Name: 海水中脂質の測定 - JoVEジャーナル
Uploaded: 2021-12-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 59 s
Description: このプロトコルは、クロマトグラフィーと有機溶媒を用いて海水および生物標本から脂質の抽出と分析を詳細に記述しています。

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この研究は、カナダ自然科学工学研究評議会(NSERC)がC.Cパリッシュに105379助成金を提供しました。メモリアル大学のコア研究機器&インストゥルメントトレーニング(CREAIT)ネットワークは、この出版物に資金を提供しました。

注:脂質分析用のガラス製品、器具、フィルターを洗浄するには、メタノールで3回洗浄し、クロロホルムで3回洗浄するか、少なくとも8時間450°Cに加熱します。
1. 海水溶解・粒子状脂質の濾過手順
注: 関心のある特定の部分は、操作上、ろ過手順によって定義されます。この場合、細孔のサイズは1.2 μmです。
<ol><li>ろ過マニホールドをフィルターなしで設定し、ろ過された海水でセットアップをすすいします。</li>
	<li>クリーンな鉗子を使用して、洗浄された47mmガラス繊維(GF/C)フィルターをクリーン濾過システムに配置します。</li>
	<li>サンプルを取り、回収容器の底に落ち着いた可能性のある材料を再中断するためにそっと旋回します。既知のボリューム(この場合は1 L)を正確に測定し、これをフィルタでフィルタリングします。 注:体積はサンプル中の粒子状物質の量に依存します:通常、季節や場所に応じて250 mLと5 Lの間です。</li>
	<li>サンプルを測定したら、ろ過された海水でフィルターを静かに濡らします。サンプル全体をろ過システムにゆっくりと加え、水浸しの海水で段階的なシリンダーをすすいで、すべての粒子がフィルターに追加されるようにします。側面にろ過された海水でセットアップをすすいで、すべての粒子がフィルターの上にすすい込まれるようにします。<ol>
<li>すべての海水がフィルターを通過することを許可しますが、フィルターのセルを破壊する可能性がありますので、フィルターを完全に乾燥させないでください。水の最後が消えると吸引を破る。</li>
	</ol>
</li>
	<li>きれいな鉗子およびきれいなピペットを使用して、フィルターを半分に折り、次に3分の1で、そして半分の縦に縦にフィルターをチューブに転がす。10 mLガラスのバイアルとラベル付けされた清潔な場所に入れます。</li>
	<li>フィルターに2 mLのクロロホルムを覆います。ヘッドスペースに窒素を充填し、PTFEテープでシールします。ラックに入れるのは-20°Cの冷凍庫です。サンプルは、この温度で1年まで安定します。 注:脂質濃度を総質量濃度に関連付けるには、乾燥重量測定も必要です。これは、乾燥重量のろ過セットアップに24ミリメートルの事前計量フィルターを入れて、サンプルをかき混ぜ、小さなフィルターにろ過される小さなサブサンプルを取ることを含みます。フィルターがほぼ乾燥すると、約10mLの3.5%アンモニウム・フォーマットがフィルターに加えます。フィルターは半分に折り畳まれ、ラベル付きのペトリ皿に戻され、冷凍庫に入れられます。</li>
</ol>2. 海水または液体サンプルの液体-液体抽出
<ol><li>
サンプルの準備
	<ol>
<li>脂質クリーンガラスの段階的なシリンダーに濾過の既知の体積を測定します。このサンプルをクリーンな 1 L セパネルに入れ、その後、サンプルにクロロホルムの20 mLを加え、2分間振り、頻繁に通気します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
最初の抽出物の除去と、最初の分離後の酸の添加
	<ol>
<li>アルミホイルで漏斗を包み、分離が起こるまで5〜10分待ちます。ホイルの底を剥がして2つの層を見ます。底部の有機層をストップコックを通してきれいな丸底フラスコに集め、最上層を含めないように注意してください。丸底のフラスコを窒素の下にかぶせ、冷凍庫に入れる。</li>
		<li>サンプルの1リットルごとに0.25mLの濃縮H2SO4 を加え、セパレート漏斗のサンプルに加え、漏斗を穏やかに振ります。</li>
		<li>クロロホルムを10mL加え、頻繁に通出しながら2分間激しく振ります。分離を行います。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
第2および第3の分離
	<ol>
<li>分離を待ち、底の層を丸底フラスコに加えます。</li>
		<li>クロロホルムの3番目の10 mLを加え、2分間振り、再び頻繁に通気します。分離後、底面の丸いフラスコに底の層を加えます。</li>
		<li>丸底フラスコの抽出物をロータリーエバポレーターに移し、蒸発させて2mLバイアルに移します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 固体抽出プロトコル(修正されたFolchら3 抽出)
<ol><li>
セットアップ 注: 抽出のセットアップには、氷で満たされた絶縁された容器が必要です。溶媒としては、メタノール、クロロホルム抽出水、2:1クロロホルム:メタノールが含まれる。抽出が開始されるまでに冷たくなるように、すべての溶媒を氷の上に置く必要があります。サンプルも氷の上に行くので、すべてが冷たいままです。<ol>
<li>すべてのチューブとPTFEの裏地キャップをメタノールで3回、クロロホルムで3回リンスします。1つの抽出には、1つの遠心管とキャップ付きの15 mLバイアルが必要です。</li>
		<li>2 mLのクロロホルムを含む遠心管にサンプルを入れる。試料の大きさは、存在する脂質の量に依存し、脂質の約5〜10mgが好ましい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
研削および抽出
	<ol>
<li>約1mLの氷冷メタノールを加え、きれいなホモジナイザーまたはPTFE/金属エンドロッドでサンプルを素早くパルプに粉砕します。</li>
		<li>約1mLの氷冷2:1クロロホルムでロッドをチューブに洗い戻し、メタノールを使用し、氷冷クロロホルム抽出水1/2mLで洗浄します。必要に応じて、洗浄する前に、きれいな鉗子を使用して、粒子をバイアルに強制的に戻します。チューブをキャップし、超音波浴(35 - 42 kHz)で4分間混合物を超音波処理します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
二重ピペット:1800× gで2分間サンプルを遠心分離します。電球を緩く押し込んだ5 3/4インチピペットが2層を軽く押し抜き、球根を圧迫し、泡が出る二重ピペット技術を使用して、有機層全体(底層)を収集します。<ol>
<li>2 番目のレイヤーの底に達したら、親指を使用して、有機層をピペットに描画せずに電球を取り除きます。5 3/4インチの内側に9"ピペットを置き、5 3/4"ピペットを通して底層を取り除きます。</li>
		<li>きれいなバイアルに抽出物を置きます。一番下のレイヤーがすべて削除されるまで引き続き取り外します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
洗浄ピペット:9インチピペットを、1.5mLの氷冷クロロホルムを使用してピペットの外側を洗い流し、1.5mLで内部を洗い流す有機層を含むバイアルにリンスします。洗濯中にそのピペットをそっと回し、すべてのクロロホルムがピペットをバイアルに流すことを確認します。<ol>
<li>5 3/4インチピペットを水性層を含むチューブに同じようにリンスします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ソニックエートと遠心分離すると、毎回新しいピペットを使用して、分離時にサンプルと二重ピペット。少なくとも 3 回繰り返し、すべての有機層をプールします。有機層を3回目に除去した後、両方のピペットを有機層を含むバイアルに洗浄する。</li>
	<li>窒素の穏やかな流れを使用して、ボリュームに集中し、PTFEテープで密封し、冷凍庫に保管します。</li>
</ol>4. 海洋脂質クラスのロッドTLC分離のためのシステムとステップの開発
<ol><li>
TLC用ロッドの準備
	<ol>
<li>自動FIDスキャナのロッドを3回スキャンするブランク</li>
		<li>
サンプルを見つける: サンプルと標準を注射器で、原点のすぐ下のロッドに適用します。0.5 μL を分配し、ロッドにドロップをタッチします。次のドロップを同じ場所に置く前に乾燥させます。ロッド上のラインですべてのサンプルを見つけます。</li>
		<li>
アセトンに焦点を合わせる: 70 mLのアセトンで2回(サンプルが非常に濃縮されている場合は3回)焦点を合わせる。スポットの底が上部に合流するまでロッドを登る際に、溶媒の前線を見てください。ロッドを取り外し、5 s前後で乾燥させてから、ロッドの底部近くに狭い脂質材料のバンドを作り出す手順を繰り返します。</li>
		<li>乾燥し、5分間一定の湿度チャンバーでロッドを調整します。一定の湿度チャンバは、プレートの下に塩化カルシウムの飽和溶液を有するデシケータである。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
第1クロマトグラムに導く配列(ケトンに炭化水素)
	<ol>
<li>
最初の開発システム: 最初の開発システムはヘキサン:ジエチルエーテル:ギ酸、98.95:1:0.05です。シリンジを使用してギ酸を加えますが、最初にギリンジ3×をギ酸ですすいます。その直後にクロロホルムでシリンジからギ酸をリンスします。30 mLの混合物を使用して紙を濡らし、タンクをすすきます。すすべ液を捨て、残りの70mLをタンクに加えます。<ol>
<li>ラックを取り、タンクにそっと下げます。溶媒の前部がサンプルのスポットに達するまで見て、タイマーを開始します。25分後、現像チャンバーからロッドを取り出し、一定湿度チャンバーで5分間乾燥し、同じ溶液で20分間再開発します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>自動FIDスキャナでロッドを5分間乾燥させ、PPSスキャン25を使用してケトンピークの後ろの最低点までスキャンします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
第2のクロマトグラムにつながる配列(チアシルグリセロールからジアシルグリセロールへ):
	<ol>
<li>一定湿度チャンバで5分間ロッドを調整します。</li>
		<li>
第二の開発システム: 第二の開発システムはヘキサン:ジエチルエーテル:ギ酸、79:20:1です。開発タンクに約30mLを加えて、紙を濡らし、タンクをすすきます。その後、残りの70 mLで40分間ロッドを廃棄し、開発します。TAG(飽和)とTAG(多価不飽和)の間の最良の分離のために、79.9:20:0.1の混合物を使用しますが、STとDAGのピークの分離には79:20:1の混合物を使用します。</li>
		<li>乾燥し、PPSスキャン11を用いて第2の部分スキャンでジアシルグリセロールピークの後ろの最低点までスキャンする。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
第3クロマトグラム(アセトン移動性極性脂質およびリン脂質)に至る配列
	<ol>
<li>一定の湿度チャンバで5分間ロッドを調整します。</li>
		<li>アセトンの70 mLで15分間ロッドを2回現像します。開発の間に約30秒間ロッドを乾燥させます。</li>
		<li>一定の湿度チャンバで5分間ロッドを調整します。</li>
		<li>
第3の開発システム:第3の開発システムは、クロロホルム、メタノール、クロロホルム抽出水の混合物である50:40:10。混合物の70 mLで10分間ロッドを2回開発します。開発の間に、空気は約30秒間ロッドを乾燥させます。</li>
		<li>ロッドの全長を乾燥してスキャンします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. MeOH で H2SO4 を使用した FAME 誘導体化
<ol><li>
ヒルディッチ試薬を作る
	<ol>
<li>
メタノールの準備:清い容積フラスコにMeOHの100 mLを置き、フラスコの底部が覆われるまで無水NaSO4 にそっと振りかけます。一度覆われた後、メタノール中の水がNaSO4によって吸収されるように2回反転する。反転して振った後、少なくとも5分間座らせます。</li>
		<li>
酸の添加: ゆっくりとガラス瓶にメタノールをデカントし(現在ではNaSO4はフラスコの底に硬い塊)、H2SO4が追加されます。ピペットを使用してメタノールに1.5mLの硫酸をゆっくりと加えます。一度に数滴を加え、すべての酸を加えたらキャップし、軽くかき混ぜて混ぜます。このソリューションはデリバティブに使用する準備が整いましたが、週単位で作成する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
デリバティブの作成
	<ol>
<li>約200μgの脂質を、体積が既知の量まで持ち上げた抽出バイアルから、清潔な15mLバイアルに移し、窒素下で蒸発して乾燥します。除去される量は、TLC/FIDからのサンプルの濃度によって決定されます。きれいなピペットを使用してサンプルを取り外します。</li>
		<li>試料が乾燥したら、1.5mLのジクロロメタンと3mLの新作のヒルディッチ試薬を加えます。</li>
		<li>試料を渦液にし、4分間超音波浴で超音波処理し、ガラスバイアルに付着した脂質を除去します。バイアルに窒素、キャップを入れ、PTFEテープで密封し、100°Cで1時間加熱します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
反応を停止する
	<ol>
<li>オーブンから取り出した後、サンプルを室温まで10分間完全に冷却し、バイアルを慎重に開けます。</li>
		<li>約0.5mLの飽和炭酸水素ナトリウム溶液(9 g/100 mLクロロホルム抽出水)をゆっくりと加え、1.5 mLヘキサンを加えます。バイアルを振るか渦を振り、2つの層に分けることができるように立たせます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
名声の収集
	<ol>
<li>
最上層の除去:誘導体化が停止し、明確な分離が発生したら、上部、有機相を除去し、脂質クリーン2mLバイアルに入れます。</li>
		<li>2 mL バイアルの溶媒を蒸発させて乾燥させ、ヘキサンを約 0.5 mL にリフィルします。</li>
		<li>バイアルのヘッドスペースに窒素を充填し、PTFEテープでバイアルをキャップしてシールし、さらに4分間超音波処理して脂肪酸を再中断し、GCに行く準備が整います。 注:脂肪酸濃度が必要な場合、水層はヘキサンで3回洗浄し、すべての有機層を2mLバイアルにプールする必要があります。これは、2 mLのヘキサンを添加し、試料をボルテックスし、遠心分離し、有機層を除去し、すべて3回繰り返す。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Couturier, L. I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State+of+art+and+best+practices+for+fatty+acid+analysis+in+aquatic+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22ICES+Journal+of+Marine+Science%22%5BJournal%5D)">State of art and best practices for fatty acid analysis in aquatic sciences.</a> ICES Journal of Marine Science. , (2020).</li>
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<li>Folch, J., Lees, M., Stanley, G. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).</li>
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<li>Wolf, C., Quinn, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidomics%3A+practical+aspects+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Lipidomics: practical aspects and applications.</a> Progress in Lipid Research. 47, 15-36 (2008).</li>
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<li>Pernet, F., Tremblay, R., Comeau, L., Guderley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+adaptation+in+two+bivalve+species+from+different+thermal+habitats%3A+energetics+and+remodelling+of+membrane+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Temperature adaptation in two bivalve species from different thermal habitats: energetics and remodelling of membrane lipids.</a> Journal of Experimental Biology. 210, 2999-3014 (2007).</li>
<li>Bergen, B. J., Quinn, J. G., Parrish, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality-assurance+study+of+marine+lipid-class+determination+using+Chromarod%2FIatroscan+thin-layer+chromatography-flame+ionization+detector%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quality-assurance study of marine lipid-class determination using Chromarod/Iatroscan thin-layer chromatography-flame ionization detector.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 19, 2189-2197 (2000).</li>
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<li>Sinanoglou, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+combined+application+of+Iatroscan+TLC-FID+and+GC-FID+to+identify+total%2C+neutral%2C+and+polar+lipids+and+their+fatty+acids+extracted+from+foods%5BTitle%5D)+AND+%22ISRN+Chromatography%22%5BJournal%5D)">On the combined application of Iatroscan TLC-FID and GC-FID to identify total, neutral, and polar lipids and their fatty acids extracted from foods.</a> ISRN Chromatography. , 59024(2013).</li>
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</ol>

著者は競合する財政的利益を持っていません。

TLC-FIDシステムが小さいサンプルからのシノプティック脂質クラス情報を提供する速度は、TLC-FIDを海洋サンプルをスクリーニングするためのより複雑な分析手順を行う前に可能なツールにする。このような分析は、通常、ガスクロマトグラフィーの場合の揮発性を高めるために脂質抽出物および誘導体化からの成分化合物の放出を必要とする。GC-FIDと組み合わせたTLC-FIDは、魚介類および他の食品の抽出物のための強力な組み合わせであることが判明した14.海洋脂質分析を成功させるためには、サンプルが全体の劣化や汚染から保護され、ロッドへのサンプルの適用に細心の注意が払われていることが重要です。1つのアプローチは、マイクロキャピラリーピペット15を用いて海洋試料全体をロッドに適用するものであり、海洋試料タイプの革新は、海水サンプル16に海面マイクロ層およびエアロゾルサンプルを添加する。
自動スキャナのFIDシステムは、誘導体化やクリーンアップなしで迅速な...

ここで説明する方法は、海洋脂質として運用上定義される物質に関するものです。この定義は、非極性有機溶媒中の液体-液体抽出に対する無邪気さに基づいており、水生マトリックス内の他の物質から分離するための便利な方法を提供します。その疎水性は海水や生物学的標本からの隔離、濃縮、塩やタンパク質の除去を促進します。
海洋生物における脂質含有量の測定と構成は、食品ウェブ生態学、養殖栄養学、食品科学に何十年も関心を集めてきました。脂質は、生体内の普遍的な構成要素であり、細胞膜に不可欠な分子として作用し、生体利用エネルギーの主要な供給源として、断熱性および浮力を提供し、シグナル伝達分子として機能する。他の分野における脂質決定の手順はよく説明されているが、海洋サンプルでのそれらの使用は、一般に、試料タイプ1だけでなく、フィールド条件に適応するための修飾を必要とする。
海水サンプルの場合、最初のステップは通常、通常、濾過によって、操作的に定義された「溶解」および「微粒子」分数に分離する必要があります(プロトコルステップ1)。粒子状分率は、フィルターによって保持されるものであり、そして、細孔のサイズは、カットオフ2を定義する上で重要である。多くの場合、粒子状物質をサンプリングする際には、脂質濃度を総質量濃度に関連付けたいが、その場合は別の小さなサンプル(例えば、10mL)をこの目的のために採取しなければならない(プロトコルステップ1、注)。正確な質量決定を得るためには、濾過の終わりにアンモニウムのギマ質(35 g/L)を加えることを重要である。
大きいサンプルからの海水の濾液は、サンプルの種類に応じて250mLと1Lの間に量り、セパレート漏斗で液体液体抽出を行う必要があります(プロトコルステップ2)。脂質の疎水性の性質は、クロロホルムなどの非極性溶媒で抽出することによって他の化合物から分離できることを意味する。2層システムは、水溶性成分が水層に留まる間、脂質が有機層に分け込む場所に作成されます。
フィルター上の粒子状サンプル、または生物学的標本は、クロロホルムを含む改変Folchら抽出3で抽出される(プロトコルステップ3)。再び、脂質が有機相に分かれ、水溶性分子が水相に残り、タンパク質が沈殿する有機/水系が作られます。実際、固体の場合、ほとんどの実験室は、クロロホルムおよびメタノールを含むFolchら抽出3 手順のいくつかのバリエーションを使用する。フィルターの場合、最初のステップは、2 mLのクロロホルムと1 mLのメタノールで均質化することです。
抽出中は、エステル結合加水分解や炭素炭素二重結合酸化を減らすために氷上にサンプルや溶媒を保持することによって、化学的または酵素的修飾から脂質を保護するために注意する必要があります。組織および細胞脂質は、天然の抗酸化物質によって、そして区画化4によってかなりよく保護されている。しかし、サンプルの均質化に続いて、細胞内容物は、化学的または酵素的に、より変化するために配置された脂質をレンダリングして結合される。ほとんどのステロールのようないくつかの脂質は非常に安定であり、多価不飽和脂肪酸を含むものは化学的酸化の影響を受けやすいものもある。他の他の,二重結合を伴うステロールのような,光5によって触媒される酸化を起こしやすい。抽出後、脂質は化学酸化の影響を受けやすく、サンプルは窒素などの不活性ガスの下に保管する必要があります。窒素の穏やかな流れはまた、抽出物を濃縮するために使用されます。
濃度の後、脂質は通常、炭水化物やタンパク質のkJ/gの2倍以上の高濃度エネルギーを提供する海洋生態系の重要な構成要素であるため、一括で定量化されます。脂質の包括的な分析は、一般的に、その化学的性質に応じて、より単純なカテゴリに分離することを含む:彼らは常に個々の成分として定量化されます。したがって、完全な分析は、総脂質、脂質クラスおよび個々の化合物を測定することを含む。
全脂質は、クロマトグラフィー6で分離された個別に測定された脂質クラスの合計を取ることによって決定することができる。海洋脂質抽出物は、生物起源および人為的な情報源から12以上のクラスを含んでいてもよい。脂質構造の多種多様は、構造の個々のグループを決定することによって多くの情報を得ることができることを意味します。脂質クラスは、個々に、または特定のグループにおいて、特定の種類の生物の存在を知らせるために使用されてきただけでなく、それらの生理学的状態および活性2。また、溶存有機物(DOM)や疎水性汚染物質を含む有機材料の起源の指標としても使用されています。
トリアシルグリセロール、リン脂質およびステロールは、より重要なバイオジェニック脂質クラスの一つです。最初の2つは、2~3種類の脂肪酸がエステル化されるグリセロール骨格を有するので生化学的に関連している(図1)。トリアシルグリセロールは、ワックスエステルとともに非常に重要な貯蔵物質であり、ジアシルグリセロール、遊離脂肪酸、モノアシルグリセロールなどの他の脂肪酸含有脂質クラスは、一般的にマイナーな成分である。遊離脂肪酸は生物の低濃度で存在し、不飽和脂肪酸は毒性7であり得る。ステロール(自由およびエステル化された形態の両方)および脂肪アルコールは、より少ない極性脂質の中に含まれ、糖脂質およびリン脂質は極性脂質である。極性脂質は、細胞膜に見られる脂質二重層の形成を可能にする親水性基を有する。遊離ステロールは膜構造成分も、トリアシルグリセロールに対する比率で取られた場合、それらは、広く使用されている条件または栄養指数(TAG:ST)8を提供する。リン脂質に対する比率(ST:PL)を摂取すると、塩に対する植物感受性を示すために使用され得る:より高い値は構造的完全性を維持し、膜透過性を低下させる9。この比の逆(PL:ST)は、温度適合10の間に二枚貝組織で研究されている。
海洋脂質クラスは、シリカゲルコーティングロッド上の薄層クロマトグラフィー(TLC)で分離することができ(プロトコルステップ4)、自動FIDスキャナで炎イオン検出(FID)によって検出および定量化されます。TLC/FIDは、小さなサンプルからシノプティック脂質クラスデータを迅速に提供し、全クラスの合計を取ることによって、総脂質の値を取得する海洋サンプルに日常的に使用されるようになってきた。TLC/FIDは品質保証(QA)評価を受けており、一貫した外部キャリブレーション、低ブランク、および正確な複製分析11に必要な基準を満たすことが判明した。変動係数(CV)または相対標準偏差は約10%であり、FIDスキャナ総脂質データは、通常、重量測定および他の方法2で得られたデータの約90%である。重量測定は、FIDスキャナが非揮発性化合物のみを測定し、また重量測定に非脂質物質を含む可能性のある結果として、より高い総脂質を与える可能性が高い。
脂質クラス分析によって提供される情報は、脂肪酸を個体として、ステロール、または2つを組み合わせて組み合わせた場合に特に有用である。これらの分析に向けた最初のステップは、脂質抽出物中のステロールと一緒にすべての成分脂肪酸の放出を含む(プロトコルステップ5)。脂質の構造と機能の多種多様は、生態系の健康とそれらが人類起源および地上の入力によってどの程度影響を受けているかを評価する生態学的および生物地球化学的研究で広く使用されていることを意味します。これらは、海洋動物相に対する食事価値の物質の生合成を測定し、水のサンプルの品質を示すために使用されています。堆積物コアサンプルの脂質を測定することは、陸海の近くの人間の土地利用の変化に対する堆積物の感受性を示すのに役立ちます。
個々の脂質化合物を同定・定量するための主要なツールは、従来、FIDを有するガスクロマトグラフィー(GC)であった。しかし、分析の前に、これらの化合物は誘導体化によってより揮発性に作られる。脂肪酸は、アシル脂質クラスから酸性触媒(H2SO4)の存在下で放出される(図1)。有機化学では、アシル基(R-C=O)は、通常カルボン酸(R-COOH)に由来する。その後、GCカラム上でより良い分離を与える脂肪酸メチルエステル(FAME)に再エステル化されます(プロトコルステップ5)。

<table><tbody><tr><td>15 ml バイアル</td><td>VWR</td><td>66009-560</td><td></td></tr><tr><td>1-ヘキサデカノール</td><td>Sigma</td><td>258741-1G</td><td></td></tr><tr><td>1-モノパルミトイル-rac-グリセロール</td><td>Sigma</td><td>M1640-1g</td><td></td></tr><tr><td>2 ml バイアル</td><td>VWR</td><td>46610-722</td><td></td></tr><tr><td>25 mm ガラス繊維フィルター</td><td>Fisher</td><td>09 874 32A</td><td></td></tr><tr><td>2ml ピペット電球</td><td>VWR</td><td>82024-554</td><td></td></tr><tr><td>47 mmガラス繊維フィルター</td><td>フィ</td><td>ッシャー09 874 32</td><td></td></tr><tr><td>5 3/4 "ピペット</td><td>フィ</td><td>ッシャー1367820A</td><td></td></tr><tr><td>9 "ピペット</td><td>フィ</td><td>ッシャー1367820C</td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>VWR</td><td>CAAX0116-1</td><td></td></tr>ア<tr><td>ジレントGC-FID 6890</td>ア<td>ジレント</td><td></td><td></td></tr>塩化<tr><td>カルシウムANHS 500gm</td><td>VWR</td><td>CACX0160-1</td><td></td></tr><tr><td>2 mlバイアル用キャップ</td><td>VWR</td><td>46610-712</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>VWR</td><td>CACX1054-1</td><td></td></tr><tr><td>パルミチン酸コレステリル</td><td>Sigma</td><td>C6072-1G</td><td></td></tr><tr><td>Chromarod S5</td><td>Shell USA</td><td>3252</td><td></td></tr><tr><td>ジクロロメタン</td><td>VWR</td><td>CADX0831-1</td><td></td></tr><tr><td>DL-a-ホスファチジルコリン、ジパルモトイル</td><td>Σ</td><td>P5911-1g</td><td></td></tr><tr><td>エチルエーテル、ACSグレードの無水物4L</td><td>VWR</td><td>CAEX0190-4</td><td></td></tr><tr><td>グリセリルトリパルミテート</td><td>シグマ</td><td>T5888-100MG</td><td></td></tr><tr><td>ハミルトンシリンジ702SNR 25&micro;l</td><td>シグマ</td><td>58381</td><td></td></tr><tr><td>ヘリウム</td><td>エア リキード</td><td>A0492781</td><td></td></tr><tr><td>ヘキサン</td><td>VWR</td><td>CAHX0296-1</td><td></td></tr><tr><td>水素レギュレータ</td>ー <td>VWR</td><td>55850-484</td><td></td></tr><tr><td>イアトロスキャン MK6</td><td>シェル USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>フィッシャー</td><td>066662</td><td></td></tr><tr><td>メディカル エア</td><td>エア リキード</td><td>A0464563</td><td></td></tr><tr><td>ミディアムニトリル手袋</td><td>フィ</td><td>ッシャー191301597C</td><td></td></tr><tr><td>ニトリル手袋L</td><td>VWR</td><td>CA82013-782</td><td></td></tr>窒素<tr><td></td><td>エアリキード</td><td>A0464775</td><td></td></tr><tr><td>窒素調整器</td><td></td>VWR55850-474<td></td><td></td></tr>ノ<tr><td>ナデカン</td><td>シグマ</td><td>74158-1G</td><td></td></tr><tr><td>パルミチン酸</td><td>シグマ</td><td>P0500-10G</td><td></td></tr><tr><td>リピーティングディスペンサー</td><td>シグマ</td><td>20943</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム 1kg</td><td>VWR</td><td>CA97062-460</td><td></td></tr><tr><td>硫酸ナトリウム アンヒ ACS 500gr</td><td>VWR</td><td>CA71008-804</td><td></td></tr><tr><td>硫酸</td><td>VWR</td><td>CASX1244-5</td><td></td></tr><tr><td>テフロンテープ</td><td>フィッシャー</td><td>14610120</td><td></td></tr><tr><td>ティッシュマスター 125 115V w/7mm ホモジネーター</td><td>オムニインターナショナル</td><td>TM125-115</td><td></td></tr><tr><td>TLC開発タンク</td><td>シェルUSA3201UHP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水素</td><td>エアリキード</td><td>A0492788</td><td></td></tr><tr><td>VWR溶剤レピペット</td><td></td><td>VWR82017-766VWR</td><td></td></tr><tr><td>タイマー点滅LED2チャンネル</td><td>VWR89140-196</td><td></td><td></td></tr>ゼ<tr><td>ブロンZB-ワックスGCカラム</td><td>フェノメネックス</td><td>7HM-G013-11</td><td></td></tr></tbody></table>

海洋試料における総脂質および脂質クラスの決定

Determination of Total Lipid and Lipid Classes in Marine Samples

脂質は主に炭素と水素で構成されており、海の他の有機高分子よりも大きな特定のエネルギーを提供します。炭素と水素が豊富であることも疎水性であり、有機汚染物質の溶媒および吸収キャリアとして機能し、海洋生態系における汚染物質の生物蓄積の原動力となり得る。その疎水性は海水または生物学的標本からの隔離を促進する:海洋脂質分析は、非極性有機溶媒のサンプリングと抽出から始まり、水生マトリックス内の他の物質から分離するための便利な方法を提供する。
海水がサンプリングされた場合、最初のステップは通常、濾過によって操作的に定義された「溶解」および「粒子状」の派閥への分離を含む。サンプルを収集し、サンプルマトリックスから分離された脂質は、通常、真に溶解した物質とコロイドのためのクロロホルムで、固体および生物学的標本のためのクロロホルムとメタノールの混合物で分離される。このような抽出物は、バイオジェニックおよび人為的な情報源からのいくつかのクラスを含んでいてもよい。このとき、総脂質及び脂質クラスが決定され得る。全脂質は、慣習的にクロマトグラメン的に分離された個別に決定された脂質クラスを合計することによって測定することができる。薄層クロマトグラフィー (TLC) と火イオン化検出 (FID) は、海洋試料からの脂質の定量分析に定期的に使用されています。TLC-FIDは、シノプティック脂質クラス情報を提供し、合計クラスにより、総脂質測定を行います。
脂質クラス情報は、脂質抽出物からの放出後に、個々の成分、例えば脂肪酸および/またはステロールの測定値と組み合わせる場合に特に有用である。脂質の構造と機能の多種多様は、生態系の健康と人類起源の影響による影響度を評価する生態学的および生物地球化学的研究で広く使用されていることを意味します。これらは、海洋動物相(例えば、水飼料および/または獲物)に対する食事価値の物質を測定し、水質(例えば炭化水素)の指標として使用されてきた。

最も急成長している食品生産部門として、養殖は技術革新と適応の面で進化し、変化する要件を満たしています。その一つは、多くの養殖種に飼料成分を提供する野生産魚粉や魚油への依存を減らすことです。陸上植物油は、水飼料中の魚油の持続可能で経済的な代替品として調査されており、肝臓は脂質代謝の主要部位であるため分析の標的組織である。 図2 は、私たちの9成分標準から得られた生のTLC-FIDクロマトグラム、魚油を7%、菜種油を5%で配合した食事、そして大西洋サケから肝臓組織がその食事を与えた。 表1 は、異なる魚類からの食事複製およびサンプルを分析した後に得られたデータを示す。これらのデータは、ピークシンプルソフトウェア(バージョン4.54)を使用して抽出物中の脂質クラスを定量化するためにスキャナFID応答から標準曲線を構築した後に得られた。データは、食事と肝臓におけるトリアシルグリセロールの有病率と肝臓における膜リン脂質の重要性を示しています。
大陸のマ...

このプロトコルは、海水および生物学的標本中の脂質の決定のためのものです。濾液中の脂質は、固形物の場合にはクロロホルムまたはクロロホルムとメタノールの混合物で抽出される。脂質クラスは、炎イオン化検出を用いたロッド薄層クロマトグラフィーで測定され、その合計が総脂質含有量を示します。

Lipids are largely composed of carbon and hydrogen and, therefore, provide a greater specific energy than other organic macromolecules in the sea. Being ...

ここで説明する方法は、海洋脂質として操作的に定義することができる化合物に関する。この定義の基礎は、非極性有機溶媒中の液体-液体抽出に対する無邪気さであり、水性マトリックス内の他の化合物からそれらを分離する便利な手段を提供する。その疎水性は海水または生物学的標本からの隔離、塩およびタンパク質の濃縮および除去を促進する。海水サンプルの場合、最初のステップは通常、通常ろ過によって、操作的に定義された溶解および粒子状の分画に分離することを含む。粒子状の分率はフィルターによって保持されるものであり、そして、細孔サイズはカットオフを定義する上で重要である。脂質クリーンな鉗子を使用して、脂質クリーン濾過システム上に流された47ミリメートルガラス繊維フィルターを配置します。サンプルを取り、穏やかにそれを渦巻き、落ち着いた可能性のある粒子を再懸濁させます。既知のボリュームを測定します。体積はサンプル中の粒子状物質の量によって異なります。体積を測定したら、濾過システムに吸引を加え、ろ過された海水でフィルターを穏やかに濡らします。サンプル全体を濾過漏斗にゆっくりと加え、水で流し込み、すべての粒子がフィルターに追加されるようにします。装置の漏斗をすすいで、すべての粒子がフィルターにすすがっていることを確認します。フィルターを通してすべての液体を引っ張りますが、フィルター上にある細胞を破裂させる可能性がありますので、フィルターを乾燥させないでください。脂質クリーンな鉗子を取り、フィルターを半分に折り、もう一度3分の1に折りたたみ、そして半分の縦に半分に折ります。フィルターは、次に脂質クリーンバイアルに配置されます。フィルターに2mlのクロロホルムを覆い、窒素の下にキャップし、テフロンテープで密封します。この時点で、サンプルは最長1年間マイナス20°Cで安定しています。サンプルの準備をします。脂質クリーンガラスの段階的なシリンダーに濾液の既知の体積を測定します。サンプルを脂質クリーンセパネルに入れ、約20mlのクロロホルムを加えます。この混合物を頻繁に通気する少なくとも2分間振る。最初の分離後、第1抽出物の除去および酸の添加。溶液を2分間振った後、漏斗をアルミホイルで包み、分離が起こるまで約5分間待ちます。分離を待った後、アルミ箔の底を剥がして2つの層を見ます。最下層を脂質クリーンな丸底フラスコに集め、最上層のいずれにも含めないように注意してください。丸底フラスコを窒素の下にキャップし、冷凍庫に入れる。セパレーター漏斗を回収し、液体に硫酸を加えます。海水の各リットルに0.25 mlを追加します。硫酸を加えたら、海水を軽く振り、さらに10mlのクロロホルムを加え、さらに2分間通気しながら激しく振ります。その後、分離を許可します。2 番目と 3 番目の分離。水を含まずに、底層を再び丸い底フ

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Research

JoVE Journal

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環境

我々は調査 - スキャンエレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI /...

エレクトロスプレーイオン化質量分析法を用いて酵母Lipidomeの定量評価

私たちは、勉強のための堅牢な生化学的および顕微鏡的手法を提示...

内脂肪量の生化学的および高スループット微視的評価<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

機械的な細胞破壊、溶媒ベースの脂質抽出、エステル交換、および定量化およびガスクロマトグラフィーを用いて脂肪酸の同定に基づく微細藻類中の脂肪酸含量および組成の決定のための方法が記載されている。 tripentadecanoin内部標準抽出及び不完全なエステル交換時の損失の可能性を補償するために使用される。...

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脂肪酸13C Isotopologue プロファイリング栄養炭素転送および無脊椎動物消費者の脂質代謝への洞察力を提供します。

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酸化重水素を用いた褐色脂肪組織における de novo 脂肪酸合成の定量的測定(英語)

このプロトコルは、フェノールレッドスレッドと液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)ベースのワークフローを用いてヒト涙液サンプルを採取し、涙液のリピドームプロファイルを発見するための独自の臨床プロトコルを説明しています。単純なメチルテル-ブチルエーテル(MTBE)/メタノール二相分離法により、涙のバイオマーカー発見に高い回収率で迅速な涙脂質抽出が可能となります。...

バイオマーカー発見における非標的涙液リピドミクスのためのフェノールレッドスレッドを用いたサンプリング手法

アメリカンロブスター漁業として利用甲殻類漁業への漁業による変化、潜在的に交尾の成功が低下する、生殖ダイナミクスに影響を与える可能性があります。この研究の目標は、生理学的または機能的に成熟したことが女性のロブスターの交尾の成功を確認するための非侵襲的方法を開発することでした。...

非侵襲的方法<em&gt;その場で</em&gt;女性アメリカンロブスターにおける交配の成功（の決定<em&gt;ロブスターのamericanus</em&gt;）

このプロトコルは、クロマトグラフィーと有機溶媒を用いて海水および生物標本から脂質の抽出と分析を詳細に記述しています。

海洋試料における総脂質および脂質クラスの決定

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