Name: ヒト骨格筋微小組織における骨格筋の健康の機能指標の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 学ぶ MyoTACTICプラットフォームを用いた3Dヒト骨格筋微小組織の作製と収縮力・カルシウム動態の評価法。筋肉生物学、疾患モデリング、創薬研究への応用が可能です。

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私たちは、モハマド・アフシャール、ハーベン・アブラハ、モフセン・アフシャル・バクーシュリ、およびサデグ・ダブーディがMyoTACTIC文化プラットフォームの発明に貢献し、ここに記載されている捏造および分析方法を確立してくれたことに感謝します。HLは、オルガン・オン・チップ・エンジニアリング・アンド・アントレプレナーシップ奨学金の自然科学・工学研究評議会(NSERC)トレーニング・プログラムとトロント大学ワイルドキャット大学院奨学金から資金を受け取りました。PMGは内因性修復のカナダ研究委員長であり、オンタリオ州再生医療研究所、幹細胞ネットワーク、カナダ第一研究優秀プログラムである医学によるデザインからの研究の支援を受けています。スケマティック ダイアグラムは、BioRender.com を使用して作成されました。

<ol><li>Frontera, W. R., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+Muscle%3A+A+brief+review+of+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Skeletal Muscle: A brief review of structure and function.</a> Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).</li>
<li>McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+Duchenne+muscular+dystrophy%3A+From+basic+mechanisms+to+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22DMM+Disease+Models+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Animal models of Duchenne muscular dystrophy: From basic mechanisms to gene therapy.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (3), 195-213 (2015).</li>
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<li>DiMasi, J. A., Hansen, R. W., Grabowski, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+price+of+innovation%3A+New+estimates+of+drug+development+costs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Health+Economics%22%5BJournal%5D)">The price of innovation: New estimates of drug development costs.</a> Journal of Health Economics. 22 (2), 151-185 (2003).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li>
<li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-screening+platform+based+on+the+contractility+of+tissue-engineered+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+and+Nerve%22%5BJournal%5D)">Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle.</a> Muscle and Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).</li>
<li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+drug+screening+with+contractile+muscle+tissue+engineered+from+dystrophic+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Automated drug screening with contractile muscle tissue engineered from dystrophic myoblasts.</a> The FASEB Journal. 23 (10), 3325-3334 (2009).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinted+human+skeletal+muscle+constructs+for+muscle+function+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3D bioprinted human skeletal muscle constructs for muscle function restoration.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12307(2018).</li>
<li>Takahashi, H., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+human+contractile+myofiber+sheets+as+a+platform+for+studies+of+skeletal+muscle+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Engineered human contractile myofiber sheets as a platform for studies of skeletal muscle physiology.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li>
<li>Afshar Bakooshli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+culture+model+of+innervated+human+skeletal+muscle+enables+studies+of+the+adult+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction.</a> eLife. 8, 1-29 (2019).</li>
<li>Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+human+myobundles+mimic+clinical+responses+of+skeletal+muscle+to+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs.</a> eLife. 2015 (4), 3-5 (2015).</li>
<li>Urciuolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+3D+in+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+at+the+single+fiber+scale%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale.</a> PLoS One. 15 (5), 0232081(2020).</li>
<li>Cvetkovic, C., Rich, M. H., Raman, R., Kong, H., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D-printed+platform+for+modular+neuromuscular+motor+units%5BTitle%5D)+AND+%22Microsystems+%26+Nanoengineering%22%5BJournal%5D)">A 3D-printed platform for modular neuromuscular motor units.</a> Microsystems & Nanoengineering. 3 (1), 1-9 (2017).</li>
<li>Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+contractile+muscle+tissue+consisting+of+human+skeletal+myocyte+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line.</a> Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).</li>
<li>Capel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+3D+printed+molds+for+human+tissue+engineered+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20(2019).</li>
<li>Gholobova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tissue-engineered+skeletal+muscle%3A+a+novel+3D+in+vitro+model+for+drug+disposition+and+toxicity+after+intramuscular+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human tissue-engineered skeletal muscle: a novel 3D in vitro model for drug disposition and toxicity after intramuscular injection.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li>
<li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28ALS%29+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Science Advances. 4 (10), 5847(2018).</li>
<li>Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+human+pluripotent+stem+cells+into+a+functional+skeletal+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li>
<li>Maffioletti, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+human+iPSC-derived+artificial+skeletal+muscles+model+muscular+dystrophies+and+enable+multilineage+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering.</a> Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).</li>
<li>Chal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+muscle+fibers+and+satellite-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).</li>
<li>Khodabukus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+stimulation+increases+hypertrophy+and+metabolic+flux+in+tissue-engineered+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle.</a> Biomaterials. 198, 259-269 (2019).</li>
<li>Nagashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+tissues+with+contractility+fabricated+by+immortalized+human+myogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biosystems%22%5BJournal%5D)">In vitro model of human skeletal muscle tissues with contractility fabricated by immortalized human myogenic cells.</a> Advanced Biosystems. , 2000121(2020).</li>
<li>Mills, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+human+skeletal+micro+muscle+platform+with+pacing+capabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Development of a human skeletal micro muscle platform with pacing capabilities.</a> Biomaterials. 198, 217-227 (2019).</li>
<li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+tissue+gauges+to+measure+and+manipulate+forces+from+3D+microtissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microfabricated tissue gauges to measure and manipulate forces from 3D microtissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (25), 10097-10102 (2009).</li>
<li>Prüller, J., Mannhardt, I., Eschenhagen, T., Zammit, P. S., Figeac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells+delivered+in+their+niche+efficiently+generate+functional+myotubes+in+three-dimensional+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Satellite cells delivered in their niche efficiently generate functional myotubes in three-dimensional cell culture.</a> PLOS One. 13 (9), 0202574(2018).</li>
<li>Sakar, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+optogenetic+control+of+engineered+3D+skeletal+muscle+bioactuators%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators.</a> Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+to+monitor+statin-induced+myopathy+in+individual+engineered+skeletal+muscle+myobundles%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A system to monitor statin-induced myopathy in individual engineered skeletal muscle myobundles.</a> Lab on a Chip. 18 (18), 2787-2796 (2018).</li>
<li>Rajabian, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+skeletal+muscle+as+a+model+of+muscle+aging+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Bioengineered skeletal muscle as a model of muscle aging and regeneration.</a> Tissue Engineering Part A. 27 (1-2), 74-86 (2020).</li>
<li>Afshar, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+96-well+culture+platform+enables+longitudinal+analyses+of+engineered+human+skeletal+muscle+microtissue+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6918(2020).</li>
<li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+pathological+human+myoblasts%3A+Towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skeletal Muscle. 1 (1), 34(2011).</li>
<li>Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Bakooshli, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+model+of+human+skeletal+muscle+innervated+with+stem+cell-derived+motor+neurons+enables+epsilon-subunit+targeted+myasthenic+syndrome+studies%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">A 3D model of human skeletal muscle innervated with stem cell-derived motor neurons enables epsilon-subunit targeted myasthenic syndrome studies.</a> BioRxiv. , 275545(2018).</li>
<li>Vandenburgh, H. H., Karlisch, P., Farr, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+highly+contractile+tissue-cultured+avian+skeletal+myotubes+in+collagen+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of highly contractile tissue-cultured avian skeletal myotubes in collagen gel.</a> Vitro Cellular & Developmental Biology. 24 (3), 166-174 (1988).</li>
<li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li>
<li>Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+extracellular+matrix+composition+in+structure+and+function+of+bioengineered+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle.</a> Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).</li>
</ol>

著者は宣言する利害の対立を持っていません。

本稿では、基本的な筋生物学、疾患モデリング、または候補分子検査の研究に適用できる3D hMMT培養モデルを作成し、分析する方法について説明します。MyoTACTICプラットフォームはコストに優しく、製造が容易で、骨格筋マイクロ組織を生成するために比較的少数の細胞を必要とします。MyoTACTIC培養プラットフォーム内で形成されたhMMTは、整列、多核、および線条筋のミオチューブから構成され、収縮を引き起こすカルシウム過渡を開始することによって電気刺激に応答する(図2、図3、図4)。以前の研究は、hMMTが生化学的刺激に対して同様の応答を提供し、より大きな形式の3D骨格筋モデル12、30で報告されたものと一致する成熟レベルに達することができることを示した。
MyoTACTICプレートの製造と...

骨格筋は、人体で最も豊富な組織の一つであり、移動、熱恒常性および代謝などの主要な身体機能をサポートしています1.歴史的に、動物モデルおよび2次元(2D)細胞培養システムは、生物学的プロセスおよび疾患の病態を研究し、骨格筋疾患2,3の治療における薬理学的化合物を試験するために用いられてきた。動物モデルは健康や病気における骨格筋に関する知識を大幅に改善しましたが、その翻訳的影響は高コスト、倫理的配慮、種間の違い2、4によって妨げられています。骨格筋を研究するためにヒト細胞系に目を向けると、2D細胞培養システムは単純性のために良好である。ただし、制限があります。この形式は、多くの場合、体内5,6内で自然に起こる細胞細胞および細胞外マトリックス相互作用を再現できない。ここ数年、3次元(3D)骨格筋モデルは、生理学的および病理学的に関連するプロセスex vivo7,8のモデリングを可能にすることにより、動物モデル全体および従来の2D培養系に代わる強力な代替手段として登場してきた。実際、多くの研究は、人工的な3D培養形式1でヒト骨格筋をモデル化する戦略を報告している。これらの研究の多くのための1つの制限は、活性力が培養プラットフォームからの筋肉組織の除去と力トランスデューサーへの付着に続いて定量化され、したがって、エンドポイントアッセイ9、10、11、12、13、14、15、16、17、18 、19,20,21.他の人は、活性力を測定する非侵襲的な方法を可能にする培養システムを設計しているが、すべてが高内容分子試験用途7、8、9、10、14、18、22、23、24、25、26、27、28に適しているわけではない 、29.
このプロトコルは、骨格筋(Myo)のマイクロ組織配列 deviCe forCe (MyoTACTIC) プラットフォームでヒト筋肉微小組織 (hMMT) を作製する詳細な方法を説明します。3D骨格筋マイクロティッシュ30のバルク生産をサポートする96井戸プレート装置。MyoTACTICプレートの製造方法により、96ウェルポリジメチルシロキサン(PDMS)培養プレートと、対応するすべてのウェル機能を単一の鋳造工程で生成することができ、それによって各ウェルは、微小組織形成のために比較的少数の細胞を必要とする。MyoTACTIC内に形成されたマイクロ組織は、デバイスのウェルからウェルまで再現可能な整列、線条、および多核筋管を含み、成熟時に、その場で化学的および電気的刺激に応答することができる30。本明細書において、ポリウレタン(PU)レプリカからPDMS MyoTACTIC培養プレート装置を製造する技術、hMMTを作製するヒト不死化ヒト前駆細胞を導入するための最適化された方法、及び、工学的hMMT力生成およびカルシウム処理特性の機能評価について概説及び議論する。

<table><tbody><tr><td>0.9% 生理食塩水、滅菌</td><td>ハウスブランド</td><td>1010</td><td>10 mL アリコートの溶液が作られ、4°Cで保存されます。C</td></tr><tr><td>25Gニードル</td><td>BD、Medstore、トロント大学</td><td>2548-CABD305127</td><td></td></tr><tr><td>6-アミノカプロン酸、&ge;99%(滴定)、Powder</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A2504-100G</td><td>A 50 mg / mL原液は、5 mgの6-アミノカプロン酸粉末を100 mLのオートクレーブ蒸留水に溶解することにより生成されます。溶液は真空ろ過され、10mLのアリコートは4°Cで保存されます。C</td></tr><tr><td>6.35 mm ID チューブ</td><td>VWR</td><td>60985-528</td><td></td></tr><tr><td>AB1167 筋芽細胞株</td><td>Institut de Myologie (パリ、フランス)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>任意波形発生器</td><td>Rigol</td><td>DG1022Z</td><td></td></tr><tr><td>Basement Membrane Extract (Geltrex)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A14132-02</td><td>50 & micro;Lまたは100&micro;L at -80&deg;C</td></tr><tr><td>ベンチトップ真空チャンバー</td><td>シグマ-Aldrich</td><td>D2672</td><td></td></tr><tr><td>BNC-アリゲータークリップケーブル</td><td></td><td></td><td>Amazon</td></tr><tr><td>Culture Plastics</td><td>Sarstedt</td><td></td>から注文 <td>培養プレート、血清学的ピペットなどが含まれています</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>シグマ-Aldrich</td><td>D8418-250ML</td><td></td></tr><tr><td>DPBS、粉末、カルシウム、マグネシウムなし</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td>21600069</tr><tr><td>ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム (DMEM) (1X)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>これは、L-グルタミンとピルビン酸ナトリウムを含む高グルコースDMEMです</td></tr><tr><td>胎児ウシ</td>血清 <td>フィッシャー</td>科学<td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>フィブリノーゲン ウシ</td><td>シグマ - アルドリッチ</td><td>F8630-5G</td><td>7 - 10 mg のフィブリノーゲン粉末のアリコートが作られ、-20°C で保管されています。C</td></tr><tr><td>Filtropur シリンジ フィルター、0.22um 細孔サイズ</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>馬血清</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>ヒト組換えインスリン</td><td>シグマ - Aldrich</td><td>91077C</td><td>ストック ソリューションは 100X で、1 mg のヒト組換えインスリンを 1 mL の DMEM と 1 & micro に溶解して作られます。NaOH 10NのL。溶液をろ過し、1mLアリコートとして4°Cで保存します。C</td></tr><tr><td>画像取得ソフトウェア</td><td>Olympus</td><td>cellSens Dimension</td><td></td></tr><tr><td>画像処理ソフトウェア</td><td>国立衛生研究所</td><td>ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Oven</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>201</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>Microscope - Camera Mount</td><td>Labcam</td><td>for iPhone Amazon</td><td>から注文</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック使い捨てシリンジ、1cc</td><td>BD</td><td>2606-309659</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック使い捨てシリンジ、50cc</td><td>BD</td><td>2612-309653</td><td></td></tr><tr><td>プルロニック F-127、粉末、バイオ試薬</td><td>シグマ - Aldrich</td><td>P2443-250G</td><td>プルロン酸の5%ストック溶液は、5gのプルロン酸粉末を100mLの冷却オートクレーブ滅菌蒸留水に溶解することによって作られます。溶液は真空ろ過され、10mLのアリコートは4°Cで保存されます。C</td></tr><tr><td>ポリジメチルシロキサン (Sylgard 184 シリコーンエラストマーキット)</td><td>ダウ</td><td>4019862</td><td>キットは、サーモフィッシャーサイエンティフィック、シグマ-アルドリッチなどでも販売されています。</td></tr><tr><td>ポリウレタンネガティブモールド</td><td>インハウス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リリースエージェント</td><td>マンリリース</td><td>テクノロジー200</td><td></td></tr><tr><td>ロータリーベーン真空ポンプ</td><td>エドワーズ</td><td>A65401906</td><td></td></tr><tr><td>メス</td><td>アルメディック、メドストア、トロント大学</td><td>2586-M36-0100</td><td></td></tr><tr><td>シングルエッジカミソリブレード</td><td></td><td>VWR55411-050</td><td></td></tr><tr><td>骨格筋細胞基礎中型</td><td>プロモセル</td><td>C-23260</td><td>30 mL分注が生成され、4°Cで保存されます。</td></tr><tr><td>骨格筋細胞増殖培地(Ready-to-use)</td><td>Promocell</td><td>C-23060</td><td>42 mLアリコートは、4°Cで生成および保存されます。</td></tr><tr><td>スマートフォン (iPhone)</td><td>アップル</td><td>SE</td><td></td></tr><tr><td>標準仕様 ドライ真空ポンプ</td><td>ウェルチ</td><td>2546B-01</td><td></td></tr><tr><td>除菌袋</td><td>アライアンス</td><td>211-SCM2</td><td></td></tr><tr><td>指ぬき</td><td>イゲゲ</td><td></td><td>アマゾンから取り寄せた</td></tr><tr><td>トロンビン ヒト血漿</td><td>シグマ - アルドリッチ</td><td>T6884-250UN</td><td>100単位のトロンビンを0.1%BSA溶液1mLに溶解します。10 &micro;Lアリコートは-20°Cで調製および保管されます。</td></tr><tr><td>錫被覆銅線</td><td>アルコ</td><td>B8871K48</td><td>アマゾンから注文</td></tr><tr><td>トリパンブルーソリューション、0.4%</td><td>サーモサイエンティフィ</td>ック<td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA、0.25%</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>真空チャンバー2</td><td>SP Bel-Art</td><td>F42027-0000</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト骨格筋微小組織における骨格筋の健康の機能指標の評価

Assessing Functional Metrics of Skeletal Muscle Health in Human Skeletal Muscle Microtissues

骨格筋の3次元(3D)インビトロモデルは、骨格筋の改革と機能を実験的操作に適したスケーラブルな形式で研究する機会を得て、生物医学研究における貴重な進歩です。3D筋肉培養システムは、科学者がヒト細胞の文脈で骨格筋ex vivoを研究することを可能にするので望ましい。3D in vitroモデルは、成人骨格筋のネイティブ組織構造の側面を密接に模倣する。しかし、彼らの普遍的なアプリケーションは、製造が簡単で、コストとユーザーフレンドリーで、比較的大量のヒト骨格筋組織を生み出すプラットフォームの可用性によって制限されています。さらに、骨格筋は、多くの疾患状態において時間の経過とともに損なわれる重要な機能的役割を担うため、微小組織研究のための実験的プラットフォームは、低侵襲性カルシウム過渡性および収縮力測定をプラットフォーム内で直接行うことができる場合に最も実用的である。このプロトコルでは、'MyoTACTIC'として知られている96ウェルプラットフォームの製造、および3Dヒト骨格筋微小組織(hMMT)の大量生産について説明する。また、経時的に各細組織の骨格筋力やカルシウムの取り扱いの繰り返し測定を可能にする電気刺激の低侵襲適用方法が報告されている。

本明細書で説明する方法は、PU型から96ウェルPDMSベースのミオタクティブ培養プラットフォームをキャストし、hMMT複製組織の配列を作製し、培養装置力生成およびカルシウム処理におけるhMMT関数の2つの側面を分析する方法である。図1は、hMMTシード処理前のMyoTACTIC培養井戸の調製の概略図を示す。PDMSは、広く使用されているシリコーン系ポリマーであり、複雑なデバイス32を作成するために容易に成形することができる。PDMS ベースのプロトコルは、製造された負の PU 金型30から 96 ウェルの培養装置の無制限の数をキャストするように設計されました。最終的な硬化PDMS陽性プレートは柔軟性があり、単一のエッジカミソリブレードの助けを借りて、より小さなサイズの機能的ユニットに簡単に切断することができます(図1)。これにより、ユーザーは、実験計画に固有のhMMTレプリカのニーズを満たすようにデバイスを拡張できます。これ...

本稿は、収縮力やカルシウム処理分析を含む機能の機能アッセイにおいて、3Dヒト骨格筋微小組織および低侵襲下流部のアレイを生成するための詳細なプロトコルを記述する。

Three-dimensional (3D) in vitro models of skeletal muscle are a valuable advancement in biomedical research as they afford the opportunity to study ...

我々のプロトコルは、3Dヒト骨格筋微小組織培養を製造し、分析するための詳細な方法を記述する。筋肉のマイクロ組織は、基本的な筋肉生物学、疾患モデリング、または候補分子検査の研究に適用することができます。この技術の主な利点は、収縮力とカルシウム過渡性のその場での評価を可能にすることです。このため, 筋肉組織機能の縦方向の研究を行うことができます。.この手順を実証するには、私の研究室の大学院生であるブレネン・マスグレイブとヘタ・ラッドです。細胞播種の2〜3時間前に、6つのマイルドな戦術板部分を10センチメートルの細胞培養皿に入れる。5%pluronic F-127溶液の100マイクロリットルを加えることによって、個々の筋戦術培養を十分に準備します。ふたを使って井戸を覆い、パラフィンフィルムを塗布して皿を密封します。プレートスピナーアダプターを装備した遠心分離機で1、550倍Gで料理を遠心分離します。細胞が播種の準備ができるまで、培養皿を摂氏4度で保管します。次いで、基膜抽出物の150マイクロリットルアリコートをゆっくりと解凍し、培養フード内の氷上のトロンビンの110マイクロリットルアリコートを解凍する。細胞培養フードで働き、7ミリグラムの粉末フィブリノーゲンを含む1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管に0.9%生理食塩水の700マイクロリットルを加えます。37°Cの細胞培養インキュベーターに、渦を出さずに3~5分間チューブを入れます。チューブを取り外して軽くフリックし、溶解した溶液をマイクロ遠心分離機でパルス回転させてから培養フードに戻します。0.22マイクロメートルのシリンジフィルターを装備した1ミリリットルのシリンジを使用してフィブリノーゲン溶液をフィルターします。次に、溶存したフィブリノーゲン溶液を基膜抽出物およびトロンビンアリコートと共に氷に移す。組織を播種した後に培養井戸に導入される37°Cで組織成長培地を準備し、予め温めます。培養器から細胞培養プレートを取り出し、培養培地を吸引する。次に、各培養プレートに5ミリリットルのDPBSを加えて細胞を1回洗浄します。DPBSを吸引し、各培養皿に0.25%トリプシンEDTAの1ミリリットルを加えることによって細胞を取り外す。プレートを細胞培養インキュベーターに3分間置き、培養皿に3ミリリットルの洗浄媒体を加えてトリプシンを保持し、細胞を適切なサイズの円錐形チューブに移す。ペレットは、Gを400回Gで10分間遠心して細胞をペレット化した。細胞ペレットを損傷することなく慎重に培地を吸引し、その後、洗浄媒体の1ミリリットルで細胞を再懸濁する。ヘモサイトメーターを使用して細胞を数え、明視野顕微鏡下で青色の色素を試してみてください。6つの組織を播種するには、8つの組織に十分な細胞と細胞外マトリックスを調製し、損失と気泡形成を

assessing-functional-metrics-skeletal-muscle-health-human-skeletal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

単離骨格筋のミオ - 機械的分析

このプロトコルは、 インビトロで筋細胞の収縮性を測定するための柔軟な培養表面としてマイクロスケールのシリコンカンチレバーの使用を記載している。細胞収縮を測定記録し、 インビトロで収縮機能を測定するための非侵襲的かつスケーラブルなシステムを提供し、力の読み取り値に変換することができるカンチレバー屈曲を引き起こす。...

携帯収縮機能を評価するために、マイクロスケールのシリコンカンチレバーの活用体外

このプロトコルは、成人および高齢者の骨格筋からの単離および筋芽細胞の前駆細胞の培養の、堅牢で再現性と簡単な方法について説明します。ここで使用される筋肉は足と脚の筋肉を含みます。このアプローチは、機能的研究のための一次筋芽細胞の濃縮集団の単離を可能にします。...

成人および高齢人間の骨格筋から筋原性前駆細胞/一次筋芽細胞の調製と文化

齧歯動物の骨格筋収縮機能の測定は、治療的介入の有効性と同様、病気の進行を追跡するために使用できる便利なツールです。私たちはここで同じマウスで時間をかけて繰り返すことができる内がえし筋の非侵襲的体内評価について説明します。...

マウスで内がえし筋機能の非侵襲的評価

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機械評価のためのヒト筋学の上室から骨格筋生検の収集

加齢、病気、傷害、およびリハビリテーションに対する機能的適応を理解するためには、膝伸筋の最大強度の定量化が不可欠である。生体内膝伸張等角値ピークテタニクトルクを繰り返し測定する新しい方法を紹介する。...

マウスにおける膝伸張筋機能のインビボ測定

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成人筋幹細胞機能評価のための単一筋繊維培養アッセイ Ex Vivo

このプロトコルは、3Dエンジニアリングされた心臓および骨格筋組織を生成するための方法を提供し、前臨床薬物スクリーニングモダリティにおけるそれらの使用について説明します。記載された方法は、磁気センシングシステムを利用して、24個の組織の同時評価を並行して容易にする。...

スケーラブルな3Dエンジニアリング筋肉組織における前臨床薬物検査

我々は、成体マウスの6つの筋肉から異なる長さとタイプの酵素的に解離した線維を得るためのプロトコルを記述する:そのうちの3つ(屈筋指筋ブレビス、長指伸筋、ヒラメ筋)と3つは初めて正常に解離した(長反母腓骨伸筋、長腓骨筋、指腓骨筋)。...

マウスの6つの後肢筋の酵素的解離によって得られた無傷の短、中、および長の骨格筋線維:指屈筋を超えて

ここでは、ヒトまたはマウスの筋肉から採取した新鮮な透過性骨格筋線維におけるミトコンドリアの酸化的リン酸化を測定するための包括的な方法について説明します。この方法により、ミトコンドリア呼吸のリアルタイム定量化と、既存のミトコンドリアネットワークと膜の完全性を維持しながら、燃料の好みと代謝の柔軟性の評価が可能になります。...

高解像度呼吸測定法によるヒトおよびマウス骨格筋線維のミトコンドリア呼吸の測定

このプロトコルでは、マイクロコンピュータ断層撮影法を使用して、小動物の骨格筋や内臓組織、脂肪組織、骨格組織などの除脂肪体重を費用対効果の高い定量化を可能にします。痩せた組織と脂肪組織を区別し、生物医学研究、特に小動物でのトランスレーショナル研究に大きな利点をもたらします。...

マイクロコンピュータ断層撮影法を用いた小動物における非侵襲的骨格筋定量化

学ぶ MyoTACTICプラットフォームを用いた3Dヒト骨格筋微小組織の作製と収縮力・カルシウム動態の評価法。筋肉生物学、疾患モデリング、創薬研究への応用が可能です。

ヒト骨格筋微小組織における骨格筋の健康の機能指標の評価

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