成人マウス味幹細胞由来の舌下オルガノイドの生成と培養

このプロトコルは、成体マウスの後味乳頭から単離された味覚幹細胞に由来する言語オルガノイドを培養および処理するための方法を提示する。

オルガノイドは、薬物スクリーニングと生物学的プロセスの理解に使用される強力なインビトロ技術です。したがって、舌をモデル化するオルガノイドを生成することは、味細胞の発達と再生を研究するために重要です。伝統的なインビボ味の研究は、高価で時間がかかることができます。

このオルガノイドプロトコルは、より高いスループット実験を可能にしながら、これらの課題を最小限に抑える標準化された、再現可能な代替手段を提供します。成虫マウスを安楽死させた後、大きな無菌解剖はさみを使って頬を切り、顎を折ります。次に、舌を持ち上げ、舌を口腔の床から分離するために舌を切ります。

舌を切り取り、カルシウムとマグネシウムで滅菌氷冷dPBSでそれを収集します。解剖顕微鏡の下で、カミソリの刃でマラー間のエミネンスの前部だけを切断することによって前舌を取り除き、捨てます。その後、後舌から任意の髪と余分な液体を除去するために繊細なタスクワイプを使用しています。

次に、1ミリリットルの注射器を200〜300マイクロリットルの注射酵素溶液で満たし、乳頭周蓋(CVP)の前部まで30ゲージの半インチ針を中間マラーエミネンスのすぐ上に挿入します。上皮と下層組織の間のCVPの下および横端に酵素溶液を注入する。溶液が注入されている間、ゆっくりと、そして継続的に舌から注射器を引き出す。

正確に33分間室温で舌と無菌カルシウムマグネシウムフリーdPBSをインキュベートします。超微細解剖はさみを使用して、上皮の小さな切り傷を二国間で行い、CVPの前部にすぎません。その後、上皮を細かい鉗子で持ち上げて軽く剥がします。

トレンチ上皮が下層の結合組織から解放されたら、FBSであらかじめコーティングされた2つのミリリットルマイクロ遠心分離管に入れる。解離酵素カクテルを皮をむいたCVP上皮を含むチューブに加え、15分ごとに短い渦で45分間摂氏37度の水浴にインキュベートします。インキュベーションの最後の15分間、水浴中のプリウォーム0.25%トリプシン-EDTA。

インキュベーションに続いて、ガラスパスツールピペットで1分間トリチュレートでチューブを渦付けします。組織片が沈着した後、新しいFBSに解体細胞の最初のコレクションを含む上清をピペット1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ。上清をGの370倍で5分間回転させ、摂氏4度で細胞をペレットにします。

得られた上清を取り除き、FACSバッファー内の細胞ペレットを再懸濁し、氷の上に保管します。元の2ミリリットルマイクロ遠心チューブの残りの組織片を解き分けるには、事前に温めた0.25%トリプシン-EDTAを加え、37°Cで30°Cで30分間インキュベートし、10分ごとに短い渦巻きを行います。その後、ガラスパスツールピペットで組織片を1分間トリチュレートします。

組織片が沈落した後、上清をFACSバッファーに以前に採取した解水細胞を含む1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブにピペット化する。解き分け細胞でチューブを回転させます。上清を除去した後、FACSバッファー内の細胞ペレットを再懸濁し、氷の上に保管します。

次に、テキスト原稿に記載されているように緑色蛍光タンパク質チャネルを用いてFACSを介してLgr5-GFP陽性細胞を単離する。望ましい数のLgr5陽性懸濁細胞を新しいマイクロ遠心分離管に移す。チューブを370倍Gで5分間回転させ、摂氏4度で細胞をペレットします。

上清を取り除き、チューブを氷の上に置きます。穏やかなピペットでマトリックスゲルの適切な量の細胞ペレットを穏やかに再懸濁します。その後、マイクロ遠心チューブを氷の上に50ミリリットルの円錐チューブで入れて、マトリックスゲルがゲル化するのを防ぎます。

48ウェルプレートの各ウェルの中央にセル混合物にマトリックスゲル15マイクロリットルを加えます。細胞の均一な分布を確保するには、3つのウェルごとにめっきした後に上下にピペット処理してマトリックスゲルと細胞混合物を混合します。プレートを37°C、炭酸ガス5%、湿度95%で10分間インキュベーターに入れ、マトリックスゲルのゲル化を可能にします。

次に、300マイクロリットルの室温WENRAS培地をロックインヒビターY27632を各ウェルに加え、プレートをインキュベーターに戻します。めっきの2日後、1ミリリットルのピペットを使用するか、真空吸引を介して各ウェルから媒体を取り出し、条件間の交差汚染を確実にします。ウェルの側面に300マイクロリットルのWENRAS培地を加え、マトリックスゲルを破壊し、プレートをインキュベーターに戻さないように注意してください。

言語オルガノイドはWENR培地を用いて培養される場合、効率的に増殖しない。しかし、A83-01、TGF-βシグナル伝達阻害剤、およびSB202190を添加した後、P-38マップキナーゼシグナル伝達阻害剤は、強い成長が観察される。興味深いことに、6日後に培地からこれらの阻害剤を除去すると、一般的な味覚受容体細胞マーカーであるKcnq1の発現が高くなり、A83-01およびSB-202190が味細胞分化を妨げることを示唆している。

したがって、6日目から12日目までのWENRAS培地およびWENR培地でオルガノイドを培養することにより、最適な成長と分化が得られます。成熟したオルガノイドは、ケラチン-8とケラチン-13によってマークされた非味の上皮細胞によってマークされた両方の味細胞を含む。また、ケラチン-13は、3つの味覚受容体細胞マーカーの全てよりも高いレベルで発現し、オルガノイドが主に非味上皮細胞で構成されていることを示唆している。

オルガノイドは、すべての味覚受容体細胞型を発現する。Entpd2によってマークされたタイプ1細胞とGnat3によってマークされたビタータイプ2細胞は味オルガノイドで高く発現され、酸味感タイプ3細胞はCar4でマークされる一般的ではありません。味覚受容体細胞は、生体内で観察される離散的な味覚芽構造ではなくオルガノイドにランダムに分布する。

口腔から舌を解剖する際には、CVPに組織の後部を含めるようにしてください。さらに、両方のトレンチが飛び出し、上皮を剥がすときに得られることを確認してください。