Name: ヒト多能性幹細胞からの網膜オルガノイドの誘導 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: 学ぼう、ヒト多能性幹細胞から網膜オルガノイドを誘導する効率的なプロトコル。光受容体前駆細胞の産出を最適化し、網膜疾患モデリングや薬物スクリーニング、細胞移植治療への応用が可能です。

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502研究室のメンバーの技術サポートと原稿に関する有益なコメントに感謝します。この研究の一部は、北京市自然科学基金会(Z200014)および中国国家重点研究開発プログラム(2017YFA0105300)の支援を受けました。

この研究は、首都医科大学北京同仁病院の施設倫理委員会によって承認されました。H9 hESCはWiCell研究所から入手し、tdTomatoタグ付き細胞株に遺伝子操作しました。
1. ヒトROの生成
<ol><li>フィーダーフリー条件下でhESCを培養します。<ol><li>6ウェルプレートの1ウェルに1 mLの0.1 mg/mL試薬A(材料表)を37°Cでコーティングし、製造元の指示に従って少なくとも30分間コーティングします。1x106 hESCのアリコートを解凍します。 注:3 mLの予熱した試薬B(材料表)を準備し、凍結保存された細胞(1 mL)を3 mLの新しい培地に移します。hESCを単一細胞にピペッティングしないでください。</li>
		<li>200 x g で5分間遠心分離し、上清を除去します。</li>
		<li>細胞を2 mLの試薬Bで試薬Aコーティングプレートに播種し、2 mLの試薬Bを毎日交換します。継代細胞は約80%のコンフルエントに達したとき(通常約4日)。</li>
	</ol></li>
	<li>0日目<ol><li>培地Iを使用してhESCを単一細胞懸濁液に解離します(表1)。20%(v/v)ノックアウト血清置換(KSR)、0.1 mM MEM非必須アミノ酸溶液(NEAA)、1 mMピルビン酸、3 μM IWR-1-endo(IWR1e)、30 ng/mL COCO、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン(PS)、0.1 mM β-メルカプトエタノール、およびグラスゴーのイーグル最小必須培地(GMEM)を混合して、培地Iを調製します。 注:解離を開始する前に、培地Iを調製し、20 μM Y-27632を含む12 mLの培地Iを10 cmのペトリ皿に移し、500 μLの試薬C(材料の表)0.05 mg / mLの試薬D(材料の表)と20 μM Y-27632を1.5 mLチューブに移します。上記の工程を暗所で行うと、培地中の成分IWR1eが感光性となるようにする。</li>
		<li>事前に温めた1xダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)バッファーでhESCを洗浄します。</li>
		<li>調製した500 μL試薬(1.5 mL)チューブを追加し、hESCを37°Cおよび5%CO2で3.5分間インキュベートします。</li>
		<li>プレートの側面と底面を数秒間フリックして細胞を剥離し、ペトリ皿から調製した培地Iを500 μLずつhESCプレートに加えます。 注:900 μLの1x DPBSを含む1.5 mLチューブを準備し、血球計算盤を使用して細胞カウントを行います。</li>
		<li>新しい1.5 mLチューブで細胞を回収し、細胞懸濁液を上下にピペットで動かし、チューブから100 μLを取り出し、細胞カウントのために900 μLのDPBSを入れたチューブに加えます。</li>
		<li>残った900 μLの細胞懸濁液を分散させ、ペトリ皿で調製した培地Iで細胞を9 x 104 細胞/mLに希釈します。 注:培地の全容量は12mLです。1.08 x 10 合計6 個のセルが必要です。</li>
		<li>非接着性V底96ウェルプレートの各ウェルに100 μLの細胞懸濁液を追加します(材料表)。 注:マルチチャンネルピペットを使用して時間を短縮し、各ウェルに同等の細胞番号が含まれていることを確認してください。100μLの部分を取り除く前に、毎回ペトリ皿を振ってください。細胞が均一に分布していることが重要です。</li>
		<li>96ウェルプレートを低速シェーカーで5分間軽く回転させた後、37°C、5%CO2でインキュベートします。 注意: プレートを暗所に保管してください。曜日を 0 日目に設定します。</li>
	</ol></li>
	<li>2日目<ol><li>1%試薬A(材料表)を追加します。2 mLの培地Iに133.4 μLの試薬Aを加えて、試薬A(タンパク質濃度10 mg/mL)を調製します。 注:完全で均一な融解を達成するために、使用前に試薬Aを一晩4°Cに維持してください。製品情報に注意し、試薬Aのボトルごとに異なるタンパク質濃度であるため、試薬Aのタンパク質濃度を持っているために、会社の公式ウェブサイトでカタログ番号とロット番号を検索してください。タンパク質濃度が低い場合は、試薬Aの量を増やすと便利です。</li>
		<li>調製した試薬Aを20 μLずつ各ウェルに加え、中央に2回ピペットで留めて死細胞を散布します。 注:試薬Aと96ウェルプレートを涼しい条件下で維持し、氷上ですべての手順を完了します。プレートを暗所に置きます。</li>
	</ol></li>
	<li>2-12日目<ol><li>96ウェルプレートの底部を洗浄し、37°C、5%CO2 で6日目までインキュベートします。6日目に、各ウェルから58 μLの培地を除去し、60 μLの培地Iを加えて、培地の半分を交換します。 注意: マルチチャンネルピペットを使用して、ハーフメディウム交換を完了します。このステップを穏やかに実行して、セルペレットがウェルから除去されないようにします。培地をきれいな10cmのペトリ皿に吸引します。内部にセルペレットがある場合は、96ウェルプレートに戻します。</li>
	</ol></li>
	<li>12日目〜18日目<ol><li>12日目に培地を培地II(表1)に変更します。1%(v/v)試薬Aを用いて、10%ウシ胎児血清(FBS)、0.1 mM NEAA、1 mMピルビン酸、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン、0.1 mM β-メルカプトエタノール、100 nM SAG二塩酸塩およびGMEMを混合して、培地IIを調製します。冷暗所に保管してください。</li>
		<li>96ウェルプレートから15 mLのコニカルチューブで細胞ペレットを回収し、ペレットを室温で5分間自然に沈降させます。 注意: 気泡を避けるために、表面の下で培地とペレットをそっと取り除きます。</li>
		<li>オルガノイドの世話をしながら上清を取り除きます。細胞凝集体を、試薬Aを含む18 mLの調製培地IIを含む10 cmの懸濁皿に移します。 注:試薬Aは4°Cである必要があるため、準備した培地IIを事前に10cmディッシュに加えないでください。</li>
		<li>37°C、5%CO2 で18日目までインキュベートします。</li>
	</ol></li>
	<li>18日目以降<ol><li>培地を培地IIIに変更します(表1)。10%FBS、1xサプリメント1、0.5 μMレチノイン酸(RA)、100 μMタウリン、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン、およびダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)/栄養混合物F-12の1:1混合物と混合液を混合して、暗条件下で培地IIIを調製します。</li>
		<li>18日目に、半透明の視神経小胞が生成されたら、顕微手術用ナイフを使用してオルガノイドを切断します。 注:オルガノイドを、通常は4つに、培地IIのペトリ皿で切断します。各ピースは、次の数週間で無傷の光学カップに成長するはずです。</li>
		<li>すべてのペレットを皿の中心に集約します。細胞を15 mLの円錐形の鷹管に収穫し、自然沈降させます。その後、上清をそっと取り除きます。 注:オルガノイドはサイズが大きいため、ペトリ皿を一方向に水平面上で90°数回回転させることにより、中心で凝集させることができます。</li>
		<li>ペレットを2つの10 cmペトリ皿に懸濁して分散させ、皿あたり18 mLの培地IIIを入れ、細胞凝集を避けるために皿をインキュベーターに静かに移します。培地IIIで37°Cおよび5%CO2 で培養を続け、毎週培地を交換する。発現したCRXを45日目以降および120日目まで、我々は光受容体のアウトセグメントを検出することができた。</li>
	</ol></li>
</ol>2. ヒトROの解析
<ol><li>FACS分析<ol><li>カットした1 mLチップを使用して、3つのCRX-tdTomatoと3つのH9 ES由来オルガノイドをディッシュから組み立てます。オルガノイドを1 mLの予熱(室温)DPBSで洗浄します。</li>
		<li>0.25%トリプシン-EDTA溶液と0.05 mg/mLの試薬Dを混合して消化バッファーを調製します。</li>
		<li>調製した消化バッファーを使用して、37°Cで8分間オルガノイドを単一細胞に解離します。 次に、10%FBSと0.05 mg/mLの試薬Dを含む同量のDPBSを加えて、反応を不活性化します。</li>
		<li>細胞を軽く懸濁および散乱させた後、100 μmのセルストレーナーを使用してろ過し、561 nm励起レーザーラインと780/60フィルターで蛍光活性化セルソーティング(FACS)システムを使用してCRX-tdTomato陽性シグナルを分析します。 注:CRXは最初に45日目に発現し、オルガノイドの成熟とともに増加します。各テストには1万個のセルが使用され、各時点に対して少なくとも3回の繰り返しが完了します。</li>
	</ol></li>
	<li>ROの蛍光強度定量<ol><li>イメージング用に生存可能なオルガノイドをランダムに調製します。 注:パラメータを設定し、すべての蛍光強度モニターに同じフィルターとパラメータを使用します。</li>
		<li>画像をキャプチャし、適切なソフトウェア(ImageJなど)を使用して平均蛍光強度を分析します。</li>
		<li>画像をインポートし、画像|を使用して8ビットに変換します タイプ。</li>
		<li>画像|によるデフォルトのパラメーターを使用してしきい値を調整します |を調整するしきい値。</li>
		<li>測定された領域を決定し、分析を使用してグレー値を評価し |測定します。 注:結果パネルの平均値は、測定領域の平均蛍光強度です。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Xie, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+accessibility+analysis+reveals+regulatory+dynamics+of+developing+human+retina+and+hiPSC-derived+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Chromatin accessibility analysis reveals regulatory dynamics of developing human retina and hiPSC-derived retinal organoids.</a> Science Advances. 6 (6), 5247(2020).</li>
<li>Lu, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Analysis+of+Human+Retina+Identifies+Evolutionarily+Conserved+and+Species-Specific+Mechanisms+Controlling+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Analysis of Human Retina Identifies Evolutionarily Conserved and Species-Specific Mechanisms Controlling Development.</a> Developmental Cell. 53 (4), 473-491 (2020).</li>
<li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Types+of+the+Human+Retina+and+Its+Organoids+at+Single-Cell+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell Types of the Human Retina and Its Organoids at Single-Cell Resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li>
<li>Jin, Z. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stemming+retinal+regeneration+with+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).</li>
<li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li>
<li>Pan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COCO+enhances+the+efficiency+of+photoreceptor+precursor+differentiation+in+early+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids.</a> Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 366(2020).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+cone+photoreceptors+through+simultaneous+inhibition+of+BMP%2C+TGFbeta+and+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling.</a> Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).</li>
<li>Deng, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Correction+Reverses+Ciliopathy+and+Photoreceptor+Loss+in+iPSC-Derived+Retinal+Organoids+from+Retinitis+Pigmentosa+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Gene Correction Reverses Ciliopathy and Photoreceptor Loss in iPSC-Derived Retinal Organoids from Retinitis Pigmentosa Patients.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).</li>
<li>Gao, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-Specific+Retinal+Organoids+Recapitulate+Disease+Features+of+Late-Onset+Retinitis+Pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Patient-Specific Retinal Organoids Recapitulate Disease Features of Late-Onset Retinitis Pigmentosa.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128(2020).</li>
<li>Zhang, C. J., Ma, Y., Jin, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+road+to+restore+vision+with+photoreceptor+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The road to restore vision with photoreceptor regeneration.</a> Experimental Eye Research. 202, 108283(2020).</li>
<li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 111 (23), 8518-8523 (2014).</li>
<li>Kuwahara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+ciliary+margin-like+stem+cell+niche+from+self-organizing+human+retinal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue.</a> Nature Communications. 6, 6286(2015).</li>
</ol>

網膜オルガノイドの分化は、十分な機能的な網膜細胞を生成するための望ましい方法です。このROは、神経網膜に向かう多能性幹細胞によって生成される神経節細胞、双極細胞、および光受容体などの異なる網膜細胞の複合体である4、5、8、9。コンフルエントなROを採取することはできますが、時間がかかり、長い培養期間(最大180日)が必要になる場合があります。しかしながら、光受容体移植のためには、コーンロッドまたはロッドコーンジストロフィーを研究したり、3D培養システム10において比較的高い割合の光受容体を得ることが有利である。
また、通常の発生過程を中断することなくオルガノイドの発生を監視することも困難です。そこで、主に視細胞前駆体で発現するコーンロッドホメオボックスタンパク質であるCRXを標的遺...

多能性幹細胞(PSC)は、自己複製とあらゆる種類の体細胞への分化能力を特徴としています。このように、PSC由来のオルガノイドは再生医療研究において重要な資源となっています。網膜変性は、光受容体(桿体および錐体)および網膜色素上皮の喪失を特徴とする。網膜細胞置換は、この病気の有望な治療法になる可能性があります。しかし、疾患の研究や治療のためにヒト網膜を入手することは現実的ではありません。したがって、多層の天然網膜細胞を効果的かつ首尾よく再現するPSC由来の網膜オルガノイド(RO)は、基礎研究およびトランスレーショナル研究に有益です1,2,3。私たちの研究は、網膜変性を研究するための十分で質の高い細胞を提供するためにRO分化に焦点を当てています4。
ROを微分する方法は絶えず出現しており、2012年に笹井研究室によって3次元(3D)懸濁液分化が開拓されました5。ヒト胚性幹細胞(hESC)にCRX-tdTomatoタグを導入して視細胞前駆細胞を特異的に追跡し、Wnt、TGF-β、およびBMP経路の多機能アンタゴニストであるCOCOを添加して方法を変更しました6。COCOは、光受容体前駆体および錐体の分化効率を効率的に改善することが示されている6、7。
全体として、古典的な分化法を変更することにより、ヒトROから豊富な光受容体前駆体および錐体を収集し、実験室での調査を通じて光受容体に関連する網膜疾患を分析し、さらなる臨床応用/移植を行うためのアクセス可能なプロトコルを開発しました。

<table><tbody><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>COCO</td><td>R&D Systems</td><td>3047-CC-050</td><td>DAN BMP拮抗薬のドメインファミリー</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>C141905005BT</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells</td><td>Biological Industry</td><td>04-002-1A</td><td></td></tr><tr><td>GMEM</td><td>Gibco</td><td>11710-035</td><td></td></tr><tr><td>ノックアウト血清交換-多種</td><td>Gibco</td><td>A3181502</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸溶液 (100X)</td><td>sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Primesurface 96 V-plate</td><td>Sbio</td><td>MS9096SZ</td><td>1.2.7</td></tr><tr><td>ピルビン酸の細胞凝集</td><td></td> 1.1.1 試薬 B StemCell 5990 mTeSR- E8 、 1.1.2 試薬 C Gibco 12563-011 TrypLE Express の 1.2 試薬 D Roche 11284932001 DNase I の 1.2 レチノイン酸 Σ R2625-100MG <td></td> の 1.1.1 BD 356231 Matrigel の Sigma S8636 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> 試薬 A BD <tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SAG</td><td>Enzo Life Science</td><td>ALX-270-426-M001</td><td></td></tr><tr><td>Supplement 1</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>N-2 Supplement (100X), 液体, medum III</td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>T-8691-25G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%), フェノールレッド</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>オルガノイド 2.1.3</td></tr><tr><td>Wnt 拮抗薬 I, IWR-1-endo の解離 - Calbiochem</td><td>シグマ</td><td>681669</td><td>Wnt阻害剤</td></tr><tr><td>Y-27632 2HCl</td><td>セレック</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト多能性幹細胞からの網膜オルガノイドの誘導

Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

網膜細胞移植は有望な治療アプローチであり、網膜構造を回復し、変性した網膜の視覚能力を安定または改善する可能性があります。それにもかかわらず、細胞補充療法の進歩は現在、高品質で標準化されたヒト網膜の既製の供給源を必要とするという課題に直面しています。したがって、実験には簡単で安定したプロトコルが必要です。ここでは、外因性分子と試薬Aを用いた自己組織化法と、3次元ヒト網膜オルガノイド(RO)を作製するための手動切除法に基づいて、最適化されたプロトコルを開発します。ヒト多能性幹細胞(PSC)由来のROは、光受容体に特異的なマーカーを発現します。多機能アンタゴニストであるCOCOを添加すると、視細胞前駆体および錐体の分化効率が大幅に向上します。細胞株と初代細胞の利点を持ち、後者に関連する調達の問題なしに、このシステムを効率的に使用することで、コンフルエントな網膜細胞、特に光受容体を生成することができます。したがって、PSCからROへの分化は、疾患モデリング、薬物スクリーニング、および細胞移植のための最適で生物学的に関連するプラットフォームを提供します。

模式図は、COCOで前駆細胞を改善するための分化プロトコルを示しています(図1)。PSCからROまで、多くの詳細が結果のばらつきを引き起こす可能性があります。手順全体を追跡するために、すべてのステップ、さらにはすべての媒体のカタログ番号とロット番号を記録することをお勧めします。
ここでは、6、12、18、および45日目の明視野画像を提供します(図2)。6日目のオルガノイドは、通常、96ウェルプレート内の直径約600 μmで、内部に密集した接続と明るい縁があります(図2A)。12日目に、視神経小胞様構造が最初に生成されます(図2B)。12日目から18日目まで、視神経小胞構造の存在は明らかであり、それらは18日目以降も成長し続けた。小胞様構造を持たないオルガノイドは廃棄されます(図2C)。3...

自己組織化法を用いて、光受容体の生成を大幅に増加させる可能性のあるCOCOを添加したプロトコルを開発します。

Retinal cell transplantation is a promising therapeutic approach, which could restore the retinal architecture and stabilize or even improve the visual ...

これは網膜疾患のモデルであり、生体内網膜をエミュレートします。ある程度、それは動物実験に取って代わる可能性があります。このプロトコルは、網膜オルガノイド中の光受容体前駆体の質と量に最適化されており、光受容体はいくつかの不可逆的な失明状態の鍵となります。まず、ヒト胚性幹細胞(hESC)をフィーダーフリー条件下で培養します。これを行うには、6ウェルプレートの1ウェルに1ミリリットルの試薬Aあたり1ミリリットルの100マイクログラムをコーティングし、プレートを摂氏37度で少なくとも30分間インキュベートします。100万hESCのアリコートを解凍し、200 xgで5分間遠心分離します。上清を除去した後、約4日で約80%のコンフルエントに達した後、2ミリリットルの試薬B.Passageとともに、細胞を以前にコーティングしたプレートに播種します。コンフルエントに達した後、予熱したDPBSで細胞を洗浄し、500マイクロリットルの新たに調製した試薬に移します。次に、摂氏37度と5%二酸化炭素で3.5分間細胞をインキュベートします。プレートの側面と底面を数秒間フリックして細胞を剥離し、500マイクロリットルの準備した培地を加えます。剥離した細胞を新しい1.5ミリリットルのチューブに回収し、細胞懸濁液を上下にピペットで固定します。細胞計数のために、900マイクロリットルのDPBSに100マイクロリットルの細胞懸濁液を加える。残りの細胞懸濁液の900マイクロリットルをペトリ皿内の培地1で希釈して、ミリリットルあたり9倍の10〜4パワーセルを達成します。100マイクロリットルの希釈細胞懸濁液を、非接着性のV底96ウェルプレートの各ウェルに加える。低速シェーカーでプレートを5分間軽く回転させ、摂氏37度、二酸化炭素5%で2日目までインキュベートします。2日目に、96ウェルプレートの各ウェルに20マイクロリットルの1%試薬Aを加え、中央で2回ピペットで死細胞を散布します。プレートの底をきれいにしてから、摂氏37度と5%の二酸化炭素で6日目までインキュベートします。6日目に、58マイクロリットルの培地を60マイクロリットルの新しい培地1と交換し、インキュベーションを続けます。12日目に、15ミリリットルのコニカルチューブ内の96ウェルプレートから細胞ペレットを回収し、ペレットを室温で5分間自然に沈降させます。ペレットが落ち着いたら、オルガノイドを乱すことなく上清を取り除き、細胞凝集塊を試薬Aを含む18ミリリットルの培地2を含む10センチメートルの懸濁皿に移し、18日目まで摂氏37度、二酸化炭素5%で培養します。18日目に、ディッシュ内の半透明視神経小胞の生成を確認し、マイクロサージカルナイフを用いて生成したオルガノイドを切断した。カットしたペレットをすべて皿の中央に集約します。次に、細胞を15ミリリットルの円錐形のファルコンチューブに収穫します。細胞が落ち着いたら、上清を静かに取り除き、1皿あたり3つずつ、18ミリリットルの培地を入れた2つの10センチメートルペトリ皿にペレットを再懸濁します。細胞凝集を避けるために皿をインキュベーターにそっと移します。細胞を培養し続け、毎週培地を交換します。45日目から120日目までのCRX発現を分析します。この代表的な解析では、ヒト網膜生成の様々な段階が表示される。6日目に、オルガノイドは直径約600マイクロメートルの明るい縁の内側に密集した接続の集合体として現れました。12日目に、視神経小胞様構造の初期生成が起こった。適切な小胞様構造を持たないオルガノイドは、18日目にペトリ皿で培養する前に廃棄されました。培養の30日目までに、小胞のような構造はより明白になり、劣ったROは簡単に区別して除去することができました。45日目から、オルガノイドはCRX、RCVRN、OTX2などの光受容体前駆体のさまざまなマーカーを発現しました。優れた網膜オルガノイドを切断することにより、分化効率が大幅に向上し、96枚のプレートから100を超える優れたオルガノイドを回収することができました。

directed-induction-retinal-organoids-from-human-pluripotent-stem

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医学

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ここでは、ヒトの多能性幹細胞株が再現性と効率の高い人工組織を生成するのに適した最適化されたレチナルオルガノイド誘導システムについて説明します。...

ヒト多能性幹細胞からの3Dレチナル組織の導出のためのレチナルオガノイド誘導システム

このプロトコルは、接着培養システムと浮遊培養システムの両方を含む簡略化された培養条件を使用して、hiPS細胞を眼野クラスターに分化させ、神経網膜オルガノイドを生成する効率的な方法について説明しています。RPEや角膜上皮などの他の眼細胞タイプも、網膜培養の成熟眼野から単離することができます。...

健常および網膜疾患特異的ヒト誘起多能性幹細胞からの網膜オルガノイドの作製

本プロトコルは、高い再現性と効率で網膜オルガノイドの接着と融合を減少させる最適化された3D神経網膜誘導システムについて説明しています。...

ヒト多能性幹細胞からの神経網膜の生成

このプロトコールは、ヒト多能性幹細胞を使用して血管オルガノイドを生成する方法を示します。...

ヒト人工多能性幹細胞からの血管オルガノイド作製

このプロトコールは、光学的透明化と免疫標識を組み合わせて、ホールマウント網膜オルガノイドの全容積共焦点イメージングを実現します。3D構造を保持し、主要なニューロン経路の詳細な視覚化を可能にし、網膜の成熟、空間構成、および疾患モデリングや個別化医療への応用の可能性の研究を改善します。...

細胞分解能によるホールマウントRetinal Organoidの可視化

のいずれかを使用して人間の歯髄幹細胞（hDPSCs）の単離および特性を説明する方法...

単離、特徴付けと二つの異なる方法を使用して永久歯に由来するヒト歯髄幹細胞の分化の比較

直接ヒト組織からがん幹細胞（CSCが）の単離は、それらの生物学的特性評価のために必要である。また、難しい手順のトラブルシューティングのヒントを提供しながら、この原稿は、ヒト組織からの前立腺のCSCを単離するための方法論を説明します。...

ヒト前立腺癌サンプルからがん幹細胞の単離

学ぼう、ヒト多能性幹細胞から網膜オルガノイドを誘導する効率的なプロトコル。光受容体前駆細胞の産出を最適化し、網膜疾患モデリングや薬物スクリーニング、細胞移植治療への応用が可能です。

ヒト多能性幹細胞からの網膜オルガノイドの誘導

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