低分子の微小結晶電子回折
March 15th, 2021
ここでは、微結晶電子回折(MicroED)実験用の低分子結晶粉末を調製するために私たちの研究室で開発された手順について説明します。
この手順では、低分子粉末から3次元構造まで数分で進む方法を示します。これは、化学コミュニティにとって変革的な手法です。多くの化合物は容易に大きな結晶に成長しません。
MicroEDでは、ナノメートルサイズの結晶から原子分解能の構造を決定することができます。手順を実演するのは、UCLAの教授であるマイク・マルティノウィッツ博士です。はじめに、少量の粉末、液体、または固体を小さなバイアルまたはチューブに移します。
すでに粉末状のサンプルの場合は、サンプルが必要になるまでキャップを使用してチューブを密封します。同様に、液体サンプルを粉末に乾燥させます。スライドガラスカバーの一方の端にプラスチックフィルムを巻き付けます。
TEMグリッドをカバースライドの上のフィルムに置き、茶色のカーボン面を上に向けて配置します。次に、グリッド付きのスライドをグロー放電チャンバーに入れ、30ピコアンペアの負の設定を使用してカバースライドを約15秒間グロー放電します。サンプルをグリッドに追加する前に、ろ紙で裏打ちされたガラスペトリ皿内のカバースライドにグリッドを保管します。
ピンセットを使用して、覆われたペトリ皿からグロー放電TEMグリッドを取り外し、カーボン側を上に向けて円形のろ紙の上に置きます。小さなへらを使用して、非常に小さな粉末のスクープを取り除き、ろ紙のTEMグリッドのすぐ隣にある小さな正方形のガラスカバースリップに置きます。パウダーの上に別の小さな正方形のスライドガラススライドまたはカバースリップを置きます。
指で、2つのスライドガラスをそっとこすり合わせて微粉末を作りました。カバースリップを傾けてろ紙のTEMグリッドのすぐ上に配置し、グロー放電TEMグリッドのわずか数センチ上でカバースリップをこすり合わせ続けます。粉末がグリッドに向かって落下しているかどうかを確認します。
2つのガラスカバースリップの1つを取り外して、細かく粉砕された粉末のカバーを外します。次に、ろ紙を使用して、カバースリップからTEMグリッド上に微粉末をそっと払い落とします。ピンセットのセットを使用してTEMグリッドの端をつかみ、チップがグリッドの正方形に穴を開けないようにします。
グリッドをろ紙から1〜2センチ上に持ち上げ、グリッドを下の紙に対して90度の角度にします。グリッドをしっかりとピンセットしたままピンセットを軽くたたいて、緩い粉を取り除きます。ピンセットの先端をグリッドで液体窒素容器に直接手で動かしてグリッドを凍結し、グリッドとピンセットの沸騰が止まるまで待ちます。
液体窒素下で、カーボン支持フィルムの前にサンプルがビームに当たるように、カーボン側を向けたサンプルホルダーにグリッドを配置します。サンプルホルダーをTEMにロードし、グリッドが常に液体窒素温度に保たれるようにします。オートローダーシステムの場合、クリップされたグリッドを液体窒素冷却容器内のカセットに入れると、オートローダーロボットは、オートローダーとカラムの間を行き来するためにサンプルを安全に保ちながらカセットを受け入れることができます。
TEMカラムバルブを開き、ハンドパネルを使用して倍率を可能な限り低い倍率に調整します。ハンドパネルの強度ノブを調整して、蛍光スクリーンに丸い明るい領域が表示されるようにして、ビームを見つけます。高解像度のMicroEDデータを収集する前に、適切なソフトウェアを使用して低倍率ですべてのグリッドアトラスを取得し、顕微鏡が低倍率と高倍率の両方のイメージングに対して適切に位置合わせされていることを確認します。
カーボンが壊れておらず、フィルム上に黒または暗い粒子が見えるグリッドの正方形を特定します。ハンドパネルのジョイスティックを使用して物理的にグリッド内を移動するか、収集されたアトラスを仮想的にナビゲートして、壊れておらず、微小結晶を含むグリッドの正方形を検索します。これらの各正方形の中心を調査用のグリッド位置のリストに追加し、顕微鏡のユーザーインターフェイスまたは顕微鏡自動化ソフトウェアのノートブックに追加できます。
倍率を500〜1300倍に設定します。格納されている各グリッド位置の中心高さを調整し、保存した Z 値をメモした位置に更新します。蛍光灯またはフラットカメラで、グリッド上の小さな黒い斑点や粒子を検索します。
良いサンプルは、多くの場合、高倍率で鋭いエッジを持ち、順番に結晶を示唆しています。位置したポテンシャル結晶を画面の中央に移動し、TEMが高倍率モードに入るように倍率を上げます。選択した領域の開口部を挿入し、絞りを大きいサイズまたは小さいサイズに変更して、選択した領域が水晶振動子よりも大きくなるようにします。
蛍光スクリーンが挿入されていることを確認するTEMハンドパネルの屈折ボタンを押して、屈折モードに切り替えます。拡大ノブを使用してカメラの長さを調整し、エッジが少なくとも1オングストローム解像度になるようにします。中心スポットができるだけシャープで小さくなるように回折焦点を調整します。
回折シフトノブを使用して、中央ビームを蛍光スクリーンの中央に移動します。ビームストップを挿入して、ビームがその後ろにあることを確認します。蛍光スクリーンを持ち上げて、カメラで短時間露光します。
対応する回折パターンを調べて、パターンに列と行に規則的に配置された鋭いスポットがあることを確認します。結晶座標をTEMユーザーインターフェイスに保存するか、書き留めてから、現在のグリッド正方形上の関心のあるすべての潜在的な結晶に対して回折スクリーニングを繰り返します。遮蔽された水晶振動子を1000倍以上の倍率で中央に配置し、自動ルーチンまたは手作業を使用して水晶の中心高さを調整します。
結晶のサイズと形状に最適な選択した領域開口部を挿入します。ステージを負方向と正方向に傾けて、画像がグリッドバーで遮られるようにします。また、ローリングシャッター読み出しモードを備えた最新のカメラで1秒ごとにデータを読み取ることにより、データ収集の目的でこれらの角度に注意してください。
最大傾斜速度の割合と停止するタイミングを顕微鏡のユーザーインターフェースまたは専用ソフトウェアで指定して、回転速度を設定します。さまざまな形式でデータを保存すると、個々のフレームまたは画像のスタックとして記録されます。微小結晶から収集された結晶学的形式の屈折動画は、TEMグリッド上で同定されたカルバマゼピン微結晶からの連続回転MicroEDデータセットを示しています。
データ収集、統合、および構造ソリューションの後、高解像度の構造が決定され、その明確さはデータの品質と完全性に依存します。サンプルをグリッドに適用することは、良好なデータを取得するために重要です。この方法に従って、標準的な結晶学ソフトウェアを使用してデータをさらに処理することができます。
MicroEDが低分子の強力な方法であることを実証することで、非常に重要な分子の新しい構造を解決するために世界中で使用が開かれました。
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概要
この記事では、マイクロ結晶電子回折（MicroED）実験のための小分子粉体の準備手順について説明します。この技術により、ナノメートルサイズの結晶から原子分解能の構造を決定することができ、化学コミュニティにとって大きな進歩です。
主要な研究要素
科学の分野
- マイクロ結晶電子回折
- 構造生物学
- 小分子結晶学
背景
- 多くの化合物が大きな結晶に容易に成長しません。
- MicroEDは小さな結晶から構造を決定するための解決策を提供します。
- この方法は数分で結果を出すことができます。
- UCLAのMike Martynowycz博士が手順を実演します。
研究の目的
- 小分子結晶学の変革的な技術を紹介すること。
- 研究者が迅速に三次元構造を決定できるようにすること。
- 結晶化が難しい化合物の研究を促進すること。
使用された方法
- 小分子粉体の準備。
- 粉体の小さなバイアルまたはチューブへの移送。
- 構造決定のためのMicroEDの利用。
- 経験豊富な研究者による実演。
主な結果
- 原子分解能の構造の成功的な決定。
- 粉体から三次元構造への迅速な処理。
- MicroEDの多様な小分子への応用。
- 結晶化が難しい化合物の理解の向上。
結論
- MicroEDは構造生物学にとって価値ある技術です。
- この方法は化学研究に新たな道を開きます。
- 構造決定に必要な時間を大幅に短縮します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Microcrystal electron diffraction (MicroED) enables rapid, atomic-resolution structure determination of small molecules directly from nanocrystals, addressing a key bottleneck in pharmaceutical discovery. This capability enhances predictive confidence in early-stage compound characterization and accelerates the transition from chemical synthesis to structural validation. MicroED's compatibility with standard cryo-EM infrastructure positions it as a scalable, enterprise-ready solution for portfolio-wide structural elucidation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct atomic-level structure determination of drug candidates from minimal sample quantities.
- Reduces reliance on large crystal growth, de-risking early-stage compound progression.
- Supports rapid hypothesis testing for molecular identity and conformation.
- Facilitates functional target validation by confirming compound structure prior to downstream assays.
Screening & Assay Development
- Prepares validated microcrystal grids for high-throughput structural screening workflows.
- Delivers reproducible, quantitative diffraction data for compound assessment.
- Enables scalable screening of diverse chemical libraries using standardized protocols.
- Supports reliable evaluation of compound purity and polymorphism.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural data with translational biomarker development when structure-activity relationships are critical.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by providing definitive molecular structures.
- De-risks advancement decisions by confirming compound integrity before in vivo studies.
- Supports mechanistic studies requiring precise molecular geometry.
Pipeline & Workflow Integration
MicroED integrates into the discovery continuum from early compound synthesis through lead identification and preclinical validation, providing a structural checkpoint that informs go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by confirming molecular structure at the nanocrystal stage.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible microcrystal grids for downstream structural and functional analyses.
- Analytics: Generates quantitative diffraction patterns and high-resolution structural outputs for comparative assessment.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by ensuring structural fidelity of candidate molecules.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable protocol applicable across diverse compound classes and R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in compound characterization.
- Operational Value: Delivers rapid, standardized, and reproducible workflows compatible with existing cryo-EM infrastructure.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and enhances capital efficiency by minimizing delays in structural validation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of structurally confirmed candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-EM sample handling and TEM operation.
- Depends on access to glow discharge chambers, liquid nitrogen, and high-resolution TEM instrumentation.
- Demands cross-team standardization of grid preparation and data collection protocols.
- Adaptable to a wide range of small molecules, peptides, and pharmaceutical compounds.
- Sample quality and grid preparation are critical for obtaining high-quality diffraction data.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:34
Preparing Small Molecule Samples and TEM Grids
1:37
Applying Sample to Grids by Creating a Homogenous Fine Powder
2:51
Freezing and Loading Grids into the TEM
4:12
Locating and Screening Nanocrystals
7:33
Collecting MicroED Data
8:36
Results: Analysis of MicroED Dataset from Carbamazepine Microcrystal
9:10
Conclusion
