交配ミツバチクイーンズへの農薬リスクの評価

このプロトコルは、ミツバチの女王とその労働者の世話人を制御された実験室で農薬に暴露し、関連する応答を注意深く監視する方法を確立することによって、農薬がミツバチ(Apis mellifera)の再生にどのような影響を与えるかの理解を深めるために開発されました。

農薬暴露は、最も重要なメンバーである女王を含むミツバチコロニーのすべてのメンバーに大きな影響を与える可能性があります。しかし、最近まで, これらの効果を研究するために利用可能ないくつかのツール.この技術は、研究者が彼らが現場で経験するかもしれない条件をシミュレートする制御された条件下で農薬に女王を公開することができます。

ミツバチの女王の産卵行動を乱すのは非常に簡単なので、実験の前と間に労働者や女王を扱うときに注意することが重要です。これらの手順を実証するには、エイミー・フロイドとイライザ・リッツィー、侵略種と受粉者健康研究ユニット、ミツバチ研究所の実験室技術者です。まず、ドアパネルを挿入してクイーン監視ケージ、またはQMCを組み立て、給餌室のドアに女王除外機を給餌室の上に挿入し、女王が治療された食事に入ったり接触したりしないようにします。

単一 ELP を挿入します。作業者がケージに追加されるまでフィーダーチューブを追加せず、ラボグレードのテープで4つのフィーダー穴を一時的に覆います。ミツバチのコロニーからキャップされた労働者のブロードを含むワックスコームフレームを収集してインキュベートした後、閉じたミツバチを昆虫のバリア塗料が並ぶ開いた容器に払い落とし、ミツバチが這い出るのを防ぎます。

各QMCの産卵室に少なくとも50個のミツバチを重量で加えます。多様な遺伝的プールが導入されることを確実にするために、少なくとも3つのコロニーから同様の数の労働者ミツバチを得て、QMCにミツバチを加える前に混合できるようにしてください。

領収書から48時間以内に商業ブリーダーから購入した女王を使用してください。女王がまだ出荷ケージの中にいる間、透明なビニール袋に入れます。その後、袋の中に二酸化炭素ガスキャニスターに接続されたプラスチックチューブの一方の端を置き、キャニスターバルブを静かに開けて二酸化炭素ガスを流れるようにします。

袋がガスで膨らんだら、同時にキャニスターバルブを閉め、袋を閉じてガスを内部にトラップします。バッグを30秒間閉じたまま、または女王が動かなくなるまで閉じておきます。女王が意識不明であることが観察されたら、出荷ケージを開けて女王を取り除きます。

産卵室のドアを部分的に開け、無意識の女王を中にそっと入れて蓋を閉めます。各 QMC に 2 番目の ELP を追加します。2 つの EMP の上部にラボ用テープを置いて、QMC フレームから分離しないようにし、作業者がケージから出ないようにします。

ケージを34~35°Cの安定した環境条件、50~70%の相対湿度の暗いインキュベーターに入れます。農薬で覆われた食事を管理するには、アセトンなどの適切な溶媒に農薬のストック溶液を、目的の農薬の所望の最終濃度を達成するために食事に加えることができる濃度で調製する。スクロース溶液、市販花粉サプリメント、またはその両方で農薬処理を投与する。

実験食を同日に使用する準備をし、適切な量のストック溶液を冷やして室温、50%スクロース溶液に添加する。中速で渦を入れるだけで十分に混ぜます。花粉のサプリメント, スクロース溶液に農薬ストック溶液の計算量を追加, 粉末サプリメントにそれを追加する前に徹底的に渦.

フィーダーチューブにダイエットを追加し、QMCに入れる前にフィーダーの重量を記録します。産卵を定量化するには、まず、QMCをインキュベーターから取り出すことから始めます。透明なElpsの背面を調べ、卵が存在する場合は、目的のプレートの前にあるドアパネルを取り外します。

ELPsの向こう側からテープを取り外し、ELPとQMC内のミツバチとの間でドアパネルをスライドさせます。ドアパネルを設置して、ELPを取り外し、ELP細胞内の卵の数をカウントして記録します。硬い表面上のELPオープンセル側の端をタップして卵を取り除きます。

卵が脱落したら、QMCの空のELPを交換してください。QMCの外側にあるELPの後ろのドアパネルをそっと取り外して取り付けます。必要に応じて 2 番目の ELP を繰り返し、終了したら QMC 全体でテープを交換します。

食品の消費を監視するには、2日ごとに調理したての食事に置き換えます。新しいフィーダーチューブを準備し、卵の生産の監視活動を開始する前にそれらを計量します。古いチューブを新しいものと交換し、古いチューブを処分する前に計量します。

同じチューブの重量にフィーダーチューブと未消費の食事の最終的な重量を比較, 食事の消費量を推定します.フィーダーが空にならないように、1 日に 1 回チェックします。フィーダーチューブが空または空の近くにある場合は、それを取り外し、補充し、チューブの重量を前後に記録し、QMCの2日間のダイエット消費量合計に差を加えます。

QMC実験中に選択したポイントで、先に説明したように、QMCから産みたばかりの卵を含むELPを取り除きますが、ELPから卵を取り除かないでください。まず、ELPをPCRプレートシールで覆い、次にユニバーサルマイクロプレート蓋を覆い、飽和硫酸カリウム溶液を含むデシケータの中に置きます。QMCからElpsを取り外してから約78時間のハッチング率を評価します。

細胞の底部にあるC字型の幼虫は、ハッチングイベントが成功したことを示しています。QMCに過剰な作業者が装着されていた場合は、実験中に選択した時点で作業者のミツバチをサンプリングして、その生理学における治療による変化を評価します。サンプリングする前に、ELP と QMC の内部の間にドア パネルを配置し、ELP を取り外します。

慎重に、ケージの底部から約0.5センチメートルのドアパネルを持ち上げ、フェザー級ピンセットを使用してQMCの内部から作業者のビーを取り除きます。遺伝子発現解析では、ミツバチを液体窒素で凍結し、摂氏80度で保存します。収集したビーをフォローアップ分析のために保存し、必要な数のサンプルが収集されるまでこのプロセスを繰り返します。

毎日の卵数における食事中のイミダクロプリド治療関連の変化は、ポアソン対数線形一般化推定式を実施することによって評価し、自己回帰相関行列を用いた。毎日の卵の生産は、花粉サプリメントと10億分の50のイミダクロプリドを含むスクロースを与えられたQMCで有意に低かった。用量依存効果は、スクロースと花粉サプリメントの両方で投与されたイミダクロプリド治療のために各QMCで産生される卵の総数に対して観察された。

QMCで観察された最大の減少で、10億分の50のイミダクロプリドに餌を与え、続いて花粉サプリメントとスクロースで10億分の10部が続いた。コントロールとQMCの間で産生される総卵の違いは観察されなかった 10 億イミダクロプリドと花粉サプリメント単独で 10 部を供給.花粉のサプリメント, 水とスクロースの消費量は、毎に記録されました 48 時間のために 10 または 12 日.

実験が進むにつれてスクロースの消費の毎日の割合が大幅に増加しました, 花粉のサプリメントの消費率が減少しました.花粉サプリメントだけで10個/10個のイミダクロプリドが投与されたときに、花粉消費量の割合が高いことが観察された。そして、花粉サプリメントとスクロース溶液で10または50分の10の部分が一緒に投与されたときに率が低下した。

日齢ミツバチを使用することは、女王の受け入れを確実にし、再活性化よりも労働者を減らすために重要です。また、重要なのは、女王の慎重な取り扱いと安定した環境でケージを維持することです。