ソミトジェネシスを支配するシグナル伝達振動の機能的調査のためのマイクロフルイディクスアプローチ

多細胞系を制御するシグナル伝達経路は動的である。これらのダイナミクスの機能を理解するためには、全体的なシグナリング活動に影響を与えることなく、これらのダイナミクスを微妙に調節できることが不可欠です。このプロトコルは、マウス胚の発生におけるシグナル伝達振動の機能的解剖を可能にするマイクロ流体システムを使用する。

シグナル伝達ダイナミクスは、成体組織を含む多くの組織で見出されている。マイクロフルイディクスは、細胞、組織、オルガノイド培養を含む多くのモデルシステムに合わせて適応できる汎用性の高いツールです。まず、モノマーと触媒を9対1の比率で混合して必要量のPDMSを調製し、重合を誘導する。

使い捨てのツールを使用し、混合が適切に達成されていることを確認してください。PDMS混合物をデシケーターに入れ、約30分間真空をかけて空気を除去します。チップモールドに約3~5mmのPDMS層を流し込み、約30分間デシケーターに戻します。

金型の材質に応じて、65°C以下のオーブンに一晩入れて金型を硬化させます。メスを使って型からチップを切り取ります。パンチ入口および出口孔は、マイクロ流体チャンバの内側から始まる1ミリメートルの生検パンチを有する。

スライドガラスを圧縮空気で拭きます。チップをスライドガラスに接着するには、チップとスライドガラスをプラズマオーブンに入れ、接着する側面を上に向けて配置します。使用機械に固有のプロトコルを使用してプラズマを生成し、活性化された表面を互いに配置し、均等に圧力を加えることによって、チップをガラスに接着する。

実験用のチューブとチップを準備するには、チューブを45度の角度で切断し、各チューブに1本の針を取り付けます。針、チップ、プラグの入ったチューブを皿に入れ、紫外線に約15分間さらして滅菌します。チップをフィブロネクチンでコーティングするには、室温で1%ペニシリンまたはストレプトマイシンを加えたPBSを含むビーカーにチップを置きます。

チップをPBSでフラッシュし、P200ピペットで空気を除去します。チップの各チャンバーに3ミリリットルのシリンジを装填する。フィブロネクチンを含むシリンジに針を取り付け、シリンジをシリンジポンプに接続します。

チューブを手動でフラッシュして空気を除去します。コンセントチューブをチップのコンセントに取り付けます。チューブを底部まで押し込み、チップをコーティングするために低流量を設定してください。

シリンジポンプを少なくとも2時間または一晩稼働させます。終了したら、ポンプを停止し、針の直後にチューブを切断します。実験用培地を充填したシリンジを用意し、PBS内で培養液とチップの両方を脱気する。

チップから気泡の大部分を洗い流すか吸い上げてから、ポンプにシリンジを取り付け、シリンジに入口チューブを取り付けてください。チップに組織をロードするには、尾の最も後部の先端を解剖します。25マイクロモルのHEPESを含む培養培地でチップをフラッシュし、PBSを除去した。

P200ピペットを使用して組織をチップにロードします。各組織ローディングステップの後、PDMS充填チューブ片を使用して対応する組織ローディング入口を閉じます。マイクロ流体セットアップを組み立てるには、内部に気泡を入れずにチューブをマイクロ流体チップに取り付けます。

これを行うには、チューブの端に培地の滴が存在することを確認してください。すべてのチューブがチップに取り付けられたら、ビーカーから取り出してウェットティッシュを入れた皿に入れます。皿と約1.5メートルの入口チューブを一晩培養するためのインキュベーターに入れます。

培養中の気泡の形成を防ぐために高湿度を確保してください。あるいは、チップの外側を乾燥させて顕微鏡ホルダーに入れ、ホルダーと約1.5メートルの入口チューブを倒立顕微鏡のインキュベーションチャンバー内に入れて、ライブイメージング実験を行います。少なくとも 20 分間の一定の流量の後、実験用に計画されたポンプを開始します。

セグメンテーションマウス胚にノッチシグナル伝達を同伴させるには、100分間培地および30分間の薬物パルスのポンピングプログラムを実験終了まで、典型的には24時間繰り返す。リアルタイム イメージングの場合は、少なくとも 30 分後にイメージングを開始します。シグナル伝達振動の同伴を確認するために、薬物パルスのタイミングを用いて複数の実験を整列させ、カスケードブルー色素で可視化する。

定量化された振動はトレンドを下げて平均として表示し、振動の標準偏差または位相を計算することができます。独立した後胚培養物の互いに振動し、外部薬剤パルスに対する振動間の位相関係を解析することができる。同伴を確認するために、例えば、PythonベースのプログラムpyBOATを使用して、内因性シグナリング振動の周期を決定することができる。

130分の周期でパルスを印加する場合、ノッチシグナリング振動も130分の周期を示す。マイクロ流体実験中の液体の蒸発を防ぐことが重要です。さもなければ、気泡がチップ内に形成され、媒体の流れを妨害する。

これを防ぐには、培地とチップを脱気し、インキュベーター内の湿度が十分に高いことを確認してください。この方法を使用して、シグナル伝達ダイナミクスを調節し、その効果を蛍光レポーターのリアルタイムイメージング、免疫染色、またはin situハイブリダイゼーションによって分析することができる。さらに、組織は、さらなる分析のためにチップから抽出することもできる。

この方法を使用して、胚発生におけるシグナル伝達振動の機能を研究することができます。マウス胚のセグメンテーションに対する2つの振動シグナル伝達経路間の位相シフトの重要性を実証するために適用した。より一般的には、多細胞系における動的シグナル伝達符号化のメカニズムを解剖するために使用することができるようになった。