rx3:GFPトランスジェニックゼブラフィッシュを用いたライトシート顕微鏡による眼の形態形成の可視化
April 5th, 2021
ここでは、市販のライトシート顕微鏡および画像処理ワークステーションを用いて眼形態形成のタイムラプスイメージングを行い、得られたデータを解析するためのプロトコルが提供される。このプロトコルは、胚麻酔、低融解温度アガロースへの埋め込み、イメージングチャンバ内の懸濁、イメージングパラメータの設定、および最後に画像解析ソフトウェアを使用したイメージングデータの分析の手順を詳述しています。
私たちのプロトコルは、眼の形態形成のプロセスが正常および病理学的状態の両方でどのように起こるかについての視覚的およびリアルタイムの両方の情報を提供します。当社のプロトコルにより、Zスタックの迅速な取得が可能になり、データセット内の各3D画像間の時間が短縮されます。これは、眼の形態形成がどのように起こるかの時間的分解能の増加を提供する。
毛細血管内に胚を配置することは、単一のソマイト段階での球形のために困難な場合があるため、少なくとも1つが正しい向きにあることを確認するために、複数の胚を毛細血管にロードすることが重要です。受精後10時間でソマイトの存在をスクリーニングするには、胚を実体顕微鏡下に置き、蛍光アダプターを使用してrx3:GFP導入遺伝子の存在を確認する。3〜5個のGFP陽性単一ソマイト胚が同定されたら、微細な鉗子を使用して胚を装飾する。
胚をアガロースに埋め込むには、500マイクロリットルのE3胚バッファーを含む微量遠心チューブに胚を移し、1ミリリットル当たり168マイクログラムのトリカインを添加し、冷却されたが液体の2%低い融解温度のアガロースおよびE3バッファーを500マイクロリットルを穏やかに混合しながらチューブに加える。PTFEプランジャーを備えた1ミリメートルのガラスキャピラリーを使用して、アガロース包埋胚をキャピラリーに引き込み、室温で30〜60秒間アガロースを固化させます。次に、毛細血管をトリカイン補充E3バッファーのビーカーに入れます。
胚イメージング用のライトシート顕微鏡をセットアップするには、キャピラリーサンプルホルダーにキャピラリーを置き、ホルダーの金属ディスクの中央にある金属シースをクリックします。スリットがシースの端を向くように2つのゴム栓をシースに入れ、ゴム栓の中央を通って毛細血管をスライドさせます。マーカーが金属シースの基部に収まったら、金属製のキャップを使用してキャピラリーを所定の位置に固定し、白いマークが揃った状態で顕微鏡の上部にホルダーを置きます。
サンプルホルダーの蓋を閉じ、顕微鏡ソフトウェアインターフェースのキャピラリー位置ボタンをクリックします。エルゴドライブコントロールパネルを使用して、キャピラリーを目標のすぐ上に移動します。蓋を開けた後、胚を含むアガロースの断面が対物レンズの前の毛細血管底の下に垂れ下がるまでプランジャーを静かに押します。
「キャピラリーの位置」をオフにして「サンプルの検索」をクリックして、サンプルチャンバーのウェブカメラから顕微鏡対物レンズにビューを切り替え、このビューを使用してサンプルの位置をより正確に調整します。次に、サンプルの位置を特定し、取得タブに切り替えます。Z スタックと時系列のチェックボックスをオンにします。
集録モードパラメータウィンドウで、デュアルサイドライトシート設定を選択し、オンラインデュアルサイドフュージョンとピボットスキャンのチェックボックスをオンにします。連続をクリックして、胚のライブビューを取得します。チャンネルのウィンドウで、[488チャンネル]を選択し、レーザー出力を1に設定し、露光時間を7.5ミリ秒に設定します。
Ergo Driveコントロールパネルを使用して、眼球がカメラと直接向くまで胚の位置を調整し、眼球が十分に焦点を合わせるまでチャンネルパラメータの左右のライトシートを調整します。最初と最後のZ位置を、最後に検出可能な蛍光シグナルから約500マイクロメートル超えて設定し、[最適]をクリックしてステップサイズを0.477マイクロメートルに設定します。インキュベーションパラメータを設定するには、ペルチェユニットのチェックボックスをオンにして、温度を摂氏28度に保ちます。
時系列ウィンドウで、適切な実験頻度と時間間隔を選択して画像を取得します。[テストの開始] をクリックします。イメージセットを保存するフォルダを選択し、イメージプレフィックスを設定してから、「保存」をクリックしてイメージングを開始します。
画像解析を行うには、画像ファイルを適切な4D画像解析ソフトウェアプログラムにインポートし、4Dビューアキューブ、スケールバー、ビデオアイコンをクリックしてストーリーボードタスクバーを開きます。「キーフレームシーケンスを追加」を選択し、ビデオの再生時間を秒単位で指定します。[回転を作成]ボックスのチェックを外し、[時間の進行状況を使用してビデオに特定のタイムポイントを含める]をオンにします。
ストーリーボードを保存して、同じパラメーターを複数の画像セットに適用します。「ムービーをエクスポート」をクリックしてタイムラプスイメージングのビデオを保存し、ファイル名と場所、ビデオフォーマット、ビデオ解像度、フレームレート、データ解像度などのムービーエクスポート設定を指定します。必要に応じてタイムスタンプを追加し、[レコード] を選択します。
特定のポイントで回転ビデオを作成するには、先ほど説明したようにキーフレームシーケンスを追加しますが、[回転を作成]チェックボックスをオンにして、[時間の進行状況を使用]チェックボックスをオフにします。任意の方向と個々のポイントで高解像度の画像をレンダリングするには、4Dビューアでカメラアイコンを選択します。分析用のパイプラインを構築するには、フラスコを選択して分析パネルにアクセスし、[分析操作] メニューを開いて目的の操作のシーケンスを選択します。
青い三角形をクリックしてパイプラインを開始します。実行の最後に、ポップアップウィンドウでフィーチャー列をクリックして、目的のオブジェクトに関する情報を提供できるフィーチャーのリストを表示し、「エクスポート」をクリックしてデータをスプレッドシートにエクスポートします。この代表的な解析では、トランスジェニックrx3:GFP胚を、1つのソマイト段階から受精後24時間、合計14時間にわたって5分ごとに背側見晴らしの良い場所から画像化した。
観察されたように、この分析からキャプチャされた画像のパイプライン実行を実行すると、発育眼のマスクの生成が容易になった。眼野を2つの視小胞に分離すると、視床下部に寄与した前脳の第3のrx3:GFP陽性領域が観察され得ることに留意されたい。この情報はボリュームデータでも観察され、どちらの光学ベシクルでも観察されたものよりもはるかに小さいため、オプティックベシクルデータから簡単に分離できます。
この手順に続いて、追加の分析 (たとえば、画像データセット全体の個々の細胞の追跡など) を行うことができます。
概要
このプロトコルは、ライトシート顕微鏡を用いた眼の形態形成のタイムラプスイメージングの方法を概説しています。これには、胚の準備、イメージング設定、およびデータ分析の詳細な手順が含まれています。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 発生生物学
- イメージング技術
背景
- 眼の形態形成は、眼の発達を理解する上で重要です。
- タイムラプスイメージングは、動的な生物学的プロセスへの洞察を提供します。
- ライトシート顕微鏡法は、光毒性の影響を減らした高解像度のイメージングを可能にします。
- イメージング中の胚の向きは、成功の重要な要因です。
研究の目的
- 眼の形態形成を観察するための信頼性の高いプロトコルを開発すること。
- 発生プロセスのイメージングにおける時間的解像度を向上させること。
- 正常および病理学的状態の両方の分析を促進すること。
使用される方法
- 胚の麻酔およびアガロースへの埋め込み。
- イメージングにライトシート顕微鏡を使用すること。
- 特殊なソフトウェアを使用した画像取得と分析。
- 分析用のタイムラプス動画とデータパイプラインの作成。
主要な結果
- トランスジェニックrx3:GFP胚の14時間にわたる成功したイメージング。
- 主要な発生段階と構造の特定。
- 発達中の眼構造のマスクの生成。
- 視神経嚢の形成と関連する脳構造の観察。
結論
- このプロトコルは、眼の発達研究のための堅牢な枠組みを提供します。
- タイムラプスイメージングは、形態形成プロセスへの重要な洞察を明らかにすることができます。
- 将来の研究は、この方法論をさらに分析のために発展させることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
High-resolution, time-lapse lightsheet microscopy of rx3:GFP transgenic zebrafish embryos enables direct visualization of vertebrate ocular morphogenesis in vivo. This workflow provides quantitative, 4D datasets that support mechanistic de-risking and target validation for early-stage ophthalmic discovery. The approach facilitates predictive confidence in evaluating genetic or pharmacological perturbations impacting eye development, informing risk-adjusted portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables real-time visualization of eye field specification and morphogenetic events.
- Supports functional validation of candidate genes or pathways involved in ocular development.
- Facilitates mechanistic de-risking by quantifying developmental phenotypes under experimental perturbations.
- Provides high-content imaging data for hypothesis-driven target triage.
Screening & Assay Development
- Establishes a reproducible, quantitative imaging platform for phenotypic screening of genetic or compound libraries.
- Delivers standardized, high-throughput compatible datasets for downstream analysis.
- Enables robust assay development with minimized photobleaching and phototoxicity.
- Supports reliable evaluation of compound effects on ocular morphogenesis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns zebrafish ocular development with vertebrate disease models for translational relevance.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of developmental targets.
- Provides quantitative endpoints for assessing disease-relevant phenotypes and biomarker alignment.
- Supports risk-adjusted advancement of ophthalmic candidates based on in vivo developmental outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol integrates from early discovery through lead identification and preclinical validation in ophthalmic R&D pipelines.
- Discovery Biology: Quantitative 4D imaging supports hypothesis testing and pathway clarification in ocular development.
- Screening: Standardized imaging and analysis enable reproducible phenotypic screening and assay readiness.
- Analytics: Automated segmentation and feature extraction provide robust quantitative outputs for condition comparison.
- Translational Research: Disease-relevant zebrafish models bridge discovery and preclinical validation for ocular targets.
- Enterprise Reuse: The workflow is adaptable for diverse genetic, pharmacological, or environmental perturbation studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in ocular target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible imaging datasets for cross-team use.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient prioritization of ophthalmic programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement and de-risking of early-stage ocular assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, transgenics, and advanced microscopy.
- Needs access to lightsheet microscopy and 4D image analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization of imaging and analysis parameters for reproducibility.
- Adaptable to other developmental models with appropriate genetic markers.
- Embryo orientation and imaging throughput may limit scalability for large screens.
