Name: 成人マウス味幹細胞由来の舌下オルガノイドの生成と培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: 学ぶ成人マウス味幹細胞由来の舌下オルガノイド生成法。FACSでLgr5陽性細胞を分離し、WENRAS培地で培養することで、味細胞の発生と再生をin vitroで効率的にモデル化し、創薬スクリーニングに応用可能です。

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著者らは、WNR条件付きメディアと貴重な議論を提供してくれたピーター・デンプシー博士とモニカ・ブラウン(コロラド大学アンシュッツ医療キャンパスオルガノイドと組織モデリング共有リソース)に感謝したいと考えています。また、コロラド大学がんセンターの細胞技術とフローサイトメトリー共有リソース、特にドミトリー・バトゥリンの細胞選別の専門知識に感謝します。この作品は、次の資金を提供しました: NIH/NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1、DC012383-S2、NIH/NCI R21 CA236480からLABへ、R21DC016131およびR21DC016131-02S1からDG、およびF32 DC015958からEJGへ。

すべての動物の手順は、実験動物のケアと使用ガイド、動物福祉法、公衆衛生サービスポリシーに従ってAAALAC認定施設で行われ、コロラド大学アンシュッツ医療キャンパスの施設動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されました。このプロトコルで使用されるLgr5EGFP-IRES-CreERT2 マウスは、ジャクソン研究所、ストック第008875からである。
注:プロトコルのスムーズかつタイムリーな進行を確実にするために、次の手順を開始する前に完了する必要があります:37 °Cに水浴を設定し、 遠心分離機を4°Cに設定し、10mg/mLディスパス、コラゲナーゼ、エラスターゼストック溶液( 材料表を参照)から注入と解離酵素溶液を作り、-20°C冷凍庫(48ウェルプレートに必要な約750 μL)からマトリックスゲルを取り除き、氷にバイアルを浸して解凍します。少なくとも3〜4時間、希釈されていないFBSのプレコートマイクロ遠心チューブを、少なくとも30分間室温で穏やかに揺動させることで(組織採取用の2つの2つの2mLチューブ、解離された細胞用の2つの1.5mLチューブ、および細胞ソーターからの単一細胞の収集のための1つの1.5 mLチューブ;使用前に余分なFBSを除去する)。
1. CVP上皮の単離
注:フル48ウェルプレートに十分なLGR5+セルを得るために、同じチューブに3つのLgr5-EGFP CMPを収集し、同時に処理します。重要なのは、少なくとも1つの野生型のリッターのCVPを別のチューブで並行して収穫して処理し、FACSパラメータを設定するためのゲート制御としてそれを利用する(代表的な結果を参照)。
<ol><li>IACUCの規則に従ってCO2 窒息でマウスを安楽死させ、続いて両側性回膜切除術、頸椎脱臼、切断、または排泄などの承認された二次的方法を行う。</li>
	<li>大きな無菌解剖はさみを使用して頬を切断し、顎を壊します。舌を持ち上げ、舌を切り取り、舌を口腔の床から分離します。舌を切り取り、無菌の氷冷ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(dPBS)でCa2+ とMg2+を収集します。</li>
	<li>カミソリの刃で間臼歯の前部を切り取ることによって前舌を取り除き、捨てる(図1A、破線)。後舌から髪と余分な液体を取り除くために繊細なタスクワイプを使用してください。</li>
	<li>1 mL シリンジに200-300 μLの注射酵素溶液(最終濃度:2 mg/mL-I コラゲラーゼ、5 mg/mL ジスパーゼ II を Ca2+/Mg2+-dPBS で充填し、 10 mg/mL ストック溶液から希釈し、CVP(図1B、1B、)の前部になるまで、30 G x 1/2 針をインターモルエミデンス (図 1B、黒矢印) のすぐ上に挿入します。 ブラックボックス)。下の下の、下のCVPの側端に酵素溶液を注入し、下皮と下層組織(層状層、筋肉)の間に。注射が行われると、ゆっくりと、継続的に舌から注射器を引き出します。</li>
	<li>正確に33分間室温で無菌Ca2+/Mg2+フリーdPBSで舌をインキュベートします。</li>
	<li>上皮に二国間で小さな切り傷を加え、余分な細かい解剖はさみを使用してCVPの前部に切り、細かい鉗子で持ち上げて上皮をそっと剥がします。トレンチ上皮が下層の結合組織から解放されたら、FBSであらかじめコーティングされた空の2 mLマイクロ遠心チューブに入れる。CVP上皮を剥離する前または後に上皮のトリミングを行います(図1C,D)。</li>
</ol>2. CVP上皮の解離
注: CVP 上皮とめっきの解離は 図 2にグラフィカルに表されています。
<ol><li>解離酵素カクテル(最終濃度:2mg/mLタイプIコラゲターゼ、2mg/mLエラスターゼ、および5mg/mLディスパーゼIIをCa2+/Mg 2+含有dPBSで、10mg/mLストック溶液から希釈)を皮をむいたCVPエピテリア(CVPあたり200μL)を含むチューブに加えます。37°Cの水浴で45分間インキュベートします。渦は15分ごとに短時間。 注:プレウォーム0.25%トリプシン-EDTAは、酵素カクテルインキュベーションの最後の15分の間に37°C水浴中に。</li>
	<li>インキュベートに続いて、渦(3パルス)をガラスパスツールピペットで1分間トリチュレートします。組織片が沈着した後、ピペットは解化細胞の最初のコレクションを含む上清を、遺伝子型に対応する新しいFBSコーティングされた1.5 mLマイクロ遠心分離管に入る。残りの組織片をさらに工程2.3に記載されるように処理する。以下に。<ol>
<li>上清を370xgで5分間、ペレット細胞に4°C回転させます。</li>
		<li>得られた上清を除去し、蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)バッファ(1 mM EDTA、25 mM HEPES(pH 7.0)および1%FBSのCa2+/Mg2+-free PBS(CVPあたり50 μL)で細胞ペレットを再懸濁します。氷の上に保管してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ステップ2.2.1および2.2.2を実施しながら、ステップ2.2から残りの組織片を解離し、前もって加えた0.25%トリプシン-EDTA(CVPあたり200μL)を元の2mLマイクロ遠心チューブに加え、37°Cの水浴に30分間インキュベートします。渦は10分ごとに短時間。</li>
	<li>インキュベーションに続いて、組織片(3パルス)を含むチューブをボルテックスし、ガラスパスツールピペットで1分間トリチュレートします。組織片が沈着した後、ステップ2.2.2から細胞を含む1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに上清をピペットする。残りの組織片を含むチューブを捨てます。<ol>
<li>370 x g で 5 分間解約した細胞と 4 °C の細胞をペレットセルにスピンします。</li>
		<li>FACSバッファ(CVPあたり100 μL)の上清を取り除き、細胞ペレットを再懸濁します。氷の上に保管してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>30 μm ナイロン メッシュフィルタを通してセルを通過し、FACS の前に DAPI (λ放出= 450 nm) をセル混合物に追加します。緑色蛍光タンパク質チャネル(λ励起= 488 nm;λ放出=530nm)を使用してFACSを介してLgr5-GFP+細胞を単離する。100 μm のノズルを使用して、300 μL の Ca2+/Mg2+フリー dPBS を含む新しい FBS コーティングされた 1.5 mL マイクロ遠心チューブに細胞を並べ替えます。めっきするまで氷の上に細胞を置きます。</li>
</ol>3. Lgr5-EGFP細胞のめっき
<ol><li>フローサイトメーターから受け取ったLGR5+細胞懸濁液の体積を決定します。</li>
	<li>ソーターから得られた細胞数に基づいて、μL当たりの細胞数を計算します。次に、めっきに必要な数の細胞を得るために必要な体積を決定し(48ウェルプレートのウェルあたり200細胞を使用します)、その総懸濁細胞の体積を新しいマイクロ遠心チューブに移します。</li>
	<li>370 x g で 5 分間、ペレット細胞に 4 °C (ペレットが見えない場合があります) にチューブを回転させます。上清を取り除き、チューブを氷の上に置きます。</li>
	<li>適切な量のマトリックスゲル(48ウェルプレートの場合はウェルあたり15 μL)で細胞ペレットを穏やかに再懸濁します。ピペットを上下に緩やかにして、マトリックスゲルで細胞を完全に分配します。各ウェルの中央に15μLのマトリックスゲル/セル混合物を入れます。メッキ中にマイクロ遠心チューブを氷の上に50 mLの円錐チューブに入れたままにして、マトリックスゲルがゲル化するのを防ぎます。ウェル全体の細胞の均等な分布を確保するために、3つのウェルごとに上下にピペットを介してメッキ全体でマトリックスゲル/細胞混合物を混合し続けます。</li>
	<li>プレートをインキュベーター(37°C、5%CO2、湿度95%)に10分間置き、マトリックスゲル化を可能にします。次に、300 μL の室温 WENRAS + Y27632 培地を各ウェルに加え、プレートをインキュベーターに戻します。</li>
</ol>4. オルガノイドメンテナンス
注:オルガノイドは、組換えEGFおよびWnt3a、ノギン、およびR-spondin23を含む50%のコンディショニング培地を含む従来のオルガノイド培地(WENR)で増殖される。A8301およびSB202190は、培養期間の最初の6日間に対して、成長を最適化するために添加される(WENRAS培地)(図5)、次いで分化を促進するために除去される(WENR培地)20。Y27632は、生存を促進するために培養の最初の2日間に添加される。カルチャのタイムラインに関連するメディア条件を 図 4に示します。
<ol><li>めっきの2日後、1 mL ピペットを使用して各ウェルからWENRAS + Y27632培地を取り出し、クロスコンタミネーションを防ぎます。ウェルの側面に300 μLのWENRAS培地を加えて、マトリックスゲルを破壊しないようにします。プレートをインキュベーターに戻します。</li>
	<li>カルチャ段階に適したメディアを使用して、2 日ごとにメディアを変更します (図 4)。オルガノイドは、オルガノイドが収穫する準備ができている12日目まで維持します。</li>
</ol>5. RNA処理
<ol><li>RNA用オルガノイドの収穫<ol>
<li>48ウェルプレートを氷の上に30分間置き、マトリックスゲルを脱重化します。</li>
		<li>1 mL ピペットを使用して、オルガノイドメディアを引き上げます。次に、媒体がウェルに戻されると、ピペットの先端を使用して、マトリックスゲルを引っ掻いてさらに分解します。1つの管の3つの井戸の内容物をプールする1.5 mLのマイクロ遠心分離管に内容物を移す。室温で300×gで5分間チューブを遠心分離します。</li>
		<li>オルガノイドを除去することなく、できるだけ多くのメディア上清を除去する。その後、室温で300 x g で5分間チューブを再びスピンダウンします。</li>
		<li>残りの培地を取り出し、オルガノイドを350μLのリシスバッファー+βメルカプトエタノール(βME)(1mLのリシスバッファーあたり10 μL βME)で再懸濁します。サンプルを氷の上に置き、すぐにRNA抽出を行うか、-80°Cで保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>定量的RT-PCR分析<ol>
<li>分光光度計を介してRNA量を測定します。cDNA合成キットを使用してRNAを逆転写します。</li>
		<li>200 nM 事前検証されたフォワードプライマーとリバースプライマー(表1)と蛍光PCRマスターミックスを用いて、5 ng RNAに相当するcDNAを混合します。qRT-PCR反応を40サイクルで実行します:95°Cで15 s、60sの場合は60°Cを実行します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 免疫染色化学
<ol><li>オルガノイドの収穫と固定<ol>
<li>氷の上に48ウェルプレートを30分間置き、マトリックスゲルを緩めます。</li>
		<li>オルガノイド培地を取り出し、各井戸に400μLの氷冷PBSを加えます。その後、PBSを取り除き、400 μLの氷冷細胞回収液を各ウェルに追加します。4°Cで30分間静かに揺れる。</li>
		<li>PBSで1%BSAで1mLピペットチップをコーティングし、ウェルの内容物を上下に軽くピペットしてマトリックスゲルを分解します。オルガノイドを氷の上に置かれた1.5 mLマイクロ遠心分離管に移します。</li>
		<li>300 μL PBS + 1% BSA でそれぞれを十分にすすい、残りのオルガノイドを対応するチューブに移します。各チューブから細胞回収液/PBS+BSAを除去します。400 μLの氷冷PBSを加え、別の氷冷PBSリンスで繰り返します。</li>
		<li>PBSを取り除き、300 μL氷冷4%PFA(0.1 M PB)でオルガノイドを20分間固定し、室温でインキュベートします。400 μL の氷冷PBSで PFA とオルガノイドをすすい取ります。</li>
		<li>PBS を削除します。その後、400 μL PBS + 1% BSA を追加します。4 °Cで保管。</li>
	</ol>
</li>
	<li>免疫蛍光染色<ol>
<li>オルガノイドを500 μL PBS + 1% BSAでリンスします。次いで、ブロッキング溶液中のオルガノイド(5%正常ヤギまたはロバ血清、1%ウシ血清アルブミン、0.3%トリトンX100中1x1xPBS pH 7.3)を2時間インキュベートし、室温で穏やかに揺れる。</li>
		<li>一次抗体溶液(ブロッキング溶液で希釈された一次抗体)を加え、4°Cで3泊静かにロックします。</li>
		<li>オルガノイドを500 μL PBS + 0.2% トリトンで1時間4倍洗浄し、室温で穏やかに揺れる。二次抗体溶液(ブロッキング溶液で希釈された二次抗体)とロックオルガノイドを一晩加え、光から保護し、4°Cで保護する。</li>
		<li>オルガノイドを500 μL PBS + 0.2% トリトンで3倍洗浄し、光から保護し、室温で穏やかに揺れる。DAPIでインキュベート 1:10,000 0.1 M PB で 0.1 M PB で 20 分間、ロッキングし、室温で覆います。</li>
		<li>オルガノイド3倍を0.1M PBで20分間洗い、穏やかに揺れ、室温で覆います。</li>
	</ol>
</li>
	<li>逆焦点顕微鏡用オルガノイドのスライド取り付け。 注: スライドの取り付けプロセスのステップバイステップの画像を 図 7に示します。<ol>
<li>顕微鏡スライド上に、非毒性モデリング粘土の厚さ22 x 22mm角の周長から約1mmを作成します。</li>
		<li>マイクロ遠心分離チューブから0.1 M PBを取り出し、オルガノイドを好みの100 μLの取り付け媒体で静かに再懸濁します。その後、粘土の正方形の中心に移ります。</li>
		<li>土の土が土の上に近くなるまで粘土の正方形を埋めます。その後、22 x 22 mm の正方形のカバースリップを粘土の上に置き、カバースリップの側面をしっかりと押し下げてシールします。メーカーの指示に従って治し(ここでは、1〜2日間室温)、4°Cで保管してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここで報告されているのは、成人マウス味覚幹細胞に由来する言語オルガノイドを培養、維持、処理するための効率的かつ容易に再現可能な方法である。8〜20週齢のLgr5-EGFPマウスの3つのCvPsを使用すると、実験用に約10,000 GFP+細胞を得るのに十分であり、その結果、48ウェルプレートのウェルあたり200細胞の密度で50のウェルがメッキされることがわかりました。CVPトレンチ上皮の除去は、新たに作られたディスパーゼIIおよびI型コラゲターゼ溶液でリンガル上皮を注入し、続いて33分のインキュベーションを行うことによって最適化される。しかし、インキュベーション時間が短い場合、古い酵素アリコート、ロットが異なる、または異なるメーカーの酵素を使用すると、トレンチ除去が不完全になります。逆に、潜伏時間が長いと組織の過剰消化が生じ、味覚組織の完全性が失われる。剥離後、CVPトレンチに対するさらなる濃縮は、CVPを取り囲む上皮をトリミングすることによって行われた。
解離および回収プロセス中に使用されるすべてのマイクロ遠心分離管は、組織および細胞がチュ...

げっ歯類では、舌の後臭中線で舌の舌の前に分布する乳頭の真菌、両側葉乳頭、ならびに単一の周回乳頭(CVP)に舌の味覚芽が収容される。各味覚芽は、50〜100の短命で急速に更新される味覚受容体細胞(TRC)で構成され、I型グリア様支持細胞、甘味、苦い、旨味を検出するII型細胞、酸味2、3、4を検出するIII型細胞が含まれる。マウスCVPにおいて、基底層に沿ったLGR5+幹細胞は、非味の上皮細胞と同様に、すべてのTRCタイプを産生する5。味覚系統を更新する場合、LGR5娘細胞は、味覚芽に入り、3つのTRCタイプ6のいずれかに分化することができる、まず、味覚後前駆細胞(IV型細胞)として指定される。TRCの急速な回転は、放射線および特定の薬物療法を含む治療によって中断されやすい味覚システムをレンダリングします7,8,9,10 ,11,12,13.したがって、味覚機能の制御とTRC分化のコンテキストで味覚システムを研究することは、味覚機能障害を軽減または予防する方法を理解するために不可欠である。
マウスは、ヒト14、15、16と同様に組織された味覚システムを有するため、味覚科学におけるインビボ研究の伝統的なモデルである。しかし、マウスは維持コストが高く、作業に時間がかかるため、高スループット研究には適していません。これを克服するために、インビトロオルガノイド培養方法が近年開発されている。味オルガノイドは、天然のCVP組織から生成することができ、単離マウスCVP上皮培養ex vivo17からオルガノイドが芽を出すプロセスである。これらのオルガノイドは、インビボ味覚システムと一致する多層上皮を示す。ex vivo CVP培養を必要としないオルガノイドを生成するより効率的な方法は、2014年18年にRenらによって開発されました。腸オルガノイドを成長させるために最初に開発された方法および培養培地を適応させ、マウスCVPから単一のLgr5-GFP+前駆細胞を単離し、マトリックスゲル19にめっきした。培養の最初の6日間に増殖するこれらの単一細胞は、8日目頃に分化し始め、培養期間の終わりまでに非味覚上皮細胞および3種類のTRCタイプ18、20すべてを含む。現在までに、言語オルガノイドモデルシステムを利用した複数の研究が17、18、20、21、22に掲載されています。しかしながら、これらのオルガノイドを生成するために使用される方法と培養条件は、出版物によって異なる(補足表1)。したがって、これらの方法は、ここで調整され、成人マウスCVPのLGR5+前駆体に由来する言語オルガノイドの培養のための詳細な標準化されたプロトコルを提示するように最適化されている。
言語オルガノイドは、味細胞の発達と再生を駆動する細胞生物学的プロセスを研究するためのユニークなモデルを提供します。イン ビトロ オルガノイドモデルの活用に向けて、言語オルガノイドの応用が拡大し、ラボが増える中、再現性を高めるために標準化されたプロトコルの開発と採用に取り組む分野が重要です。味覚科学の中で標準的なツールとして言語オルガノイドを確立することは、単一の幹細胞が成体味システムの分化された細胞を生成する方法を引き離す高スループット研究を可能にする。さらに、舌間オルガノイドは、味の恒常性に影響を与える可能性のある薬物を迅速にスクリーニングするために使用することができ、動物モデルでより徹底的に調査することができます。このアプローチは、最終的には、将来の薬物レシピエントの生活の質を向上させる治療法を考案するための努力を強化します。

<table><tbody><tr><td>抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG</td><td>Molecular Probes</td><td>A11056, RRID: AB_142628</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG Molecular</td><td>Probes</td><td>A11010, RRID:AB_2534077</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11075, RRID:AB_2534119</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG Molecular</td><td>Probes</td><td>A31573, RRID:AB_2536183</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG</td><td>Molecular Probes</td><td>A21247, RRID:AB_141778</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>DAPI(FACS用)</td><td>Thermo Fischer</td><td>62247</td><td></td></tr><tr><td>DAPI(免疫組織化学用)</td><td>Invitrogen</td><td>D3571, RRID:AB_2307445</td><td>1:10000</td></tr><tr><td>ヤギ抗CAR4</td><td>R&D Systems</td><td>AF2414, RRID:AB_2070332</td><td>1:50</td></tr><tr><td>モルモット抗KRT13</td><td>Acris 抗体</td><td>BP5076, RRID:AB_979608</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Rabbit anti-GUSTDUCIN</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td><td>sc-395, RRID:AB_673678</td><td>1:250</td></tr><tr><td>ウサギ抗NTPDASE2</td><td>CHUQ</td><td>mN2-36LI6, RRID:AB_2800455</td><td>1:300</td></tr><tr><td>ラット 抗KRT8</td><td>DSHB</td><td>TROMA-IS, RRID:</td><td>AB_531826 1:100</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2D rocker</td><td>Benchmark Scientific Inc.</td><td>BR2000</td><td></td></tr><tr><td>3D Rotator</td><td>Lab-Line Instruments</td><td>4630</td><td></td></tr><tr><td>Big-Digit Timer/Stopwatch</td><td>Fisher Scientific</td><td>S407992</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>CO2 タンク</td><td>エアガス</td><td>CD USP50</td><td></td></tr><tr><td>FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>4110</td><td>184 L, ポリッシュステンレス鋼製</td></tr><tr><td>インキュサイト</td><td>ザルトリウス</td><td>モデル:S3</td>がん<td>センター細胞技術共有リソース、コロラド大学アンシュッツメディカルキャンパス</td></tr><tr><td>MoFlo XDP100</td><td>Cytomation株式会社</td><td>モデル:S13211997</td><td>&nbsp;ゲイツ センター フローサイトメトリー コア、コロラド大学 アンシュッツ メディカル キャンパス</td></tr><tr><td>オービタル シェイカー</td><td>ニューブランズウィック サイエンティフィック</td><td>エクセラ E1</td><td></td></tr><tr><td>リアルタイム PCR システム</td><td>Applied Biosystems</td><td>4376600</td><td></td></tr><tr><td>冷蔵遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;実体顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>Stemi SV6</td><td></td></tr><tr><td>サーマルサイクラー</td><td>Bio-Rad</td><td>580BR</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>精密</td><td>51220073</td><td></td></tr><tr><td>Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A83 01</td><td>Sigma</td><td>SML0788-5MG</td><td>ストック濃度 10 mM、最終濃度 500 nM</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>B27 サプリメント</td><td>Gibco</td><td></td><td>17504044 原液濃度 50X、最終濃度 1X</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td>原液濃度 1000X、最終濃度 1X</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>原液濃度 100X、最終濃度 1X</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>ストック濃度 100X、最終濃度 1X</td></tr><tr><td>マウス EGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09-1MG</td><td>ストック濃度 500 & マイクロ;g/mL、最終濃度 50 ng/mL</td></tr><tr><td>Murine Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>ストック濃度 50 & micro;g/mL、最終濃度 25 ng/mL</td></tr><tr><td>N-アセチル-L-システイン</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td>ストック濃度 0.5 M、最終濃度 1 mM</td></tr><tr><td>ニコチンアミド</td><td></td><td>Σ N0636-100g</td><td>ストック濃度 1 M、最終濃度 1 mM</td></tr><tr><td>ペン/連鎖球菌</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>ストック濃度 100X、最終濃度 1X</td></tr><tr><td>プリモシン</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td>原液濃度500倍、最終濃度1倍</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>R&D Systems</td><td>1264</td><td>ストック濃度 10 mM、最終濃度 0.4 & マイクロ;M</td></tr><tr><td>WRNコンディショニング培地</td><td></td><td></td>は<td>Dempsey Labから受領しました(AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource)。L-WRN (ATCC&reg;CRL-3276&trade;)細胞</td></tr><tr><td>Y27632 ジヒドクロリド 10ug</td><td>APExBIO</td><td>A3008-10</td><td>ストック濃度 10 mM、最終濃度 10 & マイクロ;M</td></tr><tr><td>その他</強力></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1 ml TB シリンジ</td><td>BD シリンジ</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール、最小 98%</td><td>Sigma</td><td>M3148-25ML</td><td>&β;-メルカプトエタノール</td></tr><tr><td>2.0 mL 微量遠心チューブ</td><td>USA Scientific</td><td>1420-2700</td><td></td></tr><tr><td>48 ウェルプレート</td><td>Thermo Scientific</td><td>150687</td><td></td></tr><tr><td>5 3/4インチ パスツール ピペット</td><td>フィッシャーブランド</td><td>12-678-8A</td><td></td></tr><tr><td>アルブミン 牛血清 (BSA) シ</td><td>グマ ライフサイエンス</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>バッファー RLT 溶解バッファー</td><td>QIAGEN</td><td>1015750</td><td></td></tr><tr><td>細胞回収ソリューション</td><td>コーニング</td><td>354253</td><td></td></tr><tr><td>Cohan-Vannas 春はさみ</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>15000-02</td><td></td></tr><tr><td>Clostridium histolyticum由来のコラゲナーゼ、I型</td><td>、Sigma Life Science</td><td>C0130-1G</td><td></td></tr><tr><td>、Cultrex RGF BME、2型、Pathclear</td><td>R&Dシステムズ</td><td>3533-005-02</td><td>マトリゲル</td></tr><tr><td>ディスパーゼII.(中性プロテアーゼII.)</td><td>シグマアルドリッチ(ロシュ)4942078001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ディスポーザブルフィルター</td><td>シスメックス</td><td>04-0042-2316</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水pH 7.4(1X)(Ca2 + &Mg2+フリー)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ'リン酸緩衝生理食塩水とCa2+ &Mg2+&nbsp;</td><td>シグマ ライフサイエンス</td><td>D8662-500ML</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #5 鉗子</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>EDTA、0.5M (pH 8.0)</td><td>プロメガ</td><td>V4231</td><td></td></tr><tr><td>エラスターゼ 凍結乾燥ワー</td><td>ジントン 生化学</td><td>LS002292</td><td></td></tr><tr><td>エクストラ ファイン ボン はさみ</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>フルオロマウント G</td><td>サザンバイオテック</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>HEPES ソリューション</td><td>シグマ ライフサイエンス</td><td>H3537-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Tryspin 0.25% + EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA 合成キット</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1706691</td><td></td></tr><tr><td>モデリング クレイ、グレー</td><td>サージェント アート</td><td>22-4084</td><td></td></tr><tr><td>ニードル</td><td>BDシリンジ</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>ノーマルロバ血清</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>正常ヤギ血清</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PowerSYBR グリーンPCRマスターミックス</td><td>応用バイオシステムズ</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy マイクロ キット</td><td>QIAGEN</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>セーフ ロック チューブ 1.5 mL</td><td>エッペンドルフ</td><td>022363204</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャー ケミカル</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二塩基性無水</td><td>フィッシャー ケミカル</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム 一塩基性無水</td><td>フィッシャー バイオ試薬</td><td>7558-80-7</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus 顕微鏡スライド</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>手術用ハサミ - シャープ</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>14002-14</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>シグマ ライフサイエンス</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>VWR マイクロ カバー ガラス</td><td>VWR</td><td>48366067</td><td>22x22mm</td></tr></tbody></table>

成人マウス味幹細胞由来の舌下オルガノイドの生成と培養

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

味覚は舌の味覚芽によって媒介され、急速に更新される味覚受容体細胞(TRC)で構成されています。この継続的な売上高は、局所的な前駆細胞によって動力を与えられ、多数の医療によって混乱を招きやすい味覚機能を提供し、生活の質に深刻な影響を与えます。したがって、薬物治療の文脈でこのプロセスを研究することは、味前駆物質機能とTRC産生が影響を受けるかどうか、そしてどのように影響を受けるかを理解するために不可欠です。倫理的な懸念と人間の味の組織の限られた可用性を考えると、マウスモデルは、人間と同様の味覚システムを持つ、一般的に使用されています。時間がかかり、高価で、高スループットの研究に適していない in vivo 方法と比較して、マウスリングアルガノイドは、多くの複製と少ないマウスで実験を迅速に実行することができます。ここで、以前に公開されたプロトコルが適応され、成体マウスの周回乳頭(CVP)から分離された味覚前駆細胞からオルガノイドの味覚を生成するための標準化された方法が提示されている。CVP発現LGR5中の前駆細胞を味わい、Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 アレルを運ぶマウスからEGFP蛍光活性化細胞選別(FACS)を介して単離することができる。並べ替えられた細胞は、マトリックスゲルベースの3D培養システムにメッキされ、12日間培養されます。オルガノイドは、増殖を介して培養期間の最初の6日間増殖し、その間に非味上皮細胞と共に3つの味細胞タイプすべてを生成する分化段階に入る。オルガノイドは、12日目の成熟時、またはRNA発現および免疫組織化学分析のための成長過程でいつでも収穫することができる。成体幹細胞から言語性オルガノイドを生産するための培養方法を標準化することは、味覚機能障害を経験している患者を助けるために戦いの強力な薬物スクリーニングツールとして再現性を向上させ、言語オルガノイドを進めます。

マウスは、舌の後に位置する1つのCVPを有し、そこからLGR5+ 幹細胞を単離することができる(図1A、ブラックボックス)。CVPの下および周辺の酵素溶液の注入(図1B)は、上皮のわずかな腫脹および結合組織の消化をもたらす。十分な消化は、33分のインキュベーションに続いて達成され、これは基底組織からCVP上皮を容易に分離することを可能にする。CVP上皮を剥がそうとすると、トレンチが破壊されたり損傷したりしないように、CVPから十分な距離で切断を行う必要があります(図1C)。これにより、CVPを損傷することなく鉗子を使用して上皮を握ることもできます。CVPを取り囲む上皮をトリミングすると、非標的細胞が除去され、操作される組織質量を減少させることで以下のステップの効率が向上する(図1D)。CVP上皮をマイクロ遠心管に添加する前に、2つのトレンチ(<s...

このプロトコルは、成体マウスの後味乳頭から単離された味覚幹細胞に由来する言語オルガノイドを培養および処理するための方法を提示する。

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

オルガノイドは、薬物スクリーニングと生物学的プロセスの理解に使用される強力なインビトロ技術です。したがって、舌をモデル化するオルガノイドを生成することは、味細胞の発達と再生を研究するために重要です。伝統的なインビボ味の研究は、高価で時間がかかることができます。このオルガノイドプロトコルは、より高いスループット実験を可能にしながら、これらの課題を最小限に抑える標準化された、再現可能な代替手段を提供します。成虫マウスを安楽死させた後、大きな無菌解剖はさみを使って頬を切り、顎を折ります。次に、舌を持ち上げ、舌を口腔の床から分離するために舌を切ります。舌を切り取り、カルシウムとマグネシウムで滅菌氷冷dPBSでそれを収集します。解剖顕微鏡の下で、カミソリの刃でマラー間のエミネンスの前部だけを切断することによって前舌を取り除き、捨てます。その後、後舌から任意の髪と余分な液体を除去するために繊細なタスクワイプを使用しています。次に、1ミリリットルの注射器を200〜300マイクロリットルの注射酵素溶液で満たし、乳頭周蓋(CVP)の前部まで30ゲージの半インチ針を中間マラーエミネンスのすぐ上に挿入します。上皮と下層組織の間のCVPの下および横端に酵素溶液を注入する。溶液が注入されている間、ゆっくりと、そして継続的に舌から注射器を引き出す。正確に33分間室温で舌と無菌カルシウムマグネシウムフリーdPBSをインキュベートします。超微細解剖はさみを使用して、上皮の小さな切り傷を二国間で行い、CVPの前部にすぎません。その後、上皮を細かい鉗子で持ち上げて軽く剥がします。トレンチ上皮が下層の結合組織から解放されたら、FBSであらかじめコーティングされた2つのミリリットルマイクロ遠心分離管に入れる。解離酵素カクテルを皮をむいたCVP上皮を含むチューブに加え、15分ごとに短い渦で45分間摂氏37度の水浴にインキュベートします。インキュベーションの最後の15分間、水浴中のプリウォーム0.25%トリプシン-EDTA。インキュベーションに続いて、ガラスパスツールピペットで1分間トリチュレートでチューブを渦付けします。組織片が沈着した後、新しいFBSに解体細胞の最初のコレクションを含む上清をピペット1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ。上清をGの370倍で5分間回転させ、摂氏4度で細胞をペレットにします。得られた上清を取り除き、FACSバッファー内の細胞ペレットを再懸濁し、氷の上に保管します。元の2ミリリットルマイクロ遠心チューブの残りの組織片を解き分けるには、事前に温めた0.25%トリプシン-EDTAを加え、37°Cで30°Cで30分間インキュベートし、10分ごとに短い渦巻きを行います。その後、ガラスパスツールピペットで組織片を1分間トリチュレートします。組織片が沈落した後、上清をFACSバッ

generation-culture-lingual-organoids-derived-from-adult-mouse-taste

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

我々は人間の茸状乳頭味細胞の長期培養を分離して維持するための再現可能なプロトコルを開発することを目的とした。生検で得られたヒト茸状乳頭由来の細胞が正常に生存率の低下なしに個以上の通路（12ヶ月）培養で維持した。...

人間の茸状の味覚乳頭細胞の単離および培養

このビデオでは、マウスの舌から上皮細胞が分離される様子を説明しています。これらの細胞をさらに培養して、細胞コロニーを生じさせることができます。...

マウス舌上皮細胞の単離と培養:マウスモデルから舌上皮細胞を単離および培養する手順

このビデオでは、マウスの舌からの環状乳頭(CVP)上皮の分離について説明します。...

マウスモデルからの環状乳頭(CVP)上皮の単離:マウス舌からCVP上皮を分離するための酵素的手順

幹細胞由来の培養物は、感染症をモデル化する大きな可能性を秘めています。ここでは、成体幹細胞に由来するマウスおよびヒト胃オルガノイドの培養について説明する。オルガノイドには、胃病原体であるヘリコバクター・ピロリをマイクロインジェクションします。...

感染症のためのモデルとしてのオルガノイド：人間の文化とマウス胃オルガノイドとピロリ菌のマイクロインジェクション

本論文では、全体および無傷の味覚芽(それらを内面化する神経線維を含む)を一貫して生み出し、味覚芽内の構造と周囲の乳頭の構造間の関係を維持する全真菌形態、周回、口蓋味覚芽の組織調製、染色、分析の方法について説明する。...

菌体、円周体、口蓋味覚芽の全山染色、可視化、分析

我々は、胚および成体マウス舌の上皮および間線質/結合組織から大量の高品質単一細胞を解離するための一般化されたプロトコルを開発した。...

12.5日目および8週齢マウスの舌上皮・間分性/結合組織からの細胞解離

トロウェル型臓器培養法は、歯の発達を支配する複雑なシグナル伝達ネットワークを解明するために使用され、最近では、継続的に成長するマウス切歯の幹細胞に関与する調節を研究するために使用されています。蛍光レポーター動物モデルとライブイメージング法は、歯科幹細胞とその特定のニッチ微小環境の詳細な分析を容易にします。...

歯科幹細胞の制御を研究するためのトロウェル型臓器培養の使用

本プロトコルは、成人マウス口蓋に由来する経口角化細胞の分離および培養について説明する。免疫染色を用いた評価方法も報告されている。...

成人マウス口蓋からの一次口腔角化細胞の分離と培養

このプロトコルでは、化学的発がんによって誘発される正常、腫瘍前、および扁平上皮がんの病変を表すマウスの口腔食道3Dオルガノイドを生成および特性評価するための重要なステップについて説明します。...

3Dオルガノイドによる口腔食道扁平上皮癌のモデリング

ここでは、全脳から、または終脳、tectalまたは成人のゼブラフィッシュの脳の小脳領域のいずれかに由来する神経球アッセイを使用して、大人の神経新生を調べるために、再現性のある方法を提供します。さらに、我々はゼブラフィッシュの神経球における遺伝子発現を操作するための手順を説明します。...

大人のゼブラフィッシュ脳由来神経球の単離および培養

学ぶ成人マウス味幹細胞由来の舌下オルガノイド生成法。FACSでLgr5陽性細胞を分離し、WENRAS培地で培養することで、味細胞の発生と再生をin vitroで効率的にモデル化し、創薬スクリーニングに応用可能です。

成人マウス味幹細胞由来の舌下オルガノイドの生成と培養

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