急性マウス膵臓組織スライスにおけるカルシウム動態の共焦点レーザー走査顕微鏡

生細胞カルシウムイメージングと組み合わせることで、急性膵臓組織スライス技術は、細胞間波と多細胞機能的接続性を長期間にわたって高解像度で研究することを可能にします。この技術の主な利点は、高速であり、組織構造を維持し、組織の高収率を維持しながら、限られた酵素的および機械的ストレスを低減することである。疾患進行中の機能的および形態学的変化を検出することにより、この技術は、糖尿病などの膵臓関連疾患の理解に役立つ。

この組織スライス技術は、細胞間接触の保存、パラクリン相互作用、および組織構造に重点を置いて、脳、下垂体、および副腎組織に適用することができる。マウス膵臓へのアガロースの注射を準備するには、5ミリリットルのシリンジに摂氏40度の液体アガロースを充填し、シリンジに30ゲージの針を装備する。針をキャップで慎重に覆った後、シリンジの針の端を下にして、アガロースの全量を水面の下に、摂氏40度の水浴に入れます。

細胞外溶液のボトルをカルボゲンで連続的に、氷上で連続的に、気圧および室温で毎分1.5ミリリットルで泡立て、酸素化およびpH7.4を確実にする。アガロース注射を行うには、安楽死させた成体マウスを実体顕微鏡下に置き、開腹術を介してマウス腹部にアクセスした。腸を左側に静かに動かして総胆管を露出させ、鉗子を使用してダクトの十二指腸端をわずかに持ち上げてVaterの乳頭を見つけます。

ヘモスタットを使用して十二指腸乳頭の胆管をクランプし、ダクトから十二指腸へのアガロースの漏れを防ぎ、小さな鋭い鉗子を使用して総胆管の下に到達し、ダクトを膵臓組織に取り付ける膜を壊します。ダクトからできるだけ多くの脂肪および結合組織を除去した後、ダクトを一対の大きな鉗子の先端に垂直に置き、シリンジプランジャーをしっかりと押して、粘性液体アガロースを総胆管の近位端に20〜30秒間注入する。組織が白っぽくなり、わずかに傾いたら、シリンジを外し、泡立った氷冷細胞外溶液20ミリリットルを膵臓にゆっくりと注ぎ、組織を冷却し、アガロースを硬化させる。

膵臓組織スライスを取得するには、鉗子と細かいタフカットハサミを使用して、アガロース注入した膵臓を40ミリリットルの氷冷細胞外溶液を含む100ミリメートルのペトリ皿に静かに移します。皿を旋回させて組織をすすぎ、膵臓を氷冷した細胞外溶液の2番目の皿に移す。鉗子とハサミを使用して、白っぽくよく注入された膵臓部分を最大6つの0.1〜0.2立方センチメートル片に切断し、組織片から残りの結合組織および脂肪組織を除去する。

洗浄したブロックを、摂氏40度の液体アガロースを約5ミリリットル含む35ミリメートルの非粘着性の底のペトリ皿に入れ、直ちに氷の上にペトリ皿を置く。アガロースが固まったら、100ミリメートルのペトリ皿のふたの上にペトリ皿を逆さまに持ち、カミソリの刃の半分を使ってペトリ皿の側壁とアガロースの間の余白に慎重に切り込み、皿からアガロースを取り除きます。カミソリの刃を使用して、解放されたアガロースからアガロースの1つの組織ブロックを含む個々の立方体を切断し、シアノアクリレート接着剤を使用してブロックをビブラートームのサンプルプレートに取り付けます。

ビブラトームの切断チャンバを、カルボゲンで連続的に泡立てた150ミリリットルの氷冷細胞外溶液で満たす。サンプルプレートをビブラトームにネジで固定し、新しいカミソリの刃を取り付けます。チャンバーを氷で囲み、6ミリモルのグルコースを添加した細胞外溶液で作られた2つの10ミリリットル容量のアイスキューブを加える。

スライサーを毎秒 0.05 ~ 1 ミリメートル、70 ヘルツに設定し、スライスを開始して、表面積が 20 ~ 100 平方ミリメートルの厚さ 140 ミクロンのアガローススライスを取得します。細かいペイントブラシを使用して、6ミリモルのグルコースを添加した40ミリメートルのHEPESバッファーで満たされた100ミリメートルのペトリ皿に各スライスを慎重に移します。カルシウム色素調製の場合、50マイクログラムの細胞透過性カルシウム指示色素、7.5マイクロリットルのDMSO、および2.5マイクロリットルのポロクサマー、および6.667ミリリットルのHBSを15ミリリットルのスクリューキャップチューブに溶解する。

ピペットを使用して溶液を20秒間十分に混合した後、チューブを超音波浴槽に沈め、それぞれ30秒間ボルテックス処理します。次いで、得られたカルシウム指示色素溶液の3.333ミリリットルを、標識される組織の10スライス当たり1つの5ミリリットルのシャーレにアリコートする。染料ローディングのために、薄い柔らかいペイントブラシを使用して、染料溶液の各皿に最大10個の組織スライスを移し、室温で50分間、光から保護された毎分40回転の間、皿をオービタルシェーカーの上に置きます。

インキュベーションの最後に、染色されたスライスを最大20個まで、色素を含まないHBSで満たされた個々の60ミリリットルのペトリ皿に移す。共焦点顕微鏡によるカルシウムイメージングでは、20倍または25倍の倍率を選択し、取得モードをタイムラプスイメージングに、ピンホールを100〜200ミクロンに設定し、実験に使用した蛍光色素分子の励起および発光を設定します。記録チャンバと灌流システムを顕微鏡の温度制御ステージに取り付け、入口と出口を記録チャンバの遠端に配置します。

流入速度と流出速度を毎分1〜2ミリリットルに設定します。輸液系の温度を摂氏37度に設定し、非刺激溶液で氾濫を開始する。組織のカルシウム動態を記録するには、単一の組織スライスを記録チャンバに入れ、張り詰めたナイロンメッシュでU字型の白金重量で組織を固定化します。

明視野オプションを使用して目的の構造を特定し、ライブイメージングを使用して調査した構造を視野に配置します。信号対雑音比を最適化するには、レーザー出力を最小限に抑えながら、レーザー出力、検出器増幅、ライン平均ビニングを調整します。焦点面を切断面から 15 ミクロン下方に調整して、損傷した可能性のある細胞からの記録を避け、画像を取得します。

サンプリング周波数を1~2ヘルツに設定して、個々の振動を初期検出し、高解像度の画像を記録します。利用可能な場合は、オンラインチャートを使用して、試料作製応答、照明過多、フォトブリーチング、および機械的ドリフトに関するフィードバックを即座に取得します。すべての画像が集録されたら、後で分析するためにデータを保存します。

ここで最適な組織スライスの一例は、細胞透過性カルシウム指示色素が膵臓組織スライスに正常に装填された状態で観察することができる。対照的に、これらの組織スライスは、色素浸透の失敗、膵島細胞の欠如、またはサンプル表面上の壊死組織の豊富さのいずれかのために、イメージングに最適ではない。膵臓組織スライスの高解像度画像を使用して、ランゲルハンス島、腺房組織、または膵管などの膵組織の別個の領域を描写することができる。

刺激は、異なる膵島細胞間、または膵島細胞と非膵島細胞とを機能的に区別するために使用することができる。例えば、ベータ細胞は、典型的には、細胞内カルシウムの一時的な増加に続いて持続的なプラトー上での速いカルシウム振動を示すことによって、正方形パルスグルコース刺激に応答する。対照的に、非ベータ細胞はより速く、より不規則な振動で応答する。

刺激後の細胞内カルシウム増加の発症の遅延、ならびに個々の細胞間の不均一性および遅延も測定され得る。同じパラメーターを使用して、非アクティブ化フェーズを記述できます。ここでは、細胞内カルシウム振動持続時間、周波数、および活性時間の割合の概略的な提示が観察され得る。

10ヘルツを超える取得速度で撮像すると、膵島全体に繰り返し広がるカルシウム波をはっきりと認識することができます。膵臓に入っている枝を誤って閉塞しないように、総胆管をできるだけ十二指腸に近づけます。また、注射中はアガロースが針の中ですぐに固まるので、プランジャーを押し下げるのをやめないでください。

急性マウス膵臓組織スライス技術は、パッチクランプ法とともに使用して、イオンチャネル電流を研究し、細胞症にアクセスし、免疫組織化学研究および秘書研究を行うこともできる。