Name: D1S80ローカスを用いたDNAフィンガープリントのラボクラスへの応用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 学ぶ D1S80ローカスを用いたDNAフィンガープリント法。口腔粘膜細胞からのDNA抽出、PCR増幅、ゲル電気泳動を含む実習向けプロトコルで、分子遺伝学の基礎技術を習得できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者たちは、ケビン・グラハムのナレーションと、この作品のためにサンプルを寄付したすべての参加者に感謝したいと思います。

注:このプロトコルは、ジェノティピックプロファイルが遺伝的関係に関する洞察を与えるため、学生またはそれぞれの法的保護者がこのプロトコルの実施に同意した場合にのみ使用されます。DNAフィンガープリントは、主に集団研究や法医学に適用される一般的な分子生物学方法です。したがって、汚染リスクを可能な限り低く保つために注意を払う必要があります。外部ソースまたはDNasesからのDNAによるサンプルの汚染を避けるために、手袋を着用し、器具を十分に洗浄または滅菌し、使用前にフィルター滅菌またはオートクレーブする必要があります。
1. 頬粘膜上皮細胞の収穫
注意:唾液や上皮細胞を使用すると、感染症の伝染につながる可能性があります。したがって、標準および送信ベースの予防措置(例えば、適切な個人用保護具の使用)を適用する必要があります。
注:インストラクターによって提供され、下流の処理手順に含まれる肯定的なコントロール(例えば、インストラクターによって抽出されたDNA)を含めます。
<ol><li>標本採取前に歯を食べたり磨いたりした後、少なくとも1時間待ちます。</li>
	<li>空の無菌2.0 mLマイクロ遠心チューブにラベルを付けます。</li>
	<li>パッケージから1つの無菌頬綿棒を取り出し、頬の内側を30〜40回または30〜40秒間激しくこすり、頬粘膜上皮細胞を収穫します。</li>
	<li>コレクションの先端を以前にラベル付けされた無菌マイクロ遠心分離チューブに入れ、手または滅菌はさみを使用して、端を越えて伸びるプラスチックの長さを断ち切ります。</li>
	<li>キャップをチューブの上にしっかりと置き、コレクションの綿棒を内側に密封します。</li>
</ol>ヒト細胞からのゲノムDNAの抽出
<ol><li>抽出前に、サンプル溶出のためにサーマルミキサーまたは加熱ブロックを65°Cに設定します。 注意: 使用される化学物質の中には、危険な化学物質が分類されるものもあります。安全データシートをよく読み、取扱う前に適切な安全対策を講じてください。<ol>
<li>すべての必要なバッファーおよび溶液(溶解液、8 M酢酸カリウム、2-プロパノール、70%エタノールおよび溶出バッファー)を濾過またはオートクレーブして調製し、滅菌します。 注:すべての遠心段階は、指定されていない限り、室温(20〜30°C)で行う必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>500 μL の溶解液(50 mM Tris/HCl、pH 8.0;10 mM エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)、2%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS))をバッカス綿棒に加え、サンプルが溶解溶液に完全に浸漬されていることを確認します。<ol>
<li>渦は少なくとも5sのために精力的に。</li>
		<li>サーマルミキサーでサンプルを65°Cで10分間インキュベートします。</li>
		<li>インキュベーション中に5sのパルス渦によってサンプルを3〜4回混合する。</li>
		<li>リシスバッファーから綿棒を取り出し、綿棒をチューブの内側に押し付けて最大サンプル量を得る。</li>
	</ol>
</li>
	<li>8 M酢酸カリウムの100 μLを、細胞を分解します。<ol>
<li>白い沈殿物が出るまでチューブを反転して十分に混ぜます。</li>
		<li>室温で5分間インキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>サンプルを18,000 x gで5分間遠心分離します。</li>
	<li>450 μLの上清を清潔で無菌の1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。</li>
	<li>450 μLの2-プロパノールを加え、チューブを反転(DNAの沈殿)して十分に混ぜます。</li>
	<li>室温で5分間インキュベートします。</li>
	<li>18,000 x gで 5 分間の遠心分離機 .</li>
	<li>上清を捨て、きれいなペーパータオルでチューブを反転させてペレットを乾燥させ、クロスコンタミネーションを避けます。</li>
	<li>65°Cで5分間、加熱ブロックでDNAをインキュベートし、ペレットを完全に乾燥させます。</li>
	<li>DNAを洗浄するには、500 μLの70%エタノールを加えます。</li>
	<li>18,000 x gで1分間の遠心分離機。</li>
	<li>上清を捨て、きれいなペーパータオルでチューブを反転させてペレットを乾燥させます。</li>
	<li>30 μL のリサスペンション バッファー(10 mM トリス/HCl pH 8.0、1 mM EDTA)をペレットに加えます。</li>
	<li>DNasesを不活性化するために、65°CでDNAを65°Cで10分間インキュベートします。</li>
</ol>PCRを用いた D1S80 VNTR遺伝子座の増幅
注:使用されるサンプルの数を記録し、必要なプラスチックやその他の材料を収集する前に、必要な試薬とそのボリュームでワークシートを準備します。PCR に使用する滅菌チューブ/ストリップ/プレートにサンプル番号を付けてラベルを付けます。PCRを検証するために、DNAの代わりにH2Oを用いた陰性コントロールと陽性対照(例えば、インストラクターが提供するDNAを使用)を含める必要があります。
<ol><li>10 μLの5x PCR反応バッファー(15 mM MgCl2を含む)、デオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNtPs)(10 mM)の1 μL、各プライマーpMCT118-fおよびpMCT118-r(前方- 5'-GAACTGGCcCCAACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAC 逆 - 5'-GTCTGTTGGAGATGCACGTGCGCTTGC-3')Kasaiらによると、超純粋なH2Oの23.8 μL、およびTaq DNAポリメラーゼの0.2 μL(5 U/μL)。 注:プライマーpMCT118-f/pMCT118-rは 、D1S80 VNTR領域の側面領域に設計され、全遺伝子座を増幅しました。</li>
	<li>PCR チューブ/ストリップ/プレートに、使用するサンプル番号を付けます。</li>
	<li>マスターミックスのアリコート45μLは、各標識PCRサンプルチューブまたはウェルに対する。</li>
	<li>各PCRチューブ/プレートウェルのマスターミックスに5μLのDNAテンプレートを追加して、合計体積50μLを取得します。</li>
	<li>DNAの代わりに超純粋なH2Oを用いて、テンプレートなし制御(NTC)を含める。</li>
	<li>PCRチューブ/ストリップまたはシールプレートを閉じて混ぜます。</li>
	<li>卓上遠心分離機を使用して、PCRチューブ/ストリップ/プレートを20s用に遠心分離します。 注:このプロトコルで与えられたPCR条件は、DNAポリメラーゼおよび使用されるPCRサーマルサイクラーを使用して最適化されました。一般に、PCR条件はDNAポリメラーゼに適合する必要があります。Taq DNAポリメラーゼの標準延長時間は1分/kbです。</li>
	<li>サンプルチューブ/ストリップ/プレートをサーモサイクラーに入れ、次の条件(DNAポリメラーゼ延長時間)を使用して反応をインキュベートします:95 °Cの1サイクル(2分間)。94°Cの25サイクル15s、60°C(15s)、72°C(30s)72°Cの1サイクル10分間。</li>
	<li>プログラムが完了したら、サーモサイクラーから製品を取り出し、電気泳動まで一晩4°Cまたは-20 °Cで保管してください。</li>
</ol>4. PCR産物のアガロースゲル電気泳動
<ol><li>1.5%のアガロースゲルを調製します。<ol>
<li>アガロース粉末1.5gを使用し、フラスコに1xトリス酢酸EDTA(TAE)緩衝液100mLと混合します。</li>
		<li>電子レンジ(600W)で約1.5〜2分間加熱します。内容物を旋回し、必要に応じて再び加熱し、アガロースを完全に溶解する。少し冷やして、アガロースにペクグリーンの2μLを加えます。</li>
		<li>すべてのサンプルに十分なウェルを備えた櫛を使用してゲルをフォームに注ぎ、少なくとも1つの分子量マーカーを追加します。 注意: 煮沸遅滞が発生する場合があります。まだ溶けていないアガロースを再懸濁する際には、フラスコを慎重に振ります。 注:PeqGreenは核酸の検出のための無毒な染料です。これは、二本鎖DNA(dsDNA)および一本鎖DNA(ssDNA)、RNAの染色に適用できます。感度は臭化エチジウムに匹敵する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR製品を4°Cから取り出し、遠心分離機を約10sで取り除きます。</li>
	<li>ゲルのウェルを10 μLサンプルでロードします。ゲルを過負荷にしないでください。 注:DNAポリメラーゼバッファーには、サンプル密度を高める化合物も含まれており、サンプルは負荷染料を必要とせずにゲルに直接ロードできます。これにより、サンプルが井戸に沈み、染料はDNAサンプルがどこまで移行したかを追跡するのに役立ちます。<ol>
<li>横側のウェルに分子量標準を加える(好ましくは50bp分子量標準)。 注: アガロースゲル電気泳動を繰り返す必要がある場合には、残りの PCR サンプルを -20 °C に保存してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1x TAEランニングバッファで約40分間、または約50bpで移動する黄色の色素前面がゲルの下端に達するまで、ゲルを150V(定数)で実行します。</li>
	<li>青色光または紫外線(UV)光を適用しながらゲルを画像化し、フラグメント長分析のために画像を記録します。 注意:UV光は目や皮膚に損傷を与える可能性があります。UVライトボックスを使用する場合は、常に防護服とUV安全メガネを着用してください。</li>
	<li>機関の危険物ポリシーに従ってゲルを廃棄してください。</li>
</ol>5. フラグメント長の結果の分析
注: 線形回帰分析を使用して、フラグメントの長さを推定します。
<ol><li>D1S80 PCRフラグメントのサイズを変更するには、50 bpの分子量標準レーン上のゲル写真に定規を置き、定規の上部がサンプルがロードされたウェルの底に並ぶ(図1)。 注:分子量標準(50bp分子量標準)の線形回帰式を計算するために、スプレッドシートプログラムを使用しました。</li>
	<li>表計算プログラムを用いて、50bpの分子量標準の各バンドのウェルからの距離(例えば、cm単位)を記録する(図2)。</li>
	<li>50bp分子量標準の各フラグメントサイズのログ(例えば、ベース10)を決定し、そのログ値を表に入力する(図2)。</li>
	<li>各データ点を、散乱図を用いて、縦軸(y軸)上のバンドサイズの対数の対数と、ゲルの上端から、水平軸(x軸)上の分子量標準の各バンドまでの測定実行距離をグラフにプロットする(図3)。</li>
	<li>近似曲線(線形回帰線)を適合させ、回帰式(y = ax + b)とR2値をグラフに表示します(図4)。</li>
	<li>各D1S80アンプリコンの移動距離(例えば、cm単位)を測定する(図5)。</li>
	<li>回帰式を使用して各 D1S80 アンプリコンのサイズを推定する: y = ax + b ここで y = フラグメントサイズのログ a = ラインの傾き (ポイント 5 で計算) x = ウェルからの距離 (cm) b = 回帰直線が Y 軸を切り取る点(ポイント 5 で計算) 注: y 値はフラグメントサイズのログを表すため、D1S80アンプリコンの bp 単位のフラグメントサイズを取得するには、アンチログ(10y)を計算する必要があります。</li>
</ol>6. 試験された個人の対立元素における反復単位数の推定
注: D1S80 リピートユニットの長さは 16 bp です。 D1S80 の最小の既知のアレスは14の繰り返しを有する。ここで説明するアンプリコンスキームは、最終的なサイズに余分な145 bpを加算する隣接領域を持つアンプリコンを生成します。
<ol><li>表 1を使用して、各 PCR フラグメントに含まれる反復単位の数を推定します。線形回帰を使用して外挿されたサイズは、特定のアリールの8 bp以内にする必要があります。</li>
	<li>各試験個体の遺伝子型を、アリール反復サイズ数の組み合わせとして記録する。</li>
</ol>

<ol><li>Jeffreys, A. J., Wilson, V., Thein, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypervariable+%27minisatellite%27+regions+in+human+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hypervariable 'minisatellite' regions in human DNA.</a> Nature. 314 (6006), 67-73 (1985).</li>
<li>Kasai, K., Nakamura, Y., White, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+a+variable+number+of+tandem+repeats+%28VNTR%29+locus+%28pMCT118%29+by+the+polymerase+chain+reaction+%28PCR%29+and+its+application+to+forensic+science%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Forensic+Science%22%5BJournal%5D)">Amplification of a variable number of tandem repeats (VNTR) locus (pMCT118) by the polymerase chain reaction (PCR) and its application to forensic science.</a> Journal of Forensic Science. 35 (5), 1196-1200 (1990).</li>
<li>Balamurugan, K., Tracey, M. L., Heine, U., Maha, G. C., Duncan, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+at+the+human+D1S80+minisatellite+locus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Scientific+World+Journal%22%5BJournal%5D)">Mutation at the human D1S80 minisatellite locus.</a> The Scientific World Journal. 2012 (917235), (2012).</li>
<li>Herrera, R. J., Adrien, L. R., Ruiz, L. M., Sanabria, N. Y., Duncan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D1S80+single-locus+discrimination+among+African+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Biology%22%5BJournal%5D)">D1S80 single-locus discrimination among African populations.</a> Human Biology. 76 (1), 87-108 (2004).</li>
<li>Lauritzen, S. L., Mazumder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Informativeness+of+genetic+markers+for+forensic+inference+-+An+information+theoretic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Science+International%3A+Genetics+Supplement+Series%22%5BJournal%5D)">Informativeness of genetic markers for forensic inference - An information theoretic approach.</a> Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 1 (1), 652-653 (2008).</li>
<li>Budowle, B., Chakraborty, R., Giusti, A. M., Eisenberg, A. J., Allen, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+VNTR+locus+D1S80+by+the+PCR+followed+by+high-resolution+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Analysis of the VNTR locus D1S80 by the PCR followed by high-resolution PAGE.</a> American Journal of Human Genetics. 48 (1), 137(1991).</li>
<li>Budowle, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D1S80+population+data+in+African+Americans%2C+Caucasians%2C+southeastern+Hispanics%2C+southwestern+Hispanics%2C+and+Orientals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Forensic+Science%22%5BJournal%5D)">D1S80 population data in African Americans, Caucasians, southeastern Hispanics, southwestern Hispanics, and Orientals.</a> Journal of Forensic Science. 40 (1), 38-44 (1995).</li>
<li>Verbenko, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymorphisms+at+locus+D1S80+and+other+hypervariable+regions+in+the+analysis+of+Eastern+European+ethnic+group+relationships%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Human+Biology%22%5BJournal%5D)">Polymorphisms at locus D1S80 and other hypervariable regions in the analysis of Eastern European ethnic group relationships.</a> Annals of Human Biology. 33 (5-6), 570-584 (2006).</li>
<li>Walsh, S. J., Eckhoff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Australian+Aboriginal+population+genetics+at+the+D1S80+VNTR+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Human+Biology%22%5BJournal%5D)">Australian Aboriginal population genetics at the D1S80 VNTR locus.</a> Annals of Human Biology. 34 (5), 557-565 (2007).</li>
<li>Limborska, S. A., Khrunin, A. V., Flegontova, O. V., Tasitz, V. A., Verbenko, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+genetic+diversity+in+D1S80+revealed+by+SNP-VNTR+haplotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Human+Biology%22%5BJournal%5D)">Specificity of genetic diversity in D1S80 revealed by SNP-VNTR haplotyping.</a> Annals of Human Biology. 38 (5), 564-569 (2011).</li>
<li>Sajib, A. A., Yeasmin, S., Akter, M., Uddin, M. A., Akhteruzzaman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+analysis+of+Bangladeshi+population+with+reference+to+D1S80+VNTR+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresearch+Communications%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic analysis of Bangladeshi population with reference to D1S80 VNTR locus.</a> Bioresearch Communications. 2 (1), 146-151 (2016).</li>
<li>Köseler, A., Atalay, A., Atalay, E. Ö <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allele+frequency+of+VNTR+locus+D1S80+observed+in+Denizli+province+of+Turkey%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+genetics%22%5BJournal%5D)">Allele frequency of VNTR locus D1S80 observed in Denizli province of Turkey.</a> Biochemical genetics. 47 (7-8), 540-546 (2009).</li>
<li>Mastana, S. S., Papiha, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D1S80+distribution+in+world+populations+with+new+data+from+the+UK+and+the+Indian+sub-continent%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Human+Biology%22%5BJournal%5D)">D1S80 distribution in world populations with new data from the UK and the Indian sub-continent.</a> Annals of Human Biology. 28 (3), 308-318 (2001).</li>
<li>Okuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Japanese+propositus+with+D--+phenotype+characterized+by+the+deletion+of+both+the+RHCE+gene+and+D1S80+locus+situated+in+chromosome+1p+and+the+existence+of+a+new+CE-D-CE+hybrid+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">A Japanese propositus with D-- phenotype characterized by the deletion of both the RHCE gene and D1S80 locus situated in chromosome 1p and the existence of a new CE-D-CE hybrid gene.</a> Journal of Human Genetics. 45 (3), 142-153 (2000).</li>
<li>Campbell, A. M., Williamson, J. H., Padula, D., Sundby, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+PCR+%26+a+Single+Hair+to+Produce+a+%22DNA+Fingerprint.%22%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Biology+Teacher%22%5BJournal%5D)">Use PCR & a Single Hair to Produce a "DNA Fingerprint.".</a> The American Biology Teacher. 59 (3), 172-178 (1997).</li>
<li>Jackson, D. D., Abbey, C. S., Nugent, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+profiling+of+the+D1S80+locus%3A+A+forensic+analysis+for+the+undergraduate+biochemistry+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Education%22%5BJournal%5D)">DNA profiling of the D1S80 locus: A forensic analysis for the undergraduate biochemistry laboratory.</a> Journal of Chemical Education. 83 (5), 774(2006).</li>
<li>Mansoor, S. K., Hussein, E. F., Ibraheem, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+the+Variable+Number+of+Tandem+Repeats+%28VNTR%29+in+DNA+fingerprinting+and+its+application+biological+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22EurAsian+Journal+of+BioSciences%22%5BJournal%5D)">Use the Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) in DNA fingerprinting and its application biological sciences.</a> EurAsian Journal of BioSciences. 14 (2), 2835-2839 (2020).</li>
<li>Beier, K., Schnorrer, S., Hoppe, N., Lenk, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ethical+and+legal+regulation+of+human+tissue+and+biobank+research+in+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Tiss.+EU+Project%22%5BJournal%5D)">The ethical and legal regulation of human tissue and biobank research in Europe.</a> Proceedings of the Tiss. EU Project. , Universitätsverlag Göttingen. (2011).</li>
<li>Aida, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+variations+in+6+mucosal+cell+types+of+gastric+tissue+observed+using+a+novel+quantitative+fluorescence+in+situ+hybridization+method%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">Telomere length variations in 6 mucosal cell types of gastric tissue observed using a novel quantitative fluorescence in situ hybridization method.</a> Human Pathology. 38 (8), 1192-1200 (2007).</li>
<li>Theda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+the+cellular+content+of+saliva+and+buccal+swab+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Quantitation of the cellular content of saliva and buccal swab samples.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-8 (2018).</li>
<li>McMichael, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+from+buccal+swabs+suitable+for+high-throughput+SNP+multiplex+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomolecular+techniques%3A+JBT%22%5BJournal%5D)">DNA from buccal swabs suitable for high-throughput SNP multiplex analysis.</a> Journal of biomolecular techniques: JBT. 20 (5), 232(2009).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).</li>
<li>Destro-Bisol, G., Capelli, C., Belledi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+microevolutionary+patterns+from+allele-size+frequency+distributions+of+minisatellite+loci%3A+a+worldwide+study+of+the+APOB+3%27hypervariable+region+polymorphism%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Biology%22%5BJournal%5D)">Inferring microevolutionary patterns from allele-size frequency distributions of minisatellite loci: a worldwide study of the APOB 3'hypervariable region polymorphism.</a> Human Biology. 72 (5), 733-751 (2000).</li>
<li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+alleles+in+the+3%27end+region+of+human+apoB+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">Structure and function of alleles in the 3'end region of human apoB gene.</a> Chinese Medical Journal. 112 (3), 221-223 (1999).</li>
<li>Renges, H. -H., Peacock, K., Dunning, A. M., Talmud, P., Humphries, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+relationship+between+the+3+%27-VNTR+and+diallelic+apolipoprotein+B+gene+polymorphisms%3A+Haplotype+analysis+in+individuals+of+European+and+South+Asian+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic relationship between the 3 '-VNTR and diallelic apolipoprotein B gene polymorphisms: Haplotype analysis in individuals of European and South Asian origin.</a> Annals of Human Genetics. 56 (1), 11-33 (1992).</li>
<li>Kravchenko, S. A., Maliarchuk, O. S., Livshits, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+population+genetics+study+of+the+allelic+polymorphism+in+the+hypervariable+region+of+the+apolipoprotein+B+gene+in+the+population+of+different+regions+of+Ukraine%5BTitle%5D)+AND+%22Tsitologiia+i+Genetika%22%5BJournal%5D)">A population genetics study of the allelic polymorphism in the hypervariable region of the apolipoprotein B gene in the population of different regions of Ukraine.</a> Tsitologiia i Genetika. 30 (5), 35-41 (1996).</li>
</ol>

著者らは開示する利益相反を持っていません。

ここでは、学部の実務授業で分子フィンガープリントを実装するための簡単でコスト効率の高い方法について説明しました。
D1S80遺伝子の遺伝子変異をスクリーニングするには、ヒト生物学的サンプル収集とDNA抽出および分析が必要です。人間の生物学的標本の倫理的使用は、プロセス全体を通して確実にすることが不可欠です。サンプル管理は、サンプルおよび関連データ18の正しい使用を保証する包括的な規制フレームワーク内で制御される(例えば、ヒト生物学的物質の使用に同意する)。参加者は、サンプルの使用、遺伝的関係の異常の発見のリスク(関連する個人の場合)、プライバシー保護、および生物学的標本およびデータの将来の保存のための意図について適切に知らされなければなりません。すべての寄付者(学生または同僚)は、自由に同意を与え、理由を与えずに撤退する権利を理解しなければなりません。一般に、この実習クラスを実施する前に、人間のサンプル管理に関するガイドラインや規制を理解しておくことが不可欠です。
学部の研究室のコースで頬粘膜上皮細胞の収集のために、オペレータまたはDNasesからのDNAとDNAサンプルの汚染を避けるために注意する必要があります。ラボコート、手袋、保護メガネ、滅菌綿棒、マイクロ遠心チューブを常に使用することをお勧めします。Buccal綿棒ベースの細胞収穫は、比較的安価で非侵襲的であるため、PCRベースのVNTR分析に適した遺伝物質の収集に便利で費用対効果の高い方法と考えられています。頬の綿棒の他に、唾液は医学研究のための最も一般的な経口サンプリング方法である。頬棒は唾液よりも上皮細胞の割合が高いことが示されており、PCRベースのD1S80 VNTR解析19,20に対してDNAの十分な量および質を提供する際の信頼性が高いことが示されている。さらに、例えば人口多様性研究21で使用すると、自己収集が地理的障害を克服した後に送り出すことができる。
DNAの抽出は、異なる企業からの抽出キットの開発により比較的容易になっています。しかし、これらのキットの使用は限られた財源のために実験室のクラスで適していないかもしれません。ここでは、市販のDNA抽出キットを必要とせずに、ヒトサンプルからDNAを抽出するための簡単で迅速かつコスト効率の高い方法を発表しました。記載したDNA抽出法は、有機溶媒を使用せず、代わりに8M酢酸カリウム溶液を用いて塩濃度を上昇させることにより細胞タンパク質が除去される。この方法はまた、一度に複数のサンプルを処理し、各サンプルのいくつかの遺伝子型分析のための十分なDNAを得ることができます。
PCR は、多くの分子ラボで一般的な手法です。一般的にトラブルフリーですが、他の22で議論されている偽の結果を生み出す反応を複雑にする可能性のある落とし穴があります。ここで示したPCR条件は、テンプレートDNAの品質が悪い面では非常に堅牢に見えましたが、バッカル上皮細胞の収穫不良のためにDNA濃度が極めて低いテンプレートを使用する場合、PCR増幅の欠如は時折観察されました。本研究で用いられたDNAプライマーは、本論文の最後にある資料表に引用されているような、さまざまな企業から注文することができる。DNasesまたはDNAとの汚染を避けるために、DNAプライマーを使用する場合は、特別な注意が必要です。PCR製品は、使用しない場合も冷たく保つ必要があります。
もう一つの重要なステップはアガロースゲル電気泳動である。16bpの1つの繰り返し単位のみによって異なる断片は、ゲル電気泳動中で分離されず、したがって単一のバンドとして現れる。この場合、テストされた D1S80 対立元素の繰り返し単位数の適切な決定は保証できません。したがって、ゲルの実行時間を増やす必要がある一方で電圧を低減する必要があり、ゲル濃度を上げると、単一バンドの分解と分離が向上します。
VNTR遺伝子座のすべての対立遺伝子に完全な反復単位が含まれているわけではないことは言及する価値があります。不完全な反復単位を含む非コンセンサス対立遺伝子(微量変量)は、ほとんどのVNTR遺伝子座で一般的であり、そのサイズは完全な反復単位を有する対立遺伝子のサイズ間に入る。これらの微量変量はアガロースゲル電気泳動によってほとんど検出できない。対照的に、ポリアクリルアミドゲルまたは毛細管電気泳動のような技術は、1〜数個の反復単位または微量変量12、23、24、25、26によって異なる対立アレルを解決することができる。しかし、 後者の技術は、危険な化合物の使用、複雑な準備、機器の不足など多くの欠点があるため、学部の研究室の授業には適していません。フラグメントサイズの決定には、移動したDNA断片の距離を測定する際には特別な注意が必要です。バンドが拡散しすぎて正確に測定できない場合、線形回帰によるD1S80アレスフラグメントサイズの計算が不正確になり、繰り返し単位数の推定が誤る可能性があります。その場合、ゲル条件を最適化した後のアガロースゲル電気泳動の再実行は、ローレンツと同僚22によって先に述べたように推奨される。
ここで提示される D1S80 VNTR分析手順全体を、頬上皮細胞採取からフラグメント長評価まで、単一の作業日で完了してもよい。このプロトコルは、学部の実用的な実験室のクラスに適した堅牢で、コスト効率が良く、使いやすい方法です。

分子フィンガープリントは、DNAフィンガープリントとも呼ばれ、1984年にレスター大学の遺伝学科で働いていたときにアレック・ジェフリーズ卿によって導入されました。これは、個人間で異なるヒトゲノムの0.1%に基づいており、約300万の変異体で構成されています。遺伝子型のこれらのユニークな違いは、個人間の差別化を可能にし、したがって、単一体性双生児を除く遺伝的指紋として機能することができる。その結果、DNAフィンガープリントは、例えば父性検査や集団多様性研究で適用される異なる個体の関連度の推定に使用される。研究室の授業では、DNAフィンガープリントとアリール周波数の概念を伝えることを目指しました。ここで説明する方法は 、D1S80 遺伝子座におけるタンデム反復数(VNTR)を解析することにより、遺伝的フィンガープリントの信頼性と堅牢性の高い方法を示しています。この方法は、バッカル粘膜上皮細胞からのDNAの抽出および後のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含み 、D1S80 遺伝子座を増幅し、続いてアガロースゲル上の断片長差の可視化を行う。
D1S80 VNTRの小型衛星の軌跡は非常に可変的であり、染色体1(1p36-p35)のテロメリック領域に位置する。1990年にカルザイと同僚によって16bpのコア反復ユニットを有する軌跡として同定され、記述され、1つのユニット2によって異なる対立遺伝子の分離を可能にした。さらに、D1S80は、約7.77 x10-53の突然変異率を有する高い変動を示す。D1S80は、ヘテロ接合性4,5の高い程度を有する(例えば、白人6人の場合は80.8%のヘテロ接合性、アフリカ系アメリカ人のヘテロ接合性は最大87%である7)。さらに、D1S80遺伝子座はほとんどの集団で多形性であり、通常は14〜41を繰り返す15以上の異なる対立遺伝子を有する。D1S80対立の頻度は集団によって異なる。24の反復ユニット(アリール24)を有するアレスはヨーロッパとアジアの集団で最も頻繁であるが、アアレ21はアフリカの集団4、7、8、9、10で最も一般的である。したがって、アレル頻度分布は、異なるヒト集団の診断であり、関連度の推定(例えば、父性検定)のために考慮される必要がある。 
D1S80 VNTR遺伝子座のPCRベースの増幅は、法医学、父性検査、疾患分析および集団多様性研究11、12、13、14において非常に有用な方法であった。今日の法医学ではVNtRの使用は短いタンデム反復によって置き換えられましたが、D1S80 VNTR遺伝子座は、集団4、8、9、11の間の起源と遺伝的関係の決定に広く使用されています。さらに、実用的な実験室クラス15、16でDNAフィンガープリントを教えるためによく使用されます。ここで説明する方法は、学部の研究室の授業で非常に高い成功率を持つ堅牢で費用対効果が高く、使いやすい方法を表しています。本稿の目的は、ヒトD1S80ミニサテライト軌跡の分子解析のワークフローの概要を、頬粘膜上皮細胞から提供することです。これには、技術のデモンストレーション、簡略化されたプロトコル、および以前に公開された作品2、17で説明した実用的な提案が含まれています。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 微量遠心チューブ</td><td>Sarstedt</td><td>72,706</td><td>オートクレーブ</td></tr><tr><td>2 mL 微量遠心チューブ</td><td>Sarstedt</td><td>7,26,95,500</td><td>オートクレーブ</td></tr><tr><td>2-プロパノール</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>PI7508/17</td><td></td></tr><tr><td>5x PCR バッファー</td><td>Promega</td><td>M7845</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>Sigma/Merck</td><td>A6283-500ML</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>BioBudget</td><td>10-35-1020</td><td></td></tr><tr><td>頬側スワブ</td><td>BioBudget</td><td>57-BS-05-600</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>5430</td></tr><tr><td>Combs</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTPs (10 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>R0192</td><td></td></tr><tr><td></td><td>EDTA Carl Roth</td><td>8043.1</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Honeywell</td><td>32221-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>ゲルキャスター</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ゲルチャンバー</td><td>BioRad</td><td></td><td>SubCell GT</td></tr><tr><td>Gel Doc XR+</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geltray</td><td>BioRad</td><td></td><td>SubCell GT</td></tr><tr><td>GeneRuler 50 bp DNA Ladder</td><td>Thermo Fisher</td><td>SM0371</td><td></td></tr><tr><td>Go-Taq Polymerase</td><td>Promega</td><td>M7845</td><td></td></tr><tr><td>Heating block</td><td>エッペンドルフ</td><td>サーモミキサー</td><td>1.5 mL および 2 mL</td></tr><tr><td>マイクロ波</td><td>シャープ</td><td></td><td>R-941STW</td></tr><tr><td>peqGreen</td><td>VWR</td><td>&nbsp;〒732-3196&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ピペット</td><td>Gilson</td><td></td><td>1000 & micro;L、200 &micro;L、20 &micro;L、2、マイクロ;L</td></tr><tr><td>酢酸カリウム</td><td>Arcos Organics 217100010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerPac 電源</td><td>BioRad</td><td></td><td>100-120/220-240V</td></tr><tr><td>プライマー</td><td>Sigma/Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scale</td><td>カーン</td><td></td><td>PCB 2.5 kg</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Arcos Organics 218591000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>IKA labortechnik</td><td></td><td>IKA RH basic</td></tr><tr><td>卓上遠心分離機</td><td>myFuge</td><td></td><td></td></tr><tr><td>サーマルサイクラー</td><td>BioRad</td><td></td><td>C100 Touch</td></tr><tr><td>Tris</td><td>VWR</td><td>103156x</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>LMS</td><td></td><td>VTX-3000L</td></tr></tbody></table>

d1s80ローカスを用いたdnaフィンガープリントのラボクラスへの応用

Application of DNA Fingerprinting using the D1S80 Locus in Lab Classes

生物科学では、DNAフィンガープリントは、父性検査、法医学的応用、系統学的研究に広く使用されています。ここでは、学部の研究室の授業の文脈でタンデム反復(VNTR)の可変数(VNTR)分析によって個人をジェノタイピングするための信頼性と堅牢な方法を説明します。ヒト D1S80 VNTR遺伝子座は、反復配列の数の変動に基づいて、このプロトコルで非常に多形マーカーとして使用されます。
この簡単なプロトコルは、教師のための有用な情報と実用的な実験室のクラスでのDNAフィンガープリントの実装を伝えます。本研究室での研究では、DNA抽出後にPCR増幅を行い 、D1S80 VNTR遺伝子座の遺伝的変異を決定します。PCR産物のフラグメントサイズの違いはアガロースゲル電気泳動によって可視化されます。フラグメントサイズと繰り返し数は、DNAサイズ標準のサイズと移動距離の線形回帰に基づいて計算されます。
このガイドに従って、受講者は次のことが可能になります。
• 頬粘膜上皮細胞からDNAを採取し、抽出する • PCR実験を行い、様々な反応成分の機能を理解する • アガロースゲル電気泳動によるアンプリコンの解析と結果の解釈 • DNAフィンガープリントにおけるVNTRの使用と生物科学への応用を理解する

上記プロトコルを用いて、スワブサンプリングにより採取した頬粘膜上皮細胞から抽出したヒトゲノムDNAに対して D1S80 VNTRマーカー解析を行った(図6)。PCRを用いた増幅に続いて 、D1S80 アンプリコンを含むアガロースゲルの典型的な表現を 図1に示す。レーン1は、50bp分子量標準を示す。分子量基準の横に、8つの学生サンプルからのPCR産物が可視化されます。レーン10は、テンプレートDNAの代わりに水が使用されたNTCを示す。分析されたサンプルのほとんどは 、D1S80 遺伝子座の個体ヘテロ接合を表す2つのバンドを明確に表示する。レーン2およびレーン9は 、D1S80 軌跡に対する個人ホモ接合体を表す単一のバンドを示す。レーン5は、他のバンドと比較してはるかに広いあいまいなシングルバンドを示しています。これは、2つの D1S80 対立が1つの繰り返しユニットで異なる結果である可能性があります。さらなる分析のために、レーン5におけるサンプルは、ホモ接合体個体を表す単一のバンドとみなされる。
検証済みPCR産物に対して行われた下流ゲル電気泳動フラグメント解析は、異なる学生サンプルのD1S80 VNTR遺伝子座のサイズコールに使用した。PCR分析により得られるアンプリコンサイズの解釈は、使用される分子量基準に依存する。分子量標準の各バンドのウェルからの距離を測定し(図1)記録した(図2)。サイズと移動距離に基づいて、個々のバンドのサイズを線形回帰分析を使用して計算することができます。このログ(基数10)は、学生サンプル(図5)の各バンドについて決定し、それぞれのアンチログは各アンプリコンのbp数を表す。リピート単位数は、得られたアンプリコンサイズに従って計算することができる(表2)。
各学生サンプルについて、アンプリコンサイズを線形回帰で計算し、表2に示すように各バンドを特定のアリールに簡単に割り当てることができる。D1S80の集合体サイズに関する情報は、学部生の小集団の中でアリール周波数を決定するために使用することができます。28リピートアリールは、この繰り返しアレーレ(個体1および4)のための2人のホモ接合個人のために学生の間で最も頻繁である。2番目に頻繁なアレスは、ホモ接合体個体8およびヘテロ接合体個体6によって運ばれる18反復アリールである。低周波対立体は、それぞれ個体6、5、3に1回しか見つからない21、26、30回の反復対立体である。小学生集団のD1S80 VNTR遺伝子座のアレール周波数パターンは、より大きな人口のアレール頻度、例えば、異なる大陸4、7、8、9、10から発生する集団と比較することができる。
学生の間で、個人2と3は24反復アレーレを共有し、個人2と7は20反復アレーレを共有し、個人5と7は23反復アレーレを共有しています。興味深いことに、2人の D1S80 ホモ接合体(個1および4)は28反復アレーレを共有する。2人の個人間で対立感を一致させることは、潜在的な関連性を示すことができます。しかし、共有対立者も偶然に発生する可能性があります。したがって、2人の個人間の対立差の可能性を判断することが重要です。尤度は、一般集団における個々の対立アレスの対立頻度に依存し、統計アプローチは、ベイズアプローチのようなVNTRマーカー分析に統計的重みを付けるために採用されるべきである。要約すると、提示されたフィンガープリント法は、DNAフィンガープリントにおけるVTRの使用と生物科学への応用を教えるために実践的なクラスの実践で利用することができる。
<img alt="DNA電気泳動ゲル、PCR結果解析、バンド分離、分子量ラダー。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62305/62305fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図1:50bp分子量標準レーンの横に定規を置いた D1S80 増幅産物の電気泳動後のアガロースゲルの表現 レーン1は50bp分子量標準を含み、レーン2~9にはPCR反応生成物が含まれています。レーン 10 には、テンプレートなしコントロール (NTC) が含まれています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62305/62305fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="スプレッドシート内のDNAサイズと距離データ。対数変換式=LOG10(A9)が描かれています。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62305/62305fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 図2:50bp分子量標準の各フラグメントサイズのDNA断片移動距離及び対数の判定 50bp分子量規格の各バンドに対するウェル(cm単位)からの距離が記録され、各フラグメントの対数(基数10)が決定される。値は、表計算プログラムを使用してテーブルに入力されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62305/62305fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="ゲル電気泳動結果チャート、log(bp)対距離、DNA断片分離分析を示します。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62305/62305fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 図3:X軸上の分子量標準のDNA断片移動距離を、y軸上の各断片のサイズの対log(基部10)にプロットして生成した散布図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62305/62305fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="DNAバンド移動の対数回帰グラフ。距離vs. log(bp)、線形近似R²=0.9967。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62305/62305fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 図4:線形回帰直線と回帰式、およびデータのR2値の活用。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62305/62305fig04large.jpg" target="_blank"></a>
<img alt="対立遺伝子距離と計算用のExcel式を含む遺伝子解析データ表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62305/62305fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 図5: D1S80アンプリコンのサイズの決定各フラグメントのウェルからの距離が回帰式に入力されます。y値のアンチログは、bpでフラグメントサイズを表<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62305/62305fig05large.jpg" target="_blank">します</a>。
<img alt="DNA解析ワークフロー:PCR、電気泳動、フラグメント長によるVNTR解析の図。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62305/62305fig6v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> 図6: D1S80 VNTR解析の推奨タイムラインとワークフロー ここで提示される D1S80 VNTR分析手順全体を、頬上皮細胞採取からフラグメント長評価まで、単一の作業日以内に完了してもよい。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62305/62305fig6v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>アレールサイズ (bp)</td>
			<td>繰り返し回数</td>
		</tr>
<tr>
<td>369</td>
			<td>14</td>
		</tr>
<tr>
<td>385</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>401</td>
			<td>16</td>
		</tr>
<tr>
<td>417</td>
			<td>17</td>
		</tr>
<tr>
<td>433</td>
			<td>18</td>
		</tr>
<tr>
<td>449</td>
			<td>19</td>
		</tr>
<tr>
<td>465</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>481</td>
			<td>21</td>
		</tr>
<tr>
<td>497</td>
			<td>22</td>
		</tr>
<tr>
<td>513</td>
			<td>23</td>
		</tr>
<tr>
<td>529</td>
			<td>24</td>
		</tr>
<tr>
<td>545</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>561</td>
			<td>26</td>
		</tr>
<tr>
<td>577</td>
			<td>27</td>
		</tr>
<tr>
<td>593</td>
			<td>28</td>
		</tr>
<tr>
<td>609</td>
			<td>29</td>
		</tr>
<tr>
<td>625</td>
			<td>30</td>
		</tr>
<tr>
<td>641</td>
			<td>31</td>
		</tr>
<tr>
<td>657</td>
			<td>32</td>
		</tr>
<tr>
<td>673</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td>689</td>
			<td>34</td>
		</tr>
<tr>
<td>705</td>
			<td>35</td>
		</tr>
<tr>
<td>721</td>
			<td>36</td>
		</tr>
<tr>
<td>737</td>
			<td>37</td>
		</tr>
<tr>
<td>753</td>
			<td>38</td>
		</tr>
<tr>
<td>769</td>
			<td>39</td>
		</tr>
<tr>
<td>785</td>
			<td>40</td>
		</tr>
<tr>
<td>801</td>
			<td>41</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:各D1S80 VNTR軌跡のアンプリコンサイズ。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>個体</td>
			<td>対立遺伝子</td>
			<td>距離 (cm)</td>
			<td>サイズ (bp)</td>
			<td>繰り返し単位数</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>ホモ接合</td>
			<td>5</td>
			<td>600</td>
			<td>28</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>ヘテロザイグース</td>
			<td>5.2 ;5.5</td>
			<td>535, 458</td>
			<td>24, 20</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>ヘテロザイグース</td>
			<td>4.9 ;5.2</td>
			<td>626, 535</td>
			<td>30, 24</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>ホモ接合</td>
			<td>5</td>
			<td>600</td>
			<td>28</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>ヘテロザイグース</td>
			<td>5.1 ;5.3</td>
			<td>564, 508</td>
			<td>26, 23</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>ヘテロザイグース</td>
			<td>5.4 ;5.6</td>
			<td>483, 435</td>
			<td>21, 18</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>ヘテロザイグース</td>
			<td>5.3 ;5.5</td>
			<td>508, 458</td>
			<td>23, 20</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>ホモ接合</td>
			<td>5.6</td>
			<td>435</td>
			<td>18</td>
		</tr>
</tbody></table>表2:テストした異なる個体のアレレ組成物。 リピート単位数は、線形回帰分析により得られるアンプリコンサイズに応じて近似することができる。

ここでは、上皮細胞DNAからVNTR遺伝子座 D1S80 を増幅することによりDNAフィンガープリントプロファイルを生成する簡単なプロトコルについて説明する。

D1S80ローカスを用いたDNAフィンガープリントのラボクラスへの応用

In biological sciences, DNA fingerprinting has been widely used for paternity testing, forensic applications and phylogenetic studies. Here, we describe a ...

DNAフィンガープリントは生物科学の一般的なツールであり、父性検査だけでなく、法医学的または系統学的研究にも適用されます。このプロトコルは、学部生に研究室の授業におけるDNAフィンガープリントの基本原則を提供するように設計されています。これは、ヒトD1S80遺伝子座、タンデム反復領域の可変数に基づいており、対立遺伝子は個人間で長さが異なる可能性があります。DNA抽出、PCR、ゲル電気泳動、およびその後の分析は、特に初めて行った場合に実行するのが難しい場合があります。すべてのステップの視覚的なデモンストレーションは、この非常に堅牢なプロトコルを実行しながら取られなければならない一般的な練習、詳細、および予防措置を観察することができます。頬粘膜上皮細胞からDNAを抽出するには、まず滅菌口綿棒を用いて細胞を採取することから始める。綿棒を使って頬の内側を30~40秒間激しくこすります。コレクションの先端をラベル付きの無菌マイクロ遠心分離チューブに入れ、端を越えて伸びるプラスチックの長さを断ち切り、チューブを閉じます。暖房ブロックを摂氏65度に予熱し、必要なすべてのバッファーと溶液を準備します。綿棒に500マイクロリットルの溶解液を加え、サンプルが溶解液に完全に浸漬され、サンプルが少なくとも5秒間渦液であることを確認します。サンプルを摂氏65度で10分間インキュベートし、渦を時々起用します。インキュベーション後、綿棒をチューブウォールに押し付けて取り外し、最大サンプル量を得る。細胞をライスするために100マイクロリットル変性バッファーを加え、白い沈殿物が見えるまでチューブを反転させることで十分に混合します。室温で5分間インキュベートし、サンプルを17、950 G.Transfer 450マイクロリットルの清浄な1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に5分間遠心分離します。その後、450マイクロリットルのiso 2-プロパノールを加え、チューブを反転してDNAを沈殿させることで十分に混合します。室温で5分間、遠心分離機で5分間インキュベートします。上清を捨て、きれいなペーパータオルでチューブを反転させ、ペレットを乾燥させます。500マイクロリットルの70%エタノールでDNAを洗浄し、遠心分離機を1分間すぐに洗い流し、上清を捨てます。ペレットを完全に乾燥させるために、サンプルを加熱ブロックで摂氏65度で5分間インキュベートします。最後に、溶出バッファーの 30 マイクロリットルを追加し、65°C で 10 分間インキュベートして DNA sys を不活性化します。マイクロ遠心チューブに緑色のPCRバッファー、DMP、プライマー、水、ポリメラーゼを加えてマスターミックスを準備します。PCR のサンプル数と 45 マイクロリットルの PCR マスター ミックスを各 PCR チューブにラベル付けします。次に、5マイクロリットルのDNAを追加するか、テンプレートなしのコントロールのために水を加えます。PCRチューブを閉じ、遠心分離します。チューブをサーマルサイクラーに入れ、PCR プログラムを開始します。プログラムが完了したら、さらに処理するまで、摂氏4度でサンプルを保存します。アガロース粉末の1 1/2グラムを計量し、ボトル内のTAE緩衝液の100ミリリットルと混合することによって1.5%アガロースゲルを調製します。アガロース混合物を電子レンジで慎重に加熱し、アガロースが完全に溶解するまで混合物を渦巻きます。沸騰の遅延が発生する可能性があることに注意してください。アガロース混合物を短く冷却した後、ペックグリーンの2マイクロリットルを追加します。ゲルを注ぎ、サンプルに十分なウェルを持つ櫛を使用します。アガロースゲルを完全に重合した後、各PCRサンプルの10マイクロリットルでウェルをロードし、横並ぶウェルに分子量標準を追加します。ゲルを約40分間150ボルトで動かします。PCR産物を可視化するために、紫外線を用いてゲルを画像化する。増幅されたD1S80対立体の分析のために、写真のゲル画像のウェルから始まる分子量基準の隣に定規を置きます。重量規格の各バンドの距離を測定し、表計算プログラムで長さを記録します。次に、重量標準の各フラグメントサイズの対数を決定する。ログ変換された重量標準のフラグメント サイズとゲルからの測定距離を使用して散布図を挿入します。傾向線を合わせ、回帰式と R-2 乗値を表示します。新しい表に、PCR アンプリコンからウェルまでの測定距離を挿入します。これらのアンプリコンのサイズを決定するには、線形回帰の回帰式を使用し、アンチログを計算して、アンプリコンから塩基対のフラグメントサイズを取得します。最後に、各測定されたアンプリコンに16塩基対の繰り返し単位を割り当てます。D1S80遺伝子座のDNA抽出および増幅は、研究対象者全員に対して成功し、レーン10におけるノーテンプレート制御はアンプリコンを示さなかった。フラグメント長分析から、個体は2つの対立アレスを有するホモ接合またはヘテロ接合体に分類された。タンデム反復の繰り返し単位の数は明らかに関連しており、さらなる分析に役立つようになりました。ここでは、学部の実務授業で分子フィンガープリントを実装するための簡単で費用対効果の高い方法について説明します。全体の手順は、1 つの作業日内で完了することができ、4 つの異なるステップで構成されます。最初のステップでは、DNAテンプレートが調製される。頬上皮細胞は綿棒の採取によって収穫される。経口綿棒は、DNA抽出のための細胞の十分な量と質を提供するための信頼性の高いツールです。さらに、DNA抽出プロトコルは、有機溶媒を使用していないため、学部の研究室の授業で有利です。ステップ1は90分以内に完了することができます。第2のステップでは、D1S80遺伝子座はPCRによって増幅される。ここで示す PCR 条件は、DNA テンプレートの品質が悪い場合でも堅牢です。このステップは2時間半で完了できます。PCR産物はアガロースゲル電気泳動により分析されます。アガロースゲル電気泳動は、危険成分の回避や簡単な調製技術など、他の技術と比較して多くの利点があります。この分析は90分で完了できます。電気泳動後、フラグメント長の結果は、線形回帰分析、または表計算プログラムを使用して実行するか、単純な計算機を使用して90分以内に分析することができます。要約すると、提示されたフィンガープリント法は、分子マーカーの使用と生物科学への応用を教えるために実践的な実用法で利用することができる。

application-of-dna-fingerprinting-using-the-d1s80-locus-in-lab-classes

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

この出版物は、DNAを抽出し、PCRとRFLP解析を行うことにより、魚の種を識別するために、アジレントの魚種の識別システムを使用する方法について説明します。...

DNAベースの魚種の識別プロトコル

アメリカのナキウサギのために示されるように我々は、効率的にとらえどころのない小さな哺乳類から毛髪サンプルを収集するために非侵襲的サンプリングの手法を提示する。我々は、サンプリングされた髪の毛からDNAを抽出し、一般的に野生動物の生態と保全の研究で使用されている分子マーカーのいくつかのタイプを増幅することによってこの方法の有用性を実証する。...

見つけにくい小型哺乳類から高品質のDNAを得るために非侵襲ヘアサンプリング法

によって引き起こされるハンセン病、...

のDNAフィンガープリント<emらい>結核</em可変数のタンデムリピート（VNTR）を使用>菌株 - 断片長解析（FLA）

細胞生物学の基本的なクエストは、真核生物の細胞を作る細胞内小器官のアイデンティティの根底にあるメカニズムを定義することです。ここでは、蛍光顕微鏡と次世代シーケンシングツールを用いた植物オルガネラの形態と機能の整合性の責任遺伝子を同定する手法を提案する。...

蛍光顕微鏡スクリーニングと次世代シーケンシング：オルガネラの整合性に関与する遺伝子の同定のための有用なツール

私たちは、直接標識蛍光プローブを用いた3次元のDNA...

直接標識プローブを用いた堅牢な3DのDNA FISH

ここでは、の回復を可能にするために、一緒にワンステップ5μlのマイクロボリューム溶解/ STR増幅を含む強化された増幅プロトコルで、サンプル「DNA触れる」を中に存在するバイオ粒子の収集のために最適化され、効率的な除去戦略を説明短いタンデムリピート（STR）バイオ粒子ドナー（単数または複数）のプロファイル。...

法医学インチタッチDNA」の証拠から簡体マイクロマニピュレーションにより回収する単一のヒト生体粒子の強化された遺伝解析

このプロトコルは、Drosophila melanogasterのXまたはY染色体リボソームDNA遺伝子座に由来するリボソームRNA転写産物を区別するための一塩基多型感受性蛍光in...

Drosophila melanogasterにおける遺伝子座特異的リボソームRNA転写の一塩基多型感受性FISH検出

この原稿では、細菌の転写を標的とする抗菌剤の転写と阻害活性を機能的に調べるためのプロトコールについて記載します。...

in vitro転写アッセイおよび創薬への応用

この記事では、 すなわち 、テロワールの概念を洞察するために、ベリー品質形質に対する環境の影響をブドウ果実の転写産物および代謝物への非標的メタボロミクス、トランスクリプトミクスと多変量統計解析のアプリケーションについて説明します。...

グレープベリーメタボロミクスとトランスクリプトを通して解釈テロワールコンセプト

ショウジョウバエの卵形成は、ミトコンドリアの増殖と遺伝の研究において非常に有用であり続けています。この原稿では、ショウジョウバエの成体卵巣の複製ミトコンドリアDNA(mtDNA)を5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)で標識するために使用される詳細なプロトコルについて説明しています。これにより、以前は議論の余地があったミトコンドリア遺伝に関連するメカニズムの解明が容易になります。...

EDU染色によりショウジョウバエアダルト卵巣内のミトコンドリアDNA複製のその場の標識で

学ぶ D1S80ローカスを用いたDNAフィンガープリント法。口腔粘膜細胞からのDNA抽出、PCR増幅、ゲル電気泳動を含む実習向けプロトコルで、分子遺伝学の基礎技術を習得できます。

D1S80ローカスを用いたDNAフィンガープリントのラボクラスへの応用

さらに動画を探す