Name: ソミトジェネシスを支配するシグナル伝達振動の機能的調査のためのマイクロフルイディクスアプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-19T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: 学ぶマイクロフルイディクスを用いたマウス胚におけるシグナル伝達振動の機能的解析。前節板中胚葉の体節形成における動的シグナリングの精密制御と同調化を実現し、発生生物学研究に応用可能な手法です。

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UMC ユトレヒトの Yang Li 氏と Jos Malda 氏に、金型の 3D プリンティングを支援してくださったこと、Sonnen グループの Karen van den Anker 氏にプロトコルに関する非常に有益なフィードバックをいただき、Hubrecht Institute の機械ワークショップで顕微鏡内のマイクロ流体チップのホルダーを手伝ってくれた Tjeerd Faase 氏に感謝しています。原稿を批判的に読んでくれたSonnenグループ全体と、建設的なフィードバックをしてくれた査読者に感謝します。この研究は、ERC開始助成金契約第850554号(K.F.S.)に基づき、欧州研究評議会から資金提供を受けた。

<ol><li>Manning, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+single-cell+live+imaging+links+HES5+dynamics+with+cell-state+and+fate+in+murine+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Quantitative single-cell live imaging links HES5 dynamics with cell-state and fate in murine neurogenesis.</a> Nature Communications. 10 (1), (2019).</li>
<li>Seymour, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jag1+modulates+an+oscillatory+Dll1-Notch-Hes1+Signaling+module+to+coordinate+growth+and+fate+of+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Jag1 modulates an oscillatory Dll1-Notch-Hes1 Signaling module to coordinate growth and fate of pancreatic progenitors.</a> Developmental Cell. , 1-17 (2020).</li>
<li>Hubaud, A., Pourquié, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+dynamics+in+vertebrate+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Signaling dynamics in vertebrate segmentation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 709-721 (2014).</li>
<li>Aulehla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt3a+plays+a+major+role+in+the+segmentation+clock+controlling+somitogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt3a plays a major role in the segmentation clock controlling somitogenesis.</a> Developmental Cell. 4 (3), 395-406 (2003).</li>
<li>Aulehla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%CE%B2-catenin+gradient+links+the+clock+and+wavefront+systems+in+mouse+embryo+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A β-catenin gradient links the clock and wavefront systems in mouse embryo segmentation.</a> Nature Cell Biology. 10 (2), 186-193 (2008).</li>
<li>Niwa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+initiation+and+propagation+of+Hes7+oscillation+are+cooperatively+regulated+by+Fgf+and+Notch+signaling+in+the+somite+segmentation+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The initiation and propagation of Hes7 oscillation are cooperatively regulated by Fgf and Notch signaling in the somite segmentation clock.</a> Developmental Cell. 13 (2), 298-304 (2007).</li>
<li>Niwa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+types+of+oscillations+in+notch+and+Fgf+signaling+regulate+the+spatiotemporal+periodicity+of+somitogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Different types of oscillations in notch and Fgf signaling regulate the spatiotemporal periodicity of somitogenesis.</a> Genes and Development. 25 (11), 1115-1120 (2011).</li>
<li>Sonnen, K. F., Aulehla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+signal+encoding+-+From+cells+to+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic signal encoding - From cells to organisms.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 34, 91-98 (2014).</li>
<li>Wahl, M. B., Deng, C., Lewandowski, M., Pourquié, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signaling+acts+upstream+of+the+NOTCH+and+WNT+signaling+pathways+to+control+segmentation+clock+oscillations+in+mouse+somitogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF signaling acts upstream of the NOTCH and WNT signaling pathways to control segmentation clock oscillations in mouse somitogenesis.</a> Development. 134 (22), 4033-4041 (2007).</li>
<li>Sonnen, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+phase+shift+between+Wnt+and+Notch+signaling+oscillations+controls+mesoderm+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modulation of phase shift between Wnt and Notch signaling oscillations controls mesoderm segmentation.</a> Cell. 172 (5), 1079-1090 (2018).</li>
<li>Sonnen, K. F., Merten, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+as+an+emerging+precision+tool+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Microfluidics as an emerging precision tool in developmental biology.</a> Developmental Cell. 48 (3), 293-311 (2019).</li>
<li>Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+embedded+within+extracellular+matrix+to+define+vascular+architectures+and+pattern+diffusive+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients.</a> Lab on a Chip. 13 (16), 3246-3252 (2013).</li>
<li>Cimetta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+device+generating+stable+concentration+gradients+for+long+term+cell+culture%3A+Application+to+Wnt3a+regulation+of+%CE%B2-catenin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic device generating stable concentration gradients for long term cell culture: Application to Wnt3a regulation of β-catenin signaling.</a> Lab on a Chip. 10 (23), 3277-3283 (2010).</li>
<li>Demers, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development-on-chip%3A+In+vitro+neural+tube+patterning+with+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Development-on-chip: In vitro neural tube patterning with a microfluidic device.</a> Development (Cambridge). 143 (11), 1884-1892 (2016).</li>
<li>Frank, T., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-switching+allows+independently+programmable%2C+extremely+stable%2C+high-throughput+diffusion-based+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Flow-switching allows independently programmable, extremely stable, high-throughput diffusion-based gradients.</a> Lab on a Chip. 13 (7), 1273-1281 (2013).</li>
<li>Tay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+NF-B+dynamics+reveal+digital+activation+and+analogue+information+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell NF-B dynamics reveal digital activation and analogue information processing.</a> Nature. 466 (7303), 267-271 (2010).</li>
<li>Kellogg, R. A., Gómez-Sjöberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+microfluidic+single-cell+analysis+pipeline+for+studies+of+signaling+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1713-1726 (2014).</li>
<li>Kellogg, R. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+facilitates+transcriptional+control+under+dynamic+inputs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs.</a> Cell. 160 (3), 381-392 (2015).</li>
<li>Takayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+positioning+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Subcellular positioning of small molecules.</a> Nature. 411 (6841), 1016(2001).</li>
<li>Takayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+chemical+treatment+of+cellular+microdomains+using+multiple+laminar+streams%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Selective chemical treatment of cellular microdomains using multiple laminar streams.</a> Chemistry & Biology. 10 (2), 123-130 (2003).</li>
<li>Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+heart+on+a+chip+for+higher+throughput+pharmacological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies.</a> Lab on a Chip. 13 (18), 3599-3608 (2013).</li>
<li>Li, C. Y., Wood, D. K., Huang, J. H., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-based+pipeline+for+systematic+modulation+and+analysis+of+3D+tumor+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Flow-based pipeline for systematic modulation and analysis of 3D tumor microenvironments.</a> Lab on a Chip. 13 (10), 1969-1978 (2013).</li>
<li>Tumarkin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+combinatorial+cell+co-culture+using+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics.</a> Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).</li>
<li>Berthier, E., Young, E. W. K., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineers+are+from+PDMS-land%2C+biologists+are+from+polystyrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Engineers are from PDMS-land, biologists are from polystyrenia.</a> Lab on a Chip. 12 (7), 1224-1237 (2012).</li>
<li>Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., François, P., Aulehla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+of+embryonic+patterning+based+on+phase-gradient+encoding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding.</a> Nature. 493 (7430), 101-105 (2013).</li>
<li>Lo, J. F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+temporal+control+of+oxygen+microenvironment+at+the+single+islet+level%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Quantitative and temporal control of oxygen microenvironment at the single islet level.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (81), (2013).</li>
<li>Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+high-resolution+imaging+of+developing+C.+elegans+larvae+with+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term high-resolution imaging of developing C. elegans larvae with microfluidics.</a> Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).</li>
<li>Lucchetta, E. M., Lee, J. H., Fu, L. A., Patel, N. H., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Drosophila+embryonic+patterning+network+perturbed+in+space+and+time+using+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Drosophila embryonic patterning network perturbed in space and time using microfluidics.</a> Nature. 434 (7037), 1134-1138 (2005).</li>
<li>Nikolaev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+mini-intestines+through+scaffold-guided+organoid+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis.</a> Nature. , (2020).</li>
<li>Sanka, R., Lippai, J., Samarasekera, D., Nemsick, S., Densmore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D%C2%B5F+-+Interactive+design+environment+for+continuous+flow+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3DµF - Interactive design environment for continuous flow microfluidic devices.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-10 (2019).</li>
<li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscale+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Soft lithography for micro- and nanoscale patterning.</a> Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).</li>
<li>Yoshioka-kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+delay+controls+synchronized+oscillation+in+the+segmentation+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coupling delay controls synchronized oscillation in the segmentation clock.</a> Nature. 16, (2019).</li>
<li>Mönke, G., Sorgenfrei, F. A., Schmal, C., Granada, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+time+frequency+analysis+for+biological+data+-+pyBOAT%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Optimal time frequency analysis for biological data - pyBOAT.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+optogenetics+in+cell+biology%3A+Interrogating+molecular+circuits+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The promise of optogenetics in cell biology: Interrogating molecular circuits in space and time.</a> Nature Methods. 8 (1), 35-38 (2011).</li>
<li>Dettinger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+microfluidic+system+for+dynamic+stimulation+and+tracking+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Automated microfluidic system for dynamic stimulation and tracking of single cells.</a> Analytical Chemistry. 90 (18), 10695-10700 (2018).</li>
<li>Manfrin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+signaling+centers+for+the+spatially+controlled+patterning+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineered signaling centers for the spatially controlled patterning of human pluripotent stem cells.</a> Nature Methods. 16 (7), 640-648 (2019).</li>
<li>Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organoids-on-a-chip.</a> Science. 965, 960-965 (2019).</li>
<li>Krenger, R., Cornaglia, M., Lehnert, T., Gijs, M. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+for%3A+Caenorhabditis+elegans+culture+and+oxygen+consumption+rate+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system for: Caenorhabditis elegans culture and oxygen consumption rate measurements.</a> Lab on a Chip. 20 (1), 126-135 (2019).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もありません。

シグナル伝達ダイナミクスが多細胞系をどのように制御するかは、この分野で長年の問題でした。機能調査は、これらのダイナミクスを微妙に変調してこれを可能にする必要があるため、重要な課題を提起します11。経路摂動に対するこのような時間的制御は、原理的には光遺伝学を用いて達成することができ、これはまた、高い空間的制御を可能にする34。しかし、光遺伝学は、問題の各シグナル伝達経路の解析のための洗練された遺伝的ツールの確立を必要とする。ここで説明する現在のプロトコルは、あらゆるシグナル伝達経路の摂動のための非常に汎用性の高いツールを提供します。マイクロフルイディクス実験により、時間的に制御された薬物パルスを適用して、組織培養におけるシグナル伝達経路のダイナミクスを機能的に調査することができます。ここでは、 ex vivo 培養におけるソミトジェネシスの研究に焦点を当てていますが、プロトコルは他のモデル系に適合するように適合させることができます。
プロトコルの特定のステップは、マイクロ流体実験を成功させるために重要です(表1に要約)。主なポイントは、以下のとおりです。実験の過程で培地の流れのために、組織培養はせん断応力を経験する。モデルシステムを連続的な流れにさらすと、細胞ストレスが発生し、極端な場合にはせん断効果による細胞死を引き起こす可能性があります。マウスの尾芽のエクスビボ組織培養および現在のチップ設計では、60 μL/h(最大100 μL/h)の流量が最小限のせん断効果でうまく機能することが見出された。同じチップに対して複数のポンプを同時にオンにする場合は、総流量が増加しないように、個々のポンプの流量を適宜調整する必要があります。現在のプロトコルを他のモデルシステムやチップ設計に適合させると、流量を最適化する必要があります。あるいは、培地を連続的にフラッシュするのではなく、チップ35上の培地を定期的に変更することができる。このようなセットアップは、マウスのソミトジェネシスにおけるシグナル伝達振動の制御にも適用することができる(未発表、データは示さず)。さらに、組織培養物が直接流体の流れにさらされるのではなく、薬物が隣接するチャネルからの拡散によって組織に到達するというセットアップも想定され得る。このようなシステムは、ESC分化のin vitroモデルに成長因子の勾配を適用するために首尾よく使用されている14,36。
マイクロ流体実験の大きな課題の1つは、実験中にチップ上で気泡が発生することです。チップまたはチューブ内の気泡は、チップ上の均一な液体の流れを妨げ、その場所から胚培養物を除去することにつながる可能性がある。気泡の存在を防ぐためには、プロトコルの様々なステップが不可欠である。まず、シリンジ内の培養液およびマイクロ流体チップ自体を、デシケーターを用いて脱気しなければならない(ステップ3.1.3)。第2に、サンプルをローディングインレットにロードするときは、サンプルと一緒にチップに空気を配管しないように注意する必要があります(ステップ3.2.3)。第三に、チューブに媒体を充填するときは、チップを取り付ける前にすべての気泡を汲み出す必要があります(ステップ3.3.2)。さもなければ、これらの気泡は実験中にメインチップに押し込まれます。最後に、実験の間、培地は、半透チューブのために画像化チャンバまたはインキュベーター内で平衡化される。チューブの透過性はまた、媒体の蒸発を可能にするので、チューブ内の新しい気泡の形成を防ぐために、実験中に湿度が調節されていることを確認してください。
一般に、マイクロフルイディクスは、研究者の特定の質問に適応できる非常に汎用性の高いツールです。現在の設計アプローチでは、チップあたり最大 12 個のex vivo 培養物を並列にイメージングできます。この数は、主に実験ごとの胚の数と、各胚培養物を十分な解像度で画像化するのにかかる時間によって制限されます。1回の実験で複数の条件を比較する必要がある場合は、1枚のスライドガラスに複数のチップを取り付けることができます。複数の組織外植体を並行してイメージングするのに理想的なチップ設計が提供されていますが、パーソナライズされた設計により、サンプル数の制限を克服して高スループット分析を可能にし、1回の実験でより多くの条件の組み合わせを増やすことができます16,17。マイクロフルイディクスはチップ上で培養できるモデルに限定されており、オンチップ培養はモデルシステムごとに個別に最適化する必要があります27,37,38。
過去5〜10年間、マイクロフルイディクスは、ハイスループットアプローチの可能性とシグナル伝達ダイナミクスとグラジエントの微妙な変調のために、さまざまな生物学的問題に対処するために適用されてきました。今日、マイクロフルイディクスは、実験室が容易に確立できる、簡単に適用でき、安価で汎用性の高いツールとなっています。ここで、現在のプロトコルは、特定のアプリケーション、すなわち、ソミトジェネシスを支配するシグナル伝達ダイナミクスを研究するために最適化される。組織生物学における個々の研究課題に合うようにこのプロトコルと設計を適応させるのは簡単です。

発達は、シグナル伝達経路を介した細胞間通信によって制御される。組織の複雑な形成と空間と時間における適切な細胞分化を調整するシグナル伝達経路の数は限られています。この多数のプロセスを調節するために、信号経路のダイナミクス、信号の周波数や持続時間などの経時的な経路の変化に情報をエンコードすることができます1,2。
ソミトジェネシスの間、ソミティック組織は、プレソミティック中胚葉(PSM)3から周期的にセグメント化される。PSMは、Wnt、線維芽細胞増殖因子(FGF)、およびレチノイン酸シグナル伝達の勾配によって空間的に組織化されている。WntおよびFGFシグナルが低い判定前部のPSMでは、細胞はソマイトへの分化のためにプライミングされる。分化は、転写活性化の波がこの決定前線に達すると起こる。PSM内では、Wnt、FGF、およびNotchシグナル伝達が振動する。隣接する細胞はわずかに位相がずれて振動し、その結果、Wnt、FGF、およびNotch経路の下流に振動転写活性化の波が後部から前部PSMに移動する。マウス胚では、転写波が約2時間ごとに決定前線に到達し、ソマイト形成を開始する。シグナル伝達経路を摂動または活性化することによってソミトジェネシスを研究することは、これらの経路の重要性を説明することができる4,5,6,7,8,9。しかし、細胞行動の制御におけるシグナル伝達ダイナミクスの機能を調べるためには、シグナル伝達経路を恒久的に活性化または阻害するのではなく、微妙に調節することが不可欠である。
セグメント化マウス胚内のシグナル伝達経路活性を時間的に調節するために、Sonnenらはマイクロ流体システム10を開発した。このシステムは、生物学的試料11を含むチップのマイクロチャネル内の流体の流れの厳密な制御を可能にする。PSMの適切なセグメンテーションのためのシグナル伝達ダイナミクスの重要性を研究するために、このマイクロ流体セットアップは、 エクスビボでマウスセグメンテーションクロックのシグナル伝達ダイナミクスを調節するために利用される。経路活性化剤または阻害剤を培養チャンバ内に順次パルスすることにより、Wnt、FGF、およびNotchシグナル伝達のダイナミクスの外部制御が達成される10。例えば、個々の経路の周期や複数の振動シグナル伝達経路間の位相関係を修正することができる。動的シグナル伝達レポーターの付随するリアルタイムイメージングを用いて、分化およびソマイト形成に対する経路自体に対する同伴の影響を分析することができる。シグナル伝達ダイナミクスに対するこのレベルの制御を用いて、ソミトジェネシス中のWntシグナル伝達経路とノッチシグナル伝達経路の間の位相関係の重要性が強調された10。
パーソナライズされたチップ設計により、安定した勾配形成12,13,14,15、拍動の活性化/阻害10,16,17,18、局在摂動など、局所環境内の時空間摂動のための多数のオプションが可能になります19,20.マイクロフルイディクスはまた、実験処理の自動化により、より再現性の高い読み出しとより高いスループットを可能にすることができます21,22,23。現在のプロトコルは、マイクロフルイディクスと組織内の内因性シグナル伝達振動の同伴をすべての標準的なライフサイエンスラボにもたらすことを意図しています。クリーンルームやソフトリソグラフィー用機器など、チップ生成用の高度な機器がなくても、マイクロ流体チップを製造し、生物学的な問題に対処するために使用することができます。金型は、自由に入手可能なコンピュータ支援設計(CAD)ソフトウェアを使用して設計できます。マイクロ流体チップを生成するための金型は、通常、ポリジメチルシロキサン(PDMS)で構成され、3Dプリンタで印刷することも、印刷会社に注文することもできます。このようにして、マイクロ流体チップは、高価な機器を必要とせずに1日以内に製造することができる24。ここでは、チップ設計が提供され、これを用いて、2次元(2D)エクスビボ培養物25におけるマウスセグメンテーションクロックの同伴のためのモールドを3Dプリンタで印刷することができる。
マイクロフルイディクスによって可能になったオンチップ培養と正確な摂動は、シグナル伝達経路が多細胞挙動を制御する方法の分子メカニズムを解明する上で優れた可能性を秘めています。シグナル伝達ダイナミクスと形態素勾配は、開発中の多くのプロセスに必要です。以前は、実験室では細胞、組織、生物全体をマイクロ流体チップで培養しており、主に2D細胞培養の時空間摂動のためのプロトコルが他の場所で提供されていた12、26、27、28、29。マイクロフルイディクスを適用して多細胞システムの局所環境を調節することで、高スループットと正確な時空間摂動のための新しい視点が開かれます。マイクロ流体学の分野は、現在、発生生物学者にとって非専門的で安価で、容易に適用可能なツールとなっているという点に達しています。
ここで、Notchシグナル阻害剤のパルスへのマウスセグメンテーションクロックの同伴のためのプロトコルが提供される。このような実験は、(1)マイクロ流体チップの生成、(2)チップのチューブおよびコーティングの調製、および(3)マイクロ流体実験自体(図1A)のステップからなる。脊椎動物モデルシステムを含む研究は、責任ある委員会からの事前の倫理的承認を必要とします。

<table><tbody><tr><td>10 mLシリンジ</td><td>ベクトン、ディキンソン、および会社</td><td>300912</td><td></td></tr><tr><td>184 シリコン エラストマー硬化剤</td><td>SYLGARD</td><td>1673921</td><td></td></tr><tr><td>184 シリコン エラストマー PDMS</td><td>シルガード</td><td>1673921</td><td></td></tr><tr><td>3 ml シリンジ</td><td>ベクトン、ディキンソン、および会社</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>粘着テープ</td><td></td><td></td><td>スコッチマジックテープまたは類似のもの</td></tr><tr><td>鈍い先端の鉗子 Bochem 18/10 ステンレス鋼</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>10663341</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清 アルブミン 凍結乾燥 pH~7</td><td>Biowest</td><td>P6154</td><td></td></tr><tr><td>圧縮空気システム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>結晶化皿</td><td>VWR</td><td>10754-7</td><td>滅菌済み</td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース 45%</td><td>シグマ</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>デシケーター</td><td>VWR</td><td>467-0104</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てカップ</td><td>Duni</td><td>173 941</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てフォーク</td><td>ステープル</td><td>511514</td><td></td></tr><tr><td>解剖装置</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>細胞培養技術</td><td>カスタム</td><td>DMEM/F-12、フェノールレッドなし、L-グルタミンなし、グルコース</td></tr><tr><td>なし フィブロネクチン</td><td>シグマ</td><td>F1141-5MG</td><td></td></tr><tr><td>フローフードBioVanguard Greenline</td><td>CleanAir by Baker</td><td>511514</td><td>UV光源用</td></tr><tr><td>ガラススライドNo 1.5H高精度、70x70 mm</td><td>Marienfeld</td><td>107999098</td><td></td></tr><tr><td>HEPESバッファー</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Gibco</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>ライカ SP8 MP</td><td></td></tr><tr><td>針 22G</td><td>ベクトン、ディキンソン、会社</td><td>z412139-100EA</td><td></td></tr><tr><td>オーブン</td><td>VWR</td><td>390-09</td><td></td></tr><tr><td>PBS0</td><td></td><td></td><td></td></tr>ペ<tr><td>ニシリンストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>プラズマオーブンフェムト</td><td>ディーナー電子</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パンチ&オスラッシュ; 1mm</td><td>ユニコア</td><td>WB100073</td><td></td></tr><tr><td>スケール</td><td>ザルトリウス</td><td>エントリス</td><td></td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>WPI</td><td>AL-4000</td><td></td></tr><tr><td>チューブ & オスラッシュ; 1mm</td><td>APT</td><td>AWG24T</td><td></td></tr><tr><td>真空ポンプ</td><td>VWR</td><td>181-0308</td><td></td></tr></tbody></table>

ソミトジェネシスを支配するシグナル伝達振動の機能的調査のためのマイクロフルイディクスアプローチ

A Microfluidics Approach for the Functional Investigation of Signaling Oscillations Governing Somitogenesis

発達中のマウス胚のプレソミティック中胚葉の周期的セグメンテーションは、シグナル伝達経路のネットワークによって制御される。シグナリング振動とグラジエントは、それぞれセグメント形成のタイミングと間隔を制御すると考えられています。関与するシグナル伝達経路は過去数十年にわたって広範囲に研究されてきたが、スミトジェネシスの制御におけるシグナル伝達振動の機能に関する直接的な証拠は欠けている。シグナリングダイナミクスの機能的調査を可能にするために、マイクロフルイディクスは、これらのダイナミクスの微妙な変調のための以前に確立されたツールです。このマイクロフルイディクスベースの同伴アプローチにより、内因性シグナル伝達振動は経路変調器のパルスによって同期される。これにより、例えば、振動周期や2つの振動経路間の位相関係の変調が可能になります。さらに、経路モジュレーターの空間的勾配を組織に沿って確立して、シグナル伝達勾配の特定の変化がソミトジェネシスにどのように影響するかを研究することができる。
現在のプロトコルは、マイクロ流体工学の初めての使用者のためのマイクロ流体アプローチを確立するのを助けることを意図している。マイクロ流体システムのセットアップに必要な基本原理と機器を説明し、チップ生成用の金型を3Dプリンタで簡便に作製できるチップ設計を提供します。最後に、マイクロ流体チップ上で初代マウス組織を培養する方法、および経路変調器の外部パルスにシグナル伝達振動を同伴させる方法が議論される。
このマイクロ流体系はまた、他の文脈 における シグナル伝達ダイナミクスおよび形態原体勾配の機能的調査のために、ガストルロイドおよびオルガノイドなどの他のイン ビボおよびインビトロ モデル系を保有するように適合させることもできる。

このプロトコルを用いて、マイクロフルイディクスを用いてマウスセグメンテーションクロックのシグナリング発振の外部同伴のための方法が提示される。Notchシグナル阻害剤のパルスを印加することにより、独立した胚培養におけるシグナル伝達振動が互いに同期する10。このシステムを適用してセグメンテーションクロックの機能を研究するための前提条件は、シグナリングダイナミクスとセグメンテーションがまだオンチップに存在することです。WntおよびNotchシグナル伝達ダイナミクスの両方が、一定の培地流にもかかわらず維持され、物理的境界形成が末梢2D培養において持続し、前部PSM10を表すことが以前に示された。
外部薬物パルスへのシグナル伝達振動の同伴を確認するために、例えば、黄色蛍光タンパク質Venusを発現するNotchシグナル伝達レポーターLuVeLu5のリアルタイムイメージングが、マイクロ流体実験中に行われる。チップ上の2D培養物の向きを制御することは困難であるため、前部組織におけるシグナル伝達振動が解析される。2D培養の周辺を再現性よく検出することができる。オンチップの組織切片の向きは自由に制御することができず、チップの内面全体がフィブロネクチンでコーティングされます。したがって、培養物がチップの側面または天井に付着することが時折起こる。サンプルが視野外(x、y、z方向)に移動する場合、またはテールの後端が下を向いて付着する場合、一般にこれらのサンプルは除外されます。
さらなる分析のために、そのような同伴実験の複数が組み合わされる。独立した実験は、色素カスケードブルーによって可視化された薬物パルスのタイミングを約400nmで使用して、互いに整列させることができる。同期を解析して視覚化するには、定量化された振動のトレンドを下げて(図2B、D)、平均として表示し、振動の標準偏差または位相を計算することができます。これにより、独立した後胚培養物の振動同士および外用薬剤パルスとの間の位相関係の解析が可能になる(図2C、E)。PythonベースのプログラムpyBOAT33は、このようなシグナリング振動の周期、位相、振幅を決定するための簡単でユーザーフレンドリーなツールです。同伴を確認するために、例えば、内因性シグナル伝達振動の周期を決定することができる。周期が130分のパルスを印加すると、Notchシグナリング振動も130分の周期を示します(図2F)10。さらに、カスケードブルーパルスを使用して、異なるシグナリングレポーターによる独立した実験を互いに整列させることができます。このようにして、複数のシグナリングレポーターの振動間の位相関係を間接的に決定することができます10。
したがって、提示されたマイクロ流体系は、発達中のマウス胚のエクスビボ培養におけるシグナル伝達振動の制御を可能にする。セグメント形成と分化のためのマーカーのイメージングと組み合わせて、このシステムは、セグメンテーションクロックのシグナル伝達経路がどのように相互作用し、それらがソマイト形成をどのように制御するかを解剖するために適用することができるようになった。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62318/62318fig01.jpg"> 図1:マイクロフルイディクスプロトコルの概略概要(A)チップモールドは、コンピュータ支援設計(CAD)ソフトウェアを使用して設計できます。マウスセミトジェネシスのエクスビボモデルにおいてシグナル伝達振動を同伴するチップ設計が提供される。金型は、例えば、3D印刷によって生成することも、注文することもできます。マイクロ流体チップは、PDMSの成形によって製造される。硬化したPDMSチップを切り出し、プラズマオーブンを用いてスライドガラスに共有結合で接着する。チップ内のガラス表面はフィブロネクチンでコーティングされ、解剖された組織が付着することを可能にする。胚組織は、ローディングインレットを介してチップにロードされ、その後閉じられる。異なる媒体条件のポンプがチップの入口に取り付けられ、フロープログラムが初期化されます。組織は、実験中に共焦点顕微鏡を用いて画像化することができる。(Kymographs adapted from Sonnen et al., 201810.クリエイティブ・コモンズ表示CC BY-NC-ND 4.0に従ってセルから転載および修正されました。(b)マウス後胚組織のオンチップ培養のための鋳型設計の模式図。マイクロ流体チャネルの高さは500μmであり、後胚性マウス尾部の培養に十分である。この金型を印刷するファイルは補足ファイル 1 に提供され、代替ファイルは補足ファイル 2 に示されています。(C) PDMSピラーで囲まれたE10.5断面マウステールの明視野画像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62318/62318fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62318/62318fig02.jpg"> 図2:マイクロ流体実験からの代表的な結果。シグナル伝達経路モジュレーターのパルスは、マウス胚のエクスビボ培養に適用され、シグナル伝達振動は、動的シグナル伝達レポーター(例えば、Notchシグナル伝達レポーターLuVeLu5およびWntシグナル伝達レポーターAxin2T2A10)のリアルタイムイメージングによって視覚化され得る。破線は、時間の経過に伴う解析に使用される領域を示します。(B-F)LuVeLuレポーター振動は、Notchシグナル阻害剤DAPTの周期パルスによって同伴される。(B、D)DAPTまたはDMSO制御を用いた巻き込み時の前方PSMにおけるNotchシグナル伝達振動の定量化。(C,E)ノッチ信号発振の位相と外部DAPT/DMSOパルスのタイミングとの間の位相-位相関係プロット。同伴の場合、安定した位相関係が確立される。(F)DMSOおよびDAPTパルスで同伴されたサンプルを比較するレポーター振動の平均周期およびSEMの定量化。(Sonnenet al.、201810から適応された図。Creative Commons Attribution CC BY-NC-ND 4.0に従ってセルから転載および修正されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62318/62318fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>問題</td>
			<td>推奨される解決策</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">PDMSはガラスに接着しません。</td>
			<td>- PDMSとガラスの両方がきれいであることを確認してください。</td>
		</tr>
<tr>
<td>- チャンバーの周りに接着するのに十分なPDMSがあることを確認してください。</td>
		</tr>
<tr>
<td>- プラズマオーブンの設定を最適化します。</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">私のチップに気泡があります。</td>
			<td>- ポンプがオンになっているかどうかを確認してください。</td>
		</tr>
<tr>
<td>- チップに組織をロードする前にチップを脱気してください。</td>
		</tr>
<tr>
<td>・実験開始前に培地を脱気する。</td>
		</tr>
<tr>
<td>- インキュベーションチャンバ内の湿度が十分に高いことを確認してください。</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">組織は実験の開始時に死ぬ。</td>
			<td>- チップのロードと組み立て時にHEPESを媒体に追加してください。</td>
		</tr>
<tr>
<td>- ローディング中に組織を頻繁に出し入れしないでください。</td>
		</tr>
<tr>
<td>- 流量が高すぎないことを確認してください。</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">組織はイメージング中に死ぬ。</td>
			<td>- イメージングから光毒性がないことを確認してください</td>
		</tr>
<tr>
<td>- 汚染がないことを確認してください。</td>
		</tr>
<tr>
<td>- 流量は高すぎないようにしてください。</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">イメージング中にフォーカスが変わります。</td>
			<td>- イメージング中にオートフォーカスを使用して、イメージングスライドのドリフトを調整します。</td>
		</tr>
<tr>
<td>- チップを顕微鏡内の温度に少なくとも30分間平衡化させます。</td>
		</tr>
<tr>
<td>アウトレット/インレットがデタッチされます。</td>
			<td>- すべてのチューブを底まで完全に押し下げます。</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">チップのガラスが割れます。</td>
			<td>- より注意してください、ガラスは非常に壊れやすいです。</td>
		</tr>
<tr>
<td>- 薄いガラスは、イメージングにのみ必要です。撮像を行わない場合は、通常のより厚いスライドガラスを使用することができる。</td>
		</tr>
<tr>
<td>- ブレークがチップの外側にある場合は、問題ない可能性があります。チップへのガラスシールが破れてしまうと液体が漏れて空気が入ってきます。</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">チップに汚染があります。</td>
			<td>- 培養液に抗生物質を加える。</td>
		</tr>
<tr>
<td>-すべての機器とチューブを滅菌します。</td>
		</tr>
<tr>
<td>- 迅速かつクリーンに動作します。</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:トラブルシューティング
補足ファイル1: 3Dプリンタで金型を印刷するためのSTLファイル。この鋳型は、後胚組織のオンチップ培養用のマイクロ流体チップを生成するために使用される( 図1に示す設計)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62318/Supp-file-1.stl" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル2: 3Dプリンタでモールドを印刷するためのSTLファイルは、後胚組織のオンチップ培養用のマイクロ流体チップを生成する。 補足ファイル 1および 図1に示す設計とは対照的に、この設計には、少量の空気がメインマイクロ流体チャンバに入るのを防ぐために、すべての入口にバブルトラップが含まれています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62318/Supp-file-2.stl" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル3: チップを顕微鏡に配置するためのホルダーを生成するための設計ファイル。このホルダーは96ウェルプレートの寸法を持ち、ほとんどの顕微鏡の標準ホルダーに収まるはずです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62318/Supp-file-3.dwg" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

マイクロ流体チップ上のマウス胚組織の培養および操作のためのプロトコールが提供される。経路変調器のパルスを印加することにより、このシステムは、マウスのソミトジェネシスの機能的調査のためのシグナル伝達振動を外部的に制御するために使用することができる。

Periodic segmentation of the presomitic mesoderm of a developing mouse embryo is controlled by a network of signaling pathways. Signaling oscillations and ...

多細胞系を制御するシグナル伝達経路は動的である。これらのダイナミクスの機能を理解するためには、全体的なシグナリング活動に影響を与えることなく、これらのダイナミクスを微妙に調節できることが不可欠です。このプロトコルは、マウス胚の発生におけるシグナル伝達振動の機能的解剖を可能にするマイクロ流体システムを使用する。シグナル伝達ダイナミクスは、成体組織を含む多くの組織で見出されている。マイクロフルイディクスは、細胞、組織、オルガノイド培養を含む多くのモデルシステムに合わせて適応できる汎用性の高いツールです。まず、モノマーと触媒を9対1の比率で混合して必要量のPDMSを調製し、重合を誘導する。使い捨てのツールを使用し、混合が適切に達成されていることを確認してください。PDMS混合物をデシケーターに入れ、約30分間真空をかけて空気を除去します。チップモールドに約3~5mmのPDMS層を流し込み、約30分間デシケーターに戻します。金型の材質に応じて、65°C以下のオーブンに一晩入れて金型を硬化させます。メスを使って型からチップを切り取ります。パンチ入口および出口孔は、マイクロ流体チャンバの内側から始まる1ミリメートルの生検パンチを有する。スライドガラスを圧縮空気で拭きます。チップをスライドガラスに接着するには、チップとスライドガラスをプラズマオーブンに入れ、接着する側面を上に向けて配置します。使用機械に固有のプロトコルを使用してプラズマを生成し、活性化された表面を互いに配置し、均等に圧力を加えることによって、チップをガラスに接着する。実験用のチューブとチップを準備するには、チューブを45度の角度で切断し、各チューブに1本の針を取り付けます。針、チップ、プラグの入ったチューブを皿に入れ、紫外線に約15分間さらして滅菌します。チップをフィブロネクチンでコーティングするには、室温で1%ペニシリンまたはストレプトマイシンを加えたPBSを含むビーカーにチップを置きます。チップをPBSでフラッシュし、P200ピペットで空気を除去します。チップの各チャンバーに3ミリリットルのシリンジを装填する。フィブロネクチンを含むシリンジに針を取り付け、シリンジをシリンジポンプに接続します。チューブを手動でフラッシュして空気を除去します。コンセントチューブをチップのコンセントに取り付けます。チューブを底部まで押し込み、チップをコーティングするために低流量を設定してください。シリンジポンプを少なくとも2時間または一晩稼働させます。終了したら、ポンプを停止し、針の直後にチューブを切断します。実験用培地を充填したシリンジを用意し、PBS内で培養液とチップの両方を脱気する。チップから気泡の大部分を洗い流すか吸い上げてから、ポンプにシリンジを取り付け、シリンジに入口チューブを取り付けてください。チップに組織をロードするには、尾の最も後部の先端を解剖します。25マイクロモルのHEPESを含む培養培地でチップをフラッシュし、PBSを除去した。P200ピペットを使用して組織をチップにロードします。各組織ローディングステップの後、PDMS充填チューブ片を使用して対応する組織ローディング入口を閉じます。マイクロ流体セットアップを組み立てるには、内部に気泡を入れずにチューブをマイクロ流体チップに取り付けます。これを行うには、チューブの端に培地の滴が存在することを確認してください。すべてのチューブがチップに取り付けられたら、ビーカーから取り出してウェットティッシュを入れた皿に入れます。皿と約1.5メートルの入口チューブを一晩培養するためのインキュベーターに入れます。培養中の気泡の形成を防ぐために高湿度を確保してください。あるいは、チップの外側を乾燥させて顕微鏡ホルダーに入れ、ホルダーと約1.5メートルの入口チューブを倒立顕微鏡のインキュベーションチャンバー内に入れて、ライブイメージング実験を行います。少なくとも 20 分間の一定の流量の後、実験用に計画されたポンプを開始します。セグメンテーションマウス胚にノッチシグナル伝達を同伴させるには、100分間培地および30分間の薬物パルスのポンピングプログラムを実験終了まで、典型的には24時間繰り返す。リアルタイム イメージングの場合は、少なくとも 30 分後にイメージングを開始します。シグナル伝達振動の同伴を確認するために、薬物パルスのタイミングを用いて複数の実験を整列させ、カスケードブルー色素で可視化する。定量化された振動はトレンドを下げて平均として表示し、振動の標準偏差または位相を計算することができます。独立した後胚培養物の互いに振動し、外部薬剤パルスに対する振動間の位相関係を解析することができる。同伴を確認するために、例えば、PythonベースのプログラムpyBOATを使用して、内因性シグナリング振動の周期を決定することができる。130分の周期でパルスを印加する場合、ノッチシグナリング振動も130分の周期を示す。マイクロ流体実験中の液体の蒸発を防ぐことが重要です。さもなければ、気泡がチップ内に形成され、媒体の流れを妨害する。これを防ぐには、培地とチップを脱気し、インキュベーター内の湿度が十分に高いことを確認してください。この方法を使用して、シグナル伝達ダイナミクスを調節し、その効果を蛍光レポーターのリアルタイムイメージング、免疫染色、またはin situハイブリダイゼーションによって分析することができる。さらに、組織は、さらなる分析のためにチップから抽出することもできる。この方法を使用して、胚発生におけるシグナル伝達振動の機能を研究することができます。マウス胚のセグメンテーションに対する2つの振動シグナル伝達経路間の位相シフトの重要性を実証するために適用した。より一般的には、多細胞系における動的シグナル伝達符号化のメカニズムを解剖するために使用することができるようになった。

a-microfluidics-approach-for-functional-investigation-signaling

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