シロイヌナズナなどのうどんこ病感染表現型を正確に評価するための簡便かつ柔軟な接種法

うどんこ病は重要な植物病害です。疾患表現型を正確に決定するには、病原体の接種さえも必要である。既存の方法は非効率的であるため、このプロトコルを開発しました。

私たちの胞子接種方法は、簡単に均一な接種を達成でき、シンプルでスケーラブルです。したがって、うどんこ病を扱うラボでは、この方法を簡単に使用できます。研究者は、段ボール箱の上にメッシュを取り付けて、胞子の接種に使用することもできます。

胞子を取り除き、メッシュを通してそれらを磨く方法は重要なステップです。したがって、これをビデオで示すことは非常に役立ちます。このプロトコルでは、50マイクロメートルのナイロンメンブレンメッシュまたは48マイクロメートルのステンレス鋼メッシュのロールを入手してください。

大きなサイズの中密度合板を24.5X10インチと12X10インチの小片にカットして接種ボックスを作ります。メッシュで取り外し可能な上蓋を作るには、長い木製の四角いダボを26インチと12.75インチの2つのセットにカットします。箱の周りに収まるように4つの部分を接着して釘付けします。

アクリルシートを取り、8つのコーナークランプを使用して、すべてのアクリルシートを箱に組み立てます。箱のアクリルシートの前面にある7X2インチの開口部の窓を切り取ります。新鮮なうどんこ病胞子を接種菌として調製するには、摂氏22度、相対湿度65%の成長チャンバーで6〜8週間、きれいなシロイヌナズナ免疫不全pad4-1変異植物を育てます。

標準的なフラットで感染表現型を決定するために植物を育てます。pad4-1植物の1つまたは半分を接種して、十分な新鮮なうどんこ病胞子を作成します。感染した植物からの新鮮な胞子が利用可能になったら、感染検査のために接種室内の接種ボックス内に植物のフラットを移動します。

重度に感染したシロイヌナズナの葉を15〜20枚切り、凝縮水がある場合は乾燥させます。一対の長い鉗子で片手で1〜2枚の葉を逆さまに持ちます。次に、両手をチャンバーの開口部に通し、接種ボックスに取り付けられたメッシュの上に葉をゆっくりと動かしながら、ハサミで鉗子の腕をそっと叩きます。

細かいファンブレンダーブラシで胞子を磨き、メッシュ表面全体をさまざまな方向にブラシで塗り、胞子を植物に均一に分布させます。ブラシでメッシュを数回軽くたたいて、メッシュに付着した胞子を振り落とします。胞子が落ち着いたら、接種植物が入っているフラットを接種ボックスから移動します。

フラットをプラスチック製のドームで覆い、摂氏22度、相対湿度65%の成長チャンバーに入れます。疾患の表現型は、接種後5日または8〜12日で実施することができる。段ボール箱を接種箱に変換するには、箱の上面と下面を取り外し、角をテープで固定し、接着剤で上部に50マイクロメートルのメッシュを取り付けます。

植物が入っているフラットを接種チャンバー内に移動し、小さな接種ボックスをフラットの上に置いて植物を覆います。次に、胞子を取り除き、磨きます。ペトリ皿より少し大きいミニ接種ボックスを作ります。

プレートは、使用するまで冷蔵庫に摂氏4度で保管してください。テストする各植物について、葉柄の根元から1つか2つの完全に拡張した葉を切り取ります。剥離した葉の葉柄を30度の角度で寒天培地に挿入します。

接種チャンバー内に葉を接種し、蓋付きのプレートを成長チャンバーに移動します。感染表現型を評価するには、接種後4〜5日で葉を新鮮な無菌MS寒天プレートに移します。葉を新鮮な寒天培地に挿入する前に、葉柄の付け根を切ります。

接種後8日または9日で疾患の表現型を評価します。顕微鏡分析では、フラットの底にある顕微鏡スライドに胞子の均一な分布が示されました。光接種後に6つの異なる場所に分布した胞子の計算密度は、有意差を示さなかった。

胞子を大量に接種した後も同様の結果が得られました。接種均一性を、重接種後12日目に異なる植物遺伝子型間で調べた。pad4-1植物は、野生型植物であるコロンビア0と比較して病害感受性を高めた。

新鮮な胞子は除去しやすく、コロニー形成を確立する可能性が高いため、接種後約10日で生産される適切な新鮮な胞子を感受性植物に使用することが重要です。うどんこ病は植物の表皮細胞にのみコロニーを形成します。表皮を剥離することによるうどんこ病感染細胞の単離、またはレーザーマイクロダイセクションは、宿主応答のより標的を絞ったトランスクリプトームおよびプロテオミクス研究を可能にします。

この方法は、研究者がうどんこ病感染表現型をより効率的に決定するのに役立ち、したがって、植物のうどんこ病相互作用に関するより効果的な機能研究を促進するはずです。