Name: 交配ミツバチクイーンズへの農薬リスクの評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 学ぶ、ミツバチ女王に対する農薬リスク評価法。QMCシステムを用いてイミダクロプリドの亜致死量暴露が産卵量と幼虫孵化率に与える影響を定量的に評価する標準化された実験プロトコルです。

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エイミー・キャッシュ・アーメド博士,ナサナエル・J・ビーチ,アリソン・L・サンキー博士の支援に感謝します。本書に記載されている商号または商用製品の言及は、特定の情報を提供する目的のみを目的としており、米国農務省の推薦または承認を意味するものではありません。USDAは機会均等プロバイダーと雇用主です。この研究は、国防高等研究プロジェクト庁#HR0011-16-2-0019からジーン・E・ロビンソンとハイミン・ジャオ、USDAプロジェクト2030-21000-001-00-D、イリノイ大学アーバナ・シャンパインのコミュニティ・カレッジ・学生のための平眼性可塑性研究経験によって支えられました。

1. QMCアセンブリ
<ol><li>図1Bに示すように、単一の産卵板(ELP)を挿入して部品(図1A)からQMCを組み立てます。作業者がケージに追加されるまでフィーダーチューブを追加しないでください。ラボグレードのテープで4つのフィーダー穴を一時的にカバーします。</li>
	<li>女王の除外器と給餌室のドアを給餌室の上に挿入して、女王が給餌室に入り、治療された食事に接触するのを防ぐ。詳細は、Fine et al.32 を参照してください。</li>
	<li>成人のエローションの24時間前にミツバチのコロニーからキャップされた作業員のブロードを含むワックスコームフレームを収集し、ブロードボックス内のインキュベーター(34.5°C)に入れます。24時間後、閉じたミツバチをフレームから磨き、昆虫バリア塗料(Fluonなど)が並んでいる開いた容器に入れ、ミツバチが這い出るのを防ぎます。</li>
	<li>各QMCの産卵室に少なくとも50個のミツバチ(5g≈50個のミツバチ44、45)を加えます。実験で多様な遺伝的プールが表現されるようにするには、少なくとも3つのコロニーからほぼ同数の労働者ミツバチを取得し、それらをQMCに追加する前にそれらを混合する。 注:1日未満の新しく閉鎖された労働者のミツバチは、未発達の飛行筋肉と硬化していないキューティクルのために飛んだり刺したりすることはできません。この年齢で追加された場合、取り扱い前に麻酔をする必要はありません。小さな1/4カップの体積測定カップを使用して容器からミツバチを優しくすくい取り、スケールでタールされた第2の容器(例えば、昆虫バリア塗料が並ぶ)に入れることで計量することができます。キャップ付きブロードで覆われたフレームの面積は、ソースコロニーがQMC労働者集団で均等に表現されるように、ほぼ等しくする必要があります。作業者ミツバチの均質化は、すべてのコロニーから採取したフレームから新たに閉じたミツバチを同じ容器にブラッシングし、それらをQMCsに追加する前に5分間混合できるようにすることで達成できる。</li>
	<li>スクロース溶液、水、花粉サプリメントを含むフィーダーを追加します( セクション2を参照)。</li>
	<li>産卵46を刺激し、QMCへの移動を容易にするためにCO2ガスに個々の交尾された女王を公開します。<ol>
<li>領収書から48時間以内に商業ブリーダーから購入した女王を使用してください。女王がまだ出荷ケージの中にいる間、透明なビニール袋に入れます。袋の中にCO2 ガスカニスターに接続されたプラスチックチューブの一端を置き、CO2 ガスが流れるようにカニスターバルブを静かに開きます。</li>
		<li>袋がガスで膨らんだら、同時にカニスターバルブを閉じ、袋を閉じてガスを内部にトラップします。バッグは30sまたは女王が動かなくなったまで閉じておきます。女王を取り除き、彼女が意識不明であることが観察されたら、出荷ケージを開きます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>部分的に産卵室へのドアを開け、無意識の女王を中にそっと置き、蓋を閉め、中の女王や労働者を押しつぶさないように注意します。 図1Cに示すように、2つ目の産卵プレートを各QMCに追加します。2 つの EMP の上部にラボ用テープを置いて、QMC フレームから分離しないようにし、作業員がケージから出ないようにします。</li>
	<li>ケージを、通常のコロニー内の条件のように、34±0.5°C、60%の相対湿度±の安定した環境条件で暗いインキュベーターに入れます。</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62316/62316fig01.jpg"> 図 1.A: 逆アセンブルされた QMC。 B: 1 ELPを挿入したQMCを部分的に組み立てました。 C: 2つのElpsを使用してQMCを完全に組み立てました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62316/62316fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
2. 農薬で覆われた食事療法の準備と管理
<ol><li>50%(g/g)のスクロース溶液の1000 gを調製するには、クリーンな1Lガラス試薬ボトルの底部に攪拌棒を置きます。500gのスクロースと500mLの脱イオン水を加えます。ボトルの蓋を緩め、すべてのスクロースが溶解するまで溶液を混合するために弱火に設定された加熱攪拌プレートを使用します。農薬ストック溶液を添加する前に、溶液を室温まで冷却してください。</li>
	<li>アセトンなどの適切な溶媒に農薬のストック溶液を、目的の農薬の所望の最終濃度を達成するために食事に加えることができる濃度で調製します。 注:アセトンを車両溶剤として使用する場合、経済協力開発機構(OECD)ガイドラインは、成人ミツバチ47の慢性経口毒性試験では、食事中のアセトンの最終濃度を≤5%にしなければならないと規定しています。しかし、n-メチル-2-ピロリドン5、31、ジメチルスルホキシド25などの一部の溶媒は、この濃度以下の毒性作用を発揮することができるので、治療食において溶媒濃度をできるだけ低く抑えることを推奨します。使用する溶媒の量や種類によっては、溶媒毒性による潜在的な影響が検出されることを確実にするために、溶媒制御群と負の対照群の両方を含める必要がある場合があります。製剤化された製品を使用する場合、使用される製品の量は、製剤中に存在する濃度に基づいて調整されなければならない。溶媒に関心のある農薬の安定性に応じて、ストック溶液は-20°Cで最大2週間保持することができます。</li>
	<li>OECD試験245の結果に基づいて致死性の低い用量を選択する:ハニービー(Apis mellifera L.)、慢性経口毒性試験(10日間給餌)47、およびEcotoxナレッジベース48を問い合わせて関連文献を同定する。</li>
	<li>スクロース溶液、市販花粉サプリメント(粉末として利用可能な場合)、またはその両方で農薬処理を投与する。冷却/室温50%スクロース溶液(w/w)に適切な量のストック溶液を添加して、同じ日に使用するための実験食を準備します。渦を巻くか、中速にセットした攪拌バーで十分に混ぜます。花粉のサプリメントの, 農薬レーススクロース溶液をメーカーのプロトコルに従ってシロップの代わりに粉末サプリメントに追加, 花粉ダイエットの最終的な重量に応じて使用されるストック液の量を調整することを確認します.計算例については 、表 1 を参照してください。</li>
	<li>2 mLマイクロ遠心チューブからフィーダーチューブを準備します。<ol>
<li>流動ダイエットフィーダーの場合は、ホットプレート/コンロで20ゲージの針の先端を加熱し、チューブの底部を2回穿刺します。チューブ蓋とピペットを約1.5mLのスクロース溶液または水を穿刺穴の1つを通して閉じます。QMCに追加されるまで、穿刺された側でチューブを下に置きます。</li>
		<li>花粉サプリメントフィーダーの場合は、カミソリの刃を使用してチューブの底部をスライスします。蓋を閉じ、蓋に触れるまで花粉サプリメント1-2gボールをチューブに押し込みます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>QMC に配置する前にフィーダーの重みを記録します。48時間以上、未使用の食事を4°Cに保ちないでください。</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>所望の集中</td>
			<td>望ましい溶媒の車の集中</td>
			<td>スクロース溶液の最終容積/質量</td>
			<td>ストックソリューションのVoume</td>
			<td>イミダクロプリド(ストック溶液)</td>
			<td>推奨されるストックソリューションのレシピ</td>
		</tr>
<tr>
<td>スクロース溶液</td>
			<td>10 ppb (w/w)</td>
			<td>0.05% (v/v)</td>
			<td>81.45 mL/100 g*</td>
			<td>40.7 μL</td>
			<td>0.001 mg/40.7 μL</td>
			<td>0.02 mg/814 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>花粉サプリメント</td>
			<td>10 ppb (w/w)</td>
			<td></td>
			<td>10 g**</td>
			<td>4.07 μL</td>
			<td>0.0001 mg/4.07 μL</td>
			<td>0.02 mg/814 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>スクロース溶液</td>
			<td>50 ppb (w/w)</td>
			<td>0.05% (v/v)</td>
			<td>78.5 mL/100 g*</td>
			<td>40.7 μL</td>
			<td>0.005 mg/40.7 μL</td>
			<td>0.1 mg/814 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>花粉サプリメント</td>
			<td>50 ppb (w/w)</td>
			<td></td>
			<td>10 g**</td>
			<td>4.07 μL</td>
			<td>0.0005 mg/4.07 μL</td>
			<td>0.1 mg/814 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:処理されたスクロース溶液、花粉サプリメント、およびストック溶液のレシピ例。 *50%(w/w)スクロース溶液(1.228 g/mL)の密度に基づく体積。**花粉サプリメントの密度は、使用される製品によって異なりますが、この溶媒量を使用する場合、花粉サプリメントの最終溶媒濃度は、≤5体積の範囲内になります。
3. モニタリング - 卵生産率
<ol><li>月産の月を朝と夕方に1日1~2回量ります。まず、卵子を確認するために、インキュベーターからQMCを取り外すことから始めます。 注:成功した実験では、卵の生産は最初のケージアセンブリの3日以内にコントロールQMCのほとんどで開始されます。10分以内にチェックして供給できるQMCsを一度にインキュベーターから取り出すだけです。インキュベーターの外でより長い期間は、卵の生産を中断する可能性があります。</li>
	<li>卵のクリアなElpsの背面を調べます。卵が存在する場合は、目的のプレートの前にあるドアパネルを取り外します。ELPsの向こう側からテープを取り出し、ELPとQMC内のミツバチとの間でドアパネルを慎重にスライドさせ、ELP内の細胞を洗浄している可能性のあるミツバチを粉砕しないように注意してください。</li>
	<li>ドアパネルを設置して、ELPを取り外し、ELP細胞内の卵の数をカウントして記録します。ELPの端をタップして卵を取り除き、開いたセル側を下に、硬い表面(廃棄物容器の唇など)に置きます。卵が脱落したら、QMCの空のELPを交換してください。QMCの外側にあるELPの後ろのドアパネルをそっと取り外して取り付けます。必要に応じて 2 番目の ELP を繰り返し、終了したら QMC 全体でテープを交換します。 注:卵の生産は一般的に減少し、2週間32、33後にQMCで死亡率が増加し、14日後に実験を終えることを推奨します。</li>
</ol>4. モニタリング - 食品消費
<ol><li>QMCフィーダーに残っているすべての食品を、2日ごとに作りたての食事に置き換えます。新しいフィーダーチューブ(水を含む)を準備し、それらを計量してから、モニタリングのためにインキュベーターからQMCを取り外します。新しいものとすべての古いチューブを交換し、未使用の食事を処分する前に古いチューブを計量します。ダイエット消費量を見積もるためにQMCに入れる前に、フィーダーチューブと未消費の食事の最終的な重量を同じフィーダーチューブの重量と比較してください。</li>
	<li>フィーダーの交換が予定されている日の間に、1日1回(QMCが卵の生産を監視する場合と同時に)ダイエットの消費量をチェックして、フィーダーが空にならないようにします。フィーダーチューブが空または空の近くにある場合は、それを取り外し、補充し、チューブの重量を前後に記録し、QMCの2日間の食事消費量合計に差を加えます。</li>
</ol>5. モニタリング - 胚の生存率
<ol><li>QMC実験中に選択したポイントで、 ステップ3に従ってQMCから産たばかりの卵を含むELPを取り除きますが、ELPから卵を取り除かないでください。</li>
	<li>ユニバーサルマイクロプレートの蓋でELPを覆い、飽和K2SO 4溶液(150 g K2SO4水の1Lで、浅い皿に入れておきます)でデシケーターの中に置きます。 注:いくつかの塩は、混合物がインキュベーターで温度に来た後、皿の底に見える必要があります。</li>
	<li>デシケーターをインキュベーターに34.5°Cに設定し、コリンズ49で使用される条件と同様に、デシケータ内部の相対湿度95%を生じる。 注:ほぼすべての卵は、49を産んだ後72±6時間以内に孵化するため、ElpsがQMCから取り除かれた78時間後に孵化率を早くも評価することができます。細胞の底部にある「C」形の幼虫は、ハッチングイベントが成功したことを示しています。たとえば、卵がドローンであり、労働者50ではなく、このタイミングのいくつかの変動が可能です。</li>
</ol>6. ワーカー サンプリング
<ol><li>QMCに過剰な作業者が装着されている場合は、治療の評価のために、選択した時点で、選択した時点で作業者のミツバチをサンプリングし、その生理学の変化を誘発します。毎日の摂食および卵の計数活動と組み合わせて収集を行い、QMCがインキュベーターの外にある時間を最小限に抑えます。</li>
	<li>サンプリングする前に、ELP と QMC の内部の間にドア パネルを配置し、ELP を取り外します。慎重にケージのベースから約0.5cmのドアパネルを持ち上げ、フェザー級ピンセットを使用してQMCの内部から作業用のビーを取り外します。ミツバチが逃げるのを防ぐために、0.5cmの開口部の部分を手袋をした指または綿で必要に応じて覆います。</li>
	<li>収集したビーをフォローアップ分析のために保存し、所望の数のサンプルが収集されるまでこのプロセスを繰り返します。遺伝子発現解析では、液体窒素中の凍結ミツバチをスナップし、−80°Cで即時保存することが強く推奨される51.</li>
</ol>7. 労働者死亡率
<ol><li>授乳室と産卵室の底にある死んだミツバチの数を数えることによって、実験中の労働者の死亡率を評価する。毎日の産卵定量と組み合わせてこの評価を行います。</li>
	<li>鉗子を使用して、慎重に鉗子が挿入されていない間手袋の指または綿の部分で穴をカバーし、フィーダー穴を通して死んだミツバチを取り除きます。</li>
	<li>ケージの基部から約0.5cmのドアパネルを慎重に持ち上げ、鉗子を挿入して、産卵室から死んだミツバチを取り除きます。ミツバチが逃げるのを防ぐために、0.5cmの開口部の部分を手袋をした指または綿で必要に応じて覆います。</li>
	<li>残りのミツバチを安楽死させる前に、前述の方法を使用して、QMCからすべての死んだミツバチを取り除いて数えることによって、実験の終わりに労働者の死亡率を評価する。 注:労働者のミツバチがいない場合、女王は卵を生産せず、24時間以内に飢えます。したがって、QMC 内のすべての作業者が死亡することが観察された場合、QMC を実験から削除する必要があります。同様に、実験中に女王が死亡した場合、QMCを削除し、データを適切に検閲する必要があります。</li>
</ol>

著者は宣言する利害の対立を持っていません。

女性の孤独な昆虫の女性だけでなく、ユー社会的な昆虫のコロニーの女王は、そのような農薬25、28、29、30、33などの非生物的ストレッサーの影響を受けることができます。ミツバチでは、農薬が女王に及ぼす影響は、介護の変化や労働者ミツバチによる授乳によって起こり得るため、間接的である可能性があります。我々の代表的な結果は、フィールドベースの研究29で報告されたものと同様であり、QMCを用いた実験室環境において農薬がクイーン性能に及ぼす影響を効率的に測定し、フィールドベースのアプローチと同等の結果を生み出すことを実証している。さらに、これらの結果は、イミダクロプリドが労働者の食事消費に及ぼす影響と卵の生存率に光を当てた。
<p class="jove_content...

農業製品に対する世界的な需要の増加のために、現代の農業慣行は、多くの場合、作物の収量を減らすか、害を与えることが知られている多数の害虫を制御するために農薬の使用を必要とします1.同時に、多くの果物、野菜、ナッツ作物の生産者は、豊富な作物収量を確保するために、商業ミツバチのコロニーによって提供される受粉サービスに依存しています2.これらの慣行は、ミツバチ(Apis mellifera)を含む受粉者が有害なレベルの残留農薬3にさらされる可能性があります。同時に、ミツバチのコロニーにおける寄生バロアデストラクタダニの侵入の広範な存在は、しばしば養蜂家がミチサイドでじんましんを治療することを必要とし、コロニー4、5、6の健康と長寿にも悪影響を及ぼす可能性がある。農薬製品の有害な影響を軽減し、軽減するためには、その実施前にミツバチの安全性を十分に評価して、有益な昆虫を保護するための推奨を行う必要があります。
現在、環境保護庁(EPA)は、ミツバチの農薬暴露に対する段階的なリスク評価戦略に依存しており、これは成虫ミツバチと時にはミツバチの幼虫7に対する実験室試験を伴う。低層のラボテストで毒性の問題を緩和できない場合は、より高い層フィールドとセミフィールドテストが推奨される場合があります。これらの実験室試験は、農薬が労働者の長寿に及ぼす潜在的な影響に関する貴重な洞察を提供するが、彼らは必ずしも生物学的に8と行動的に9の労働者とは大きく異なる女王への影響を予測する必要はない。さらに、農薬が死亡率を超えた昆虫に及ぼす影響は数多くあり、コロニーユニット10,11として機能する協調行動に依存する社会的昆虫にかなりの影響を及ぼす可能性がある。
死亡率は農薬農薬12の最も一般的な効果と考えられているが、これらの製品は、変化した行動13、14、15、16、忌避性または誘致性17、18、19、摂食パターンの変化を含む標的と非標的節足動物の両方に幅広い影響を及ぼす可能性がある20、21、22 、および増加または減少したfecundity20、21、22、23、24、25。社会的昆虫の場合、これらの効果は、コロニー相互作用および機能11を全身的に破壊する可能性がある。これらの機能のうち、コロニーユニット9の残りの部分で支えられている単一の産卵クイーンに大きく依存している再生は、農薬暴露による摂動に対して特に脆弱である可能性がある。
未熟な女王に対して行われた研究は、殺虫剤への発達暴露が成人の女王の行動、生理学、生存26、27に影響を与えることを実証した。同様に、完全または縮小された大きさのコロニーを使用した研究は、農薬が交配の成功を減少させることによって成体ミツバチの女王に影響を与えることができることを実証しました28,卵位を減少させます29, そして、25,30,31を生産した卵の生存率を減少させます.これらの現象は、主に利用可能な実験室の方法の欠如のために、コロニー全体を使用せずに観察することは以前は困難でした。しかしながら、クイーンモニタリングケージ(QMC)32を用いて厳しく管理された実験室条件下での女王の卵位位置を研究する方法は、最近、アグロケミカルが女王の胎児性33に及ぼす影響を調べるために適応されている。ここでは、これらの技術について、QMCにおける労働者の食事消費量を測定および追跡するための追加の方法と共に詳細に説明する。
これらの方法は、通常コロニー34の中に存在する数万人に対して、農薬の正確な用量を大幅に減少させるため、フルサイズのコロニーを必要とする実験よりも有利であり、その後、女王を提供する。この暴露技術は、コロニー内で女王が自分自身を養い、労働者にダイエット9を提供することに頼るので、クイーンズが現実世界のシナリオで経験する中古暴露を反映しています。同様に、女王は一般的に交配便35のためのコロニー再生(群れ)の間を除いてハイブを離れないでください。交尾ミツバチの女王は、商業女王ブリーダーから購入し、一晩出荷することができます。通常、女王ブリーダーは、彼らが成功した交配の兆候として取られる卵を産み始めたことを確認した直後に女王を販売しています。クイーンの年齢や関連性に関するより正確な情報が必要な場合は、研究者は注文を出す前に女王ブリーダーに相談することができます。
QMCはミツバチの女王のオビポジションと卵の孵化率32、33の正確な観察と定量化を可能にし、農薬暴露が女王の胎児性に及ぼす影響に関連する貴重なデータを生み出す。ここで提示される代表的な結果は、全身性神経毒性剤ネオニコチノイド農薬イミダクロプリド36の分野関連濃度への慢性曝露下におけるQMCにおける排卵、食事消費、および胚生存率を定量する実験について説明する。一度適用されると、イミダクロプリドは植物組織37に移設し、かつ残基が多数の生花粉植物38、39、40の花粉および蜜を検出された。イミダクロプリドへの暴露は、採餌性能16の障害、免疫機能41の障害、およびコロニー拡張および生存率の低下率42、43を含むミツバチに対する有害な影響の広い範囲を有することができる。ここでは、イミダクロプリドは、フィールド実験がミツバチの女王のオビ位置に影響を与えることができることを示しているので、試験物質として使用するために選択されました29

<table><tbody><tr><td>Fluon</td><td>BioQuip, Rancho Dominguez, CA</td><td>2871A</td><td></td></tr><tr><td>Honey bee queens</td><td>Olivarez Honey Bees, Orland, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imidacloplid</td><td>Sigma-Aldritch, St. Louis, MO</td><td>37894</td><td></td></tr><tr><td>MegaBee Powder</td><td>MegaBee, San Dieago, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes 2 mL</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>02-682-004</td><td></td></tr><tr><td>ニードル 20ゲージ</td><td>W. W. Grainger, Lake Forest, IL</td><td>5FVK4</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Sulfate</td><td>Sigma-Aldritch, St. Louis, MO</td><td>P0772</td><td></td></tr><tr><td>Queen Monitoring Cages</td><td>University of Illinois Urbana-Champaign</td><td></td><td>特許出願番号: 20190350175</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldritch, St. Louis, MO</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td>ユニバーサルマイクロプレートリッド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ</td>州<td>5500</td><td></td></tr></tbody></table>

交配ミツバチクイーンズへの農薬リスクの評価

Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

ミツバチの現在のリスク評価戦略は、成人または未熟な労働者ミツバチに対して行われた実験室試験に大きく依存していますが、これらの方法はミツバチの女王に対する農薬暴露の影響を正確に捉えていない可能性があります。ミツバチのコロニー内の受精卵の唯一の生産者として、女王は間違いなく機能するコロニーユニットの最も重要な単一のメンバーです。したがって、農薬が女王の健康と生産性にどのような影響を与えるかを理解することは、農薬リスク評価の重要な側面と考えるべきである。ここでは、ミツバチの女王と労働者の女王アテンダントを労働者の食事を通じて投与される農薬ストレッサーに暴露し、続いて実験室での卵の生産を追跡し、クイーンモニタリングケージと呼ばれる特殊なケージを使用して最初のインスターエクロセオンを評価するための適応方法が提示されます。この方法の意図した使用を説明するために、労働者女王アテンダントがイミダクロプリドの致死量を含む食事を与えられ、女王への影響を監視した実験の結果が説明される。

卵の生産は、卵の生産と治療群あたり15ケージの1日1回の観測で、上記のように組み立てられ、維持されたQMCで監視されました。主にカルニオラン株の新婚女王は、女王ブリーダーから一晩購入し、出荷され、ミツバチの労働者は、イリノイ大学アーバナ・シャンペーン校の蜂研究施設で標準的な商業方法に従って維持された3つのコロニーから得られました。ここでは、 4つの食事療法群が使用された:1)50 ppb(g/g)スクロース溶液および花粉サプリメント中のイミダクロプリド(50 ppb - p+s)、2)10 ppbイミダクロプリドスとショ糖溶液および 花粉サプリメント(10 ppb -p+s)、3)10 ppbイミダクロプリド単独で花粉サプリメント(10 ppb -p)、および4)治療群として同等量のアセトンを含む食事を与えられた対照群(CTRL)。
毎日の卵数の治療関連の変化は、微小な改変を伴うFine et32 に記載されているように評価された。簡単に言えば、自己回帰(AR-1)相関行列構造を有するポアソン対数線形GEEが、時間の経過とともに卵の生...

このプロトコルは、ミツバチの女王とその労働者の世話人を制御された実験室で農薬に暴露し、関連する応答を注意深く監視する方法を確立することによって、農薬がミツバチ(Apis mellifera)の再生にどのような影響を与えるかの理解を深めるために開発されました。

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not ...

農薬暴露は、最も重要なメンバーである女王を含むミツバチコロニーのすべてのメンバーに大きな影響を与える可能性があります。しかし、最近まで, これらの効果を研究するために利用可能ないくつかのツール.この技術は、研究者が彼らが現場で経験するかもしれない条件をシミュレートする制御された条件下で農薬に女王を公開することができます。ミツバチの女王の産卵行動を乱すのは非常に簡単なので、実験の前と間に労働者や女王を扱うときに注意することが重要です。これらの手順を実証するには、エイミー・フロイドとイライザ・リッツィー、侵略種と受粉者健康研究ユニット、ミツバチ研究所の実験室技術者です。まず、ドアパネルを挿入してクイーン監視ケージ、またはQMCを組み立て、給餌室のドアに女王除外機を給餌室の上に挿入し、女王が治療された食事に入ったり接触したりしないようにします。単一 ELP を挿入します。作業者がケージに追加されるまでフィーダーチューブを追加せず、ラボグレードのテープで4つのフィーダー穴を一時的に覆います。ミツバチのコロニーからキャップされた労働者のブロードを含むワックスコームフレームを収集してインキュベートした後、閉じたミツバチを昆虫のバリア塗料が並ぶ開いた容器に払い落とし、ミツバチが這い出るのを防ぎます。各QMCの産卵室に少なくとも50個のミツバチを重量で加えます。多様な遺伝的プールが導入されることを確実にするために、少なくとも3つのコロニーから同様の数の労働者ミツバチを得て、QMCにミツバチを加える前に混合できるようにしてください。領収書から48時間以内に商業ブリーダーから購入した女王を使用してください。女王がまだ出荷ケージの中にいる間、透明なビニール袋に入れます。その後、袋の中に二酸化炭素ガスキャニスターに接続されたプラスチックチューブの一方の端を置き、キャニスターバルブを静かに開けて二酸化炭素ガスを流れるようにします。袋がガスで膨らんだら、同時にキャニスターバルブを閉め、袋を閉じてガスを内部にトラップします。バッグを30秒間閉じたまま、または女王が動かなくなるまで閉じておきます。女王が意識不明であることが観察されたら、出荷ケージを開けて女王を取り除きます。産卵室のドアを部分的に開け、無意識の女王を中にそっと入れて蓋を閉めます。各 QMC に 2 番目の ELP を追加します。2 つの EMP の上部にラボ用テープを置いて、QMC フレームから分離しないようにし、作業者がケージから出ないようにします。ケージを34~35°Cの安定した環境条件、50~70%の相対湿度の暗いインキュベーターに入れます。農薬で覆われた食事を管理するには、アセトンなどの適切な溶媒に農薬のストック溶液を、目的の農薬の所望の最終濃度を達成するために食事に加えることができる濃度で調製する。スクロース溶液、市販花粉サプリメント、またはその両方で農薬処理を投与する。実験食を同日に使用する準備をし、適切な量のストック溶液を冷やして室温、50%スクロース溶液に添加する。中速で渦を入れるだけで十分に混ぜます。花粉のサプリメント, スクロース溶液に農薬ストック溶液の計算量を追加, 粉末サプリメントにそれを追加する前に徹底的に渦.フィーダーチューブにダイエットを追加し、QMCに入れる前にフィーダーの重量を記録します。産卵を定量化するには、まず、QMCをインキュベーターから取り出すことから始めます。透明なElpsの背面を調べ、卵が存在する場合は、目的のプレートの前にあるドアパネルを取り外します。ELPsの向こう側からテープを取り外し、ELPとQMC内のミツバチとの間でドアパネルをスライドさせます。ドアパネルを設置して、ELPを取り外し、ELP細胞内の卵の数をカウントして記録します。硬い表面上のELPオープンセル側の端をタップして卵を取り除きます。卵が脱落したら、QMCの空のELPを交換してください。QMCの外側にあるELPの後ろのドアパネルをそっと取り外して取り付けます。必要に応じて 2 番目の ELP を繰り返し、終了したら QMC 全体でテープを交換します。食品の消費を監視するには、2日ごとに調理したての食事に置き換えます。新しいフィーダーチューブを準備し、卵の生産の監視活動を開始する前にそれらを計量します。古いチューブを新しいものと交換し、古いチューブを処分する前に計量します。同じチューブの重量にフィーダーチューブと未消費の食事の最終的な重量を比較, 食事の消費量を推定します.フィーダーが空にならないように、1 日に 1 回チェックします。フィーダーチューブが空または空の近くにある場合は、それを取り外し、補充し、チューブの重量を前後に記録し、QMCの2日間のダイエット消費量合計に差を加えます。QMC実験中に選択したポイントで、先に説明したように、QMCから産みたばかりの卵を含むELPを取り除きますが、ELPから卵を取り除かないでください。まず、ELPをPCRプレートシールで覆い、次にユニバーサルマイクロプレート蓋を覆い、飽和硫酸カリウム溶液を含むデシケータの中に置きます。QMCからElpsを取り外してから約78時間のハッチング率を評価します。細胞の底部にあるC字型の幼虫は、ハッチングイベントが成功したことを示しています。QMCに過剰な作業者が装着されていた場合は、実験中に選択した時点で作業者のミツバチをサンプリングして、その生理学における治療による変化を評価します。サンプリングする前に、ELP と QMC の内部の間にドア パネルを配置し、ELP を取り外します。慎重に、ケージの底部から約0.5センチメートルのドアパネルを持ち上げ、フェザー級ピンセットを使用してQMCの内部から作業者のビーを取り除きます。遺伝子発現解析では、ミツバチを液体窒素で凍結し、摂氏80度で保存します。収集したビーをフォローアップ分析のために保存し、必要な数のサンプルが収集されるまでこのプロセスを繰り返します。毎日の卵数における食事中のイミダクロプリド治療関連の変化は、ポアソン対数線形一般化推定式を実施することによって評価し、自己回帰相関行列を用いた。毎日の卵の生産は、花粉サプリメントと10億分の50のイミダクロプリドを含むスクロースを与えられたQMCで有意に低かった。用量依存効果は、スクロースと花粉サプリメントの両方で投与されたイミダクロプリド治療のために各QMCで産生される卵の総数に対して観察された。QMCで観察された最大の減少で、10億分の50のイミダクロプリドに餌を与え、続いて花粉サプリメントとスクロースで10億分の10部が続いた。コントロールとQMCの間で産生される総卵の違いは観察されなかった 10 億イミダクロプリドと花粉サプリメント単独で 10 部を供給.花粉のサプリメント, 水とスクロースの消費量は、毎に記録されました 48 時間のために 10 または 12 日.実験が進むにつれてスクロースの消費の毎日の割合が大幅に増加しました, 花粉のサプリメントの消費率が減少しました.花粉サプリメントだけで10個/10個のイミダクロプリドが投与されたときに、花粉消費量の割合が高いことが観察された。そして、花粉サプリメントとスクロース溶液で10または50分の10の部分が一緒に投与されたときに率が低下した。日齢ミツバチを使用することは、女王の受け入れを確実にし、再活性化よりも労働者を減らすために重要です。また、重要なのは、女王の慎重な取り扱いと安定した環境でケージを維持することです。

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生物学

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交配ミツバチクイーンズへの農薬リスクの評価

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