ付けして採用する。蛍光ファロイジンアナログは、固定組織47、48、49におけるアクチンフィラメントの染色に関するゴールドスタンダードであると考えられている。実際、それらはアクチンフィラメント50を特異的に識別するための最も古い用具であり、特に後続の蛍光顕微鏡法による分析のためにアクチンフィラメントを検出するために最も広く使用されている器械であり続ける。重要なことに、ファロイジンは短いアクチンフィラメント51の緩い不規則なメッシュ加工でも染色することが示されており、ファロイジン結合がフィラメント長に依存しないことを示している。一方、私たちのプロトコルは、蛍光分光法に依存して、げっ歯類やヒトの脳組織など...

細胞骨格タンパク質アクチンは、構造的なサポート、細胞輸送、細胞運動性および分裂を含む複数の細胞機能に関与している。アクチンは、単量体球状アクチン(G-アクチン)と重合糸状アクチン(F-アクチン)の2つの形態で平衡状態で発生する。アクチンの重合状態の急速な変化(G-とF-の間の相互変換)は、迅速なフィラメントアセンブリと分解をもたらし、細胞生理学におけるその調節の役割の根本となる。アクチンは神経細胞骨格構造の主要な構成要素を形成し、広範囲の神経機能1,2に影響を及ぼす。注目すべきは、アクチン細胞骨格はシナプス末端の構造プラットフォームの不可欠な部分を形成する。このように、シナプス形態形成および生理学の主要な決定要因であり、シナプス3、4、5のサイズ、数および形態の制御において基本的な役割を果たしている。特に、動的アクチン重合脱重は、記憶および学習プロセスの基礎となるシナプス可塑性に関連するシナプスリモデリングの重要な決定要因である。実際、シナプス前(例えば、神経伝達物質放出6、7、8、9、10)およびポストナプティック機能(可塑性関連動的リモデリング11、12、13、14など)の両方が、アクチン細胞骨格の重合状態の動的変化に大きく依存する。
生理学的条件下では、F-アクチンレベルは、翻訳後修飾4、15、16だけでなく、アクチン結合タンパク質(AMP)4、17を含むマルチモーダル経路を介して動的かつ緊密に調節される。AMPは、複数のレベルでアクチンダイナミクスに影響を与えることができ(例えば、重合の発芽または抑制、フィラメント分岐の誘導、フィラメントの小片への切断、脱重化の促進、脱重化からの保護など)、様々な細胞外および細胞内信号18、19、20に敏感な厳格な調節制御の下にある。複数のレベルでのこのような調節チェックは、シナプス細胞骨格におけるアクチンダイナミクスの厳格な調節を指示し、基底および活動誘発状態の両方で神経生理学の前および後のナプティックな側面を微調整する。
神経生理学におけるアクチンの重要な役割を考えると、神経変性、心理疾患、神経発達疾患3、21、22、23、24、25、26、27を含む神経疾患の広い範囲に関連する重要な病原性事象として、アクチンダイナミクスの変化の証拠を提供したいくつかの研究が驚くべきことではない。しかし、神経生理学や病態生理学におけるアクチンの重要な役割を指摘する豊富な研究データにもかかわらず、アクチンダイナミクス、特にシナプス細胞骨格の理解には依然として大きなギャップが残っています。より多くの研究は、病理学的条件下での神経アクチンとその変化のより良い理解を持っている必要があります。.この文脈における主な焦点領域の1つは、アクチン重合状態の評価である。ウエスタンブロッティングベースの商用キット(G-アクチン/F-アクチン in vivoアッセイ生化学キット;細胞骨格SKU BK03728,29)及びF-アクチンレベル6の評価のための自家製アッセイ。しかし、これらはF-アクチンとG-アクチンの生化学的分離を必要とし、その後の定量化は免疫ブロッティングプロトコルに基づいているため、時間がかかる可能性があります。我々は、F-アクチンの基底レベルの両方を評価するために使用できる修飾を用いて、以前の研究30から適応した蛍光分光法ベースのアッセイと、その組立分解の動的変化を報告する。特に、1 mLキュベットに適したサンプルを必要とするオリジナルのプロトコルを、現在の96ウェルプレート形式に効率的に変更しました。したがって、改質されたプロトコルは、アッセイに必要な組織/サンプル量を大幅に減少させました。また、このプロトコルは、脳組織の均質化だけでなく、単離シナプス末端(シナプトソームおよびシナプトニューロソーム)などの細胞内分画にも適しているという証拠を提供する。最後に、このアッセイは、解剖されたばかりのげっ歯類の脳組織と長期保存された死後のヒト脳サンプルに使用することができる。注意すべきは、アッセイは神経細胞の文脈において提示されるが、それらに関連する他の細胞型および生理学的プロセスに好適に拡張することができる。

<table><tbody><tr><td>3.5 mL、オープントップ厚壁ポリカーボネートチューブ</td><td>ベックマンコールター</td><td>349622</td><td>グラジエント遠心分離(シナプトソーム調製)</td></tr><tr><td>用 Alexa Fluor 647 ファロイジン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A22287</td><td>F-アクチン特異的リガンド</td></tr><tr><td>抗体 &nbsp;b-actin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-47778</td><td>イムノブロッティングによる総アクチンレベルの評価</td></tr><tr><td>GAPDHに対する抗体</td><td>Abcam</td><td>Ab181602</td><td>イムノブロッティングによるGAPDHレベルの評価</td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td>Bradford ベースのタンパク質推定</td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物 (CaCl2&middot;2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td>クレブス緩衝液成分</td></tr><tr><td>cOmplete、Mini、EDTAフリープロテアーゼ阻害剤 カクテル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4693159001</td><td>サンプル調製中の内因性プロテアーゼ活性の阻害用</td></tr><tr><td>Corning 96ウェル クリアフラットボトムポリスチレン</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>光散乱測定用</td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>クレブス緩衝液成分</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシ</td><td>ド Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td>ファロイジンおよびラトランキュリン用溶媒</td></tr><tr><td>蛍光フラットベッドスキャナー (Odyssey Infrared Scanner)</td> <td>Li-Cor Biosciences</td><td></td><td>イムノブロット上の免疫反応性シグナルの検出用</td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド溶液 (水中25%) グレードII</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td>固定剤</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>サンプル調製用緩衝成分およびクレブス緩衝液成分</td></tr><tr><td>ラトランキュリンA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5163</td><td>アクチンフィラメントの解重合剤</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物 (MgCl2&middot;6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>クレブス緩衝液成分</td></tr><tr><td>マイクロプレート</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイテックスメンブレンフィルター 5mm</td><td>ミリポア</td><td>LSWP01300</td><td>シナプトニューロソームの調製</td></tr><tr><td>Nunc F96 マイクロウェル ブラックプレート</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>237105</td><td>蛍光測定用</td></tr><tr><td>ナイロンネットフィルター 100mm</td><td>ミリポア</td><td>NY1H02500</td><td>シナプトニューロソームの調製</td></tr><tr><td>ホスファターゼ阻害剤</td>カクテル <td>IV Abcam</td><td>ab201115</td><td>サンプル調製中の内因性ホスファターゼ活性の阻害</td></tr><tr><td>塩化カリウム (KCl)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>クレブス緩衝成分およびシナプス末端の脱分極</td></tr><tr><td>リン酸カリウム 一塩基性 ((KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>クレブス緩衝液成分</td></tr> 水素<tr><td>化ホウ素ナトリウム (NaBH4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71320</td><td>透過化緩衝液成分</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (NaCl)</td><td>LabServ (サーモフィッシャーサイエンティフィック)BSPSL944</td><td></td> <td>クレブス緩衝液成分</td></tr><tr><td>炭酸水素ナトリウム (NaHCO3)</td><td>LabServ (サーモフィッシャーサイエンティフィック)</td><td>BSPSL900</td>クレ<td>ブス緩衝液成分</td></tr><tr><td>SpectraMax i3x</td><td>分子デバイス</td><td></td><td>蛍光測定用</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>S/8600/60</td><td>サンプル調製用緩衝成分</td></tr><tr><td>スイムネックス フィルターホルダー</td><td>ミリポア</td><td>Sx0001300</td><td>シナプトニューロソームの調製</td></tr><tr><td>ティッシュグラインダー 5mL ポッター・エルヴェイェム</td><td>デュラン・ウィートン・キンブル</td><td>358034</td><td>組織の均質化用</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>透過化バッファーの成分</td></tr><tr><td>Trizmaベース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td>サンプル調製用バッファー成分</td></tr></tbody></table>

げっ歯類とヒト脳組織におけるアクチン重合状態評価のための時間効率の高い蛍光分光法ベースアッセイ

A Time-Efficient Fluorescence Spectroscopy-Based Assay for Evaluating Actin Polymerization Status in Rodent and Human Brain Tissues

細胞骨格の主要成分であるアクチンは、神経の構造および機能の維持において重要な役割を果たす。生理学的状態では、アクチンは、単量体球状(G-アクチン)および重合糸状(F-アクチン)の2つの形態で平衡状態で生じる。シナプス末端では、アクチン細胞骨格が重要なシナプス前およびシナプス後機能の基礎を形成する。さらに、アクチン重合状態の動的変化(球状と糸状のアクチン間の相互変換)は、シナプス構造および機能における可塑性関連の変化と密接に関連している。我々は、 エクスビボ 条件におけるアクチンの重合状態を評価するための修飾された蛍光ベースの方法論をここに報告する。このアッセイは、アクチンフィラメント(F-アクチン)に特異的に結合するファロトキシンである蛍光標識ファロイジンを採用し、重合糸状アクチンの直接尺度を提供する。原理の証明として、げっ歯類と死後のヒト脳組織ホモジナートの両方にアッセイの適合性の証拠を提供する。ラトランクリンA(アクチンフィラメントを非重合する薬剤)を用いて、F-アクチンレベルの変化をモニタリングする際のアッセイの有用性を確認する。また、我々は、高細胞外K+での脱分極による刺激時のアクチン重合の増加を確認する単離シナプス末端の生化学的分画にアッセイを拡張する。

F-アクチンレベル評価のためのアッセイの直線性 まず、Alexa Fluor 647ファロイジンの蛍光の線形上昇に対する標準曲線を確認し、実験の各セットについて繰り返し行った(図1)。アッセイの線形範囲を調べるため、げっ歯類とは異なる量の脳均質(図2Aおよび2B)および事後ヒト被験者(図3Aおよび3B)が処理された。アッセイは、保持された標識ファロイジンの量によって評価されるタンパク質の50〜200 μgの範囲で線形であることが判明した。540nmでの光散乱は、異なる量のサンプルを確認するために使用した(図2Cおよび図3C)。
ラトランクリン...

げっ歯類やヒト被験者の脳組織から 生き生きとした 生体試料中のアクチンフィラメントを定量化するための、シンプルで時間効率の高い高スループット蛍光分析ベースのアッセイを報告する。

Actin, the major component of cytoskeleton, plays a critical role in the maintenance of neuronal structure and function. Under physiological states, actin ...

アクチンは細胞骨格の主要な構成要素であり、ニューロンを含む細胞形態および生理学のいくつかの側面を批判的に調節する。アクチンは、その2つの形態、単量体球状G-アクチンまたはポリマー糸状F-アクチンの間の平衡状態で生じる。アクチンの重合状態は、アクチン結合タンパク質と翻訳後の調節の両方によって、複数のレベルで厳しく調節されます。ニューロン間シナプス接点では、F-アクチンレベルの動的変化が重要な調節イベントであり、シナプス前およびシナプス後の両方の端末でシグナル伝達と可塑性を制御します。当然のことながら、アクチン機能不全はいくつかの神経病理学的状態に関連している。最近の進歩は、神経生理学と病態生理学におけるアクチンの豊富な知識につながっています。しかし、多くはまだ不明であり、焦点を当てる必要があります。この点で、ファロイジンの蛍光アナログはアクチン研究の主要なツールであることが証明されています。このファロトキシンは、具体的には糸状アクチンに結合し、したがって、F−アクチンの量、および病態生理学的状態におけるその変化の直接的な尺度として使用することができる。本研究は、脳組織からの卸売ホモジネートや生化学的に単離されたシナプス末端など、元生体試料におけるアクチン重合状態の評価に関する迅速かつ効率的な蛍光測定アッセイを提示する。なお、アッセイは、他の細胞および組織タイプおよびそれらの関連する生理学的現象に適用することができる。本研究で使用されるバッファーのレシピについては、詳細なテキストを参照してください。ラットまたはヒト被験者のいずれかからの脳組織サンプルは、10体積の均質化緩衝液中のポター・エルフェジェムガラス管および氷上の害虫で均質化された。シナプトソーム調製のために、ホモゲネートを、まず低速で紡糸し、次に高速で、粗シナプトソームミトコンドリア画分を得た。この粗分から濃縮シナプトソームは、不連続なスクロース勾配に続いて得られた。シナプトニューロソーム製剤の場合、ホモジナイートは、2つの100ミクロンと1つの5ミクロンフィルタを順次通過した。タンパク質推定はブラッドフォード試薬を用いて行い、サンプルは50マイクロリットルの最終体積でmLタンパク質あたり2〜3ミリグラムの濃度でクレブスバッファーで希釈した。単離シナプス末端の刺激は、シナプトソームまたはシナプトニューロソームのいずれかであり、37度で細胞外カリウムの30秒の短い増加によって行われた。このために、1つのモル塩化カリウムを、15ミリモルの最終濃度にサンプルに加えた。ホモジネートは、非刺激および脱分極性シナプス断片を2.5%グルタルアルデヒドで固定し、25%グルタルアルデヒドストック溶液の必要量を添加した。試料を室温で2分、3分間インキュベートした。固定剤は、20,000Gで5分間遠心分離により除去した。その後、0.1%トリトンX-100および1mgのmLナトリウムを含むクレブスバッファーでの再懸濁による透過性を室温で2〜3分間進行させた。透過バッファーを遠心分離によって再び除去し、ペレットをクレブスバッファーで表面的に洗浄し、1X アレクサフルオール647 ファロイジンを含むクレブスバッファーで再懸濁し、500マイクロ単位のファロイジンに対応した。結合を暗で室温で10分間進行させた。過剰な非結合ファロイジンを5分間20,000Gで遠心分離してサンプルから取り出し、ペレットをクレブスバッファーで表面的に洗浄し、シナプトソームまたはシナプトニューロソームの浮力を維持するために0.32モルスクロースを含むクレブスバッファーに再び再懸濁した。蛍光ファロイジン結合サンプルは、プレートリーダーでの透光測定用96ウェルブラックプレートに分配した。励起波長と発光波長はそれぞれ645ナノメートルと670ナノメートルに設定された。実験の各セットのために、我々は0.32モルショ糖を含むクレブスバッファにAlexa Fluor 647ファロイジンの異なる量を含んでいた。洗浄工程中のサンプルの損失を考慮して、サンプルを黒色から透明な96ウェルプレートに移した。その後、440ナノメートルでサンプルを採取した。蛍光ファロイジンの保持は、サンプル中のアクチンフィラメントまたはF-アクチンレベルの量に直接比例する。ファロイジン結合の直線性は、50〜200マイクログラムタンパク質の範囲で観察された。原理の証明として、我々はまた、ラトランクリンAによるアクチンフィラメントの薬理学的破壊を用いたF-アクチン脱重化モデルにおけるアッセイの有効性、ならびに単離シナプス末端のKCl媒介刺激によるF-アクチン形成の刺激を試験した。結合ファロイジンからの蛍光発光は、標準的な線形曲線から生成された結合ファロイジンの単位として表すことができる、および対照試料に対して相対的である。図4の場合、F-アクチンレベルは、結合ファロイジンのマイクロ単位として表される。一方、図5のF-アクチンレベルについては、脱分極化シナプス断片は、対照非分極サンプルに対して相対的に発現される。我々は、アクチンフィラメント、またはF-アクチンの分析のための堅牢で時間効率の高い高スループットアッセイ、および96ウェルプレート形式に適した生理学的および病態生理学的状態におけるその変化について述べた。アッセイは、既存の代替プロトコルよりもはるかに高速であり、単独で、または既存の免疫学的化学およびウェスタンブロッティングベースのアッセイと組み合わせて、アクチン関連の研究に不可欠なツールとして役立つことができます。

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学ぶ 蛍光分光法ベースアッセイでげっ歯類とヒト脳組織のアクチン重合状態を評価する方法。高速・高スループットでF-actinを定量し、神経科学研究に応用可能です。

げっ歯類とヒト脳組織におけるアクチン重合状態評価のための時間効率の高い蛍光分光法ベースアッセイ

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