支持浮遊ブロックを用いた透過電子顕微鏡におけるサンプル支持膜の作製
April 8th, 2021
この方法の構造決定ワークフローにおいて、クライオ電子顕微鏡(cryo-EM)のサンプル調製は重要なボトルネックとなっている。ここでは、透過EM試験用サンプルを安定化させる支持膜の作製に使いやすい3次元印刷ブロックを用いた詳細な方法を提供する。
ここでは、このような繊細なフィルムの取り扱いを容易にする新しい浮揚ブロックを使用して、サポートフィルムでクライオEMサンプルを調製するための改良されたプロトコルを紹介します。この方法の主な利点は、変性のような有害な影響が発生する空気水界面からサンプルが保護されていることです。ここで示すプロトコルの1つは、グラフ化親水性をレンダリングするための高価な処理を避けるため、EMコミュニティ全体へのアクセス性を高めます。
小さな浮遊装置は、良好な準備のために電気顕微鏡でまだ広く使用されていません。したがって、これらの視覚的なデモンストレーションは、その使用のためのベンチマークを提供することができます。まず、TEMグリッドを二重蒸留水と酢酸エセルで洗浄し、続いてプラズマ洗浄を行います。
次に、サンプルの10〜12マイクロリットルを緩衝液交換ウェルに加え、浮遊ブロックと2%小便尿酢酸溶液の10〜12マイクロリットルを隣接する非緩衝液交換ウェルに加えて、負の染色のために十分に交換する。汚れで作業する際には、適切な安全対策を講じる必要があります。慎重に上に事前堆積カーボンフィルムとマイカの2つの小片をカット。
マイカの破片は、炭素が浮遊している間に断片が井戸の上に座ることができ、ピンセットで断片を処理するのに十分なスペースがあるように、井戸の長さよりも井戸に収まるほど広いことを確認してください。マイカがウェルのランプに座り、液体サンプルの表面でカーボン層が観察されるまで、ほぼ45度の角度でマイカを井戸に浸します。サンプルでカーボンをインキュベートした後、マイカシートを非常にゆっくりと引き出して、カーボンフィルムを回収し、残存粘度試料保持を最小限に抑えます。
下段の非炭素表面を濾紙でタップしてマイカを慎重にブロットし、過剰な液体を除去し、マイカフラグメントを2%小便尿酢酸溶液を含む反対側ウェルに浸し、炭素層を負の汚れと交換する。洗浄され、プラズマ洗浄EMグリッドの聖なる炭素被覆側で浮遊炭素層を回収します。その後、TEM上でイメージングするまでグリッドを空気乾燥したままにし、好ましくは空中汚染を避けるためにそれらを覆います。
先に示したようにTEMグリッドを洗浄した後、使用直前に酸化グラフェン懸濁液を調製し、渦を徹底的に行ってください。その後、4つの非緩衝液交換井戸に10〜12マイクロリットルの酸化グラフェン懸濁液を加える。浮揚ブロックに沿って。
ブロックの残りの4つの緩衝液交換井戸に10〜12マイクロリットルの二重蒸留水または超純水を加えます。各ウェルのグラフェン酸化物懸濁液に4つのグリッドを穏やかに落とし、1分間インキュベートして、聖なる炭素被覆側が溶液に接触していることを確認します。1分後、ピンセットを各非バッファ交換のピンセット溝に滑り込まして、各グリッドを慎重に回収します。
水滴がグリッドに見えるまで、隣接する井戸の二重蒸留水で各グリッドの銅非炭素被覆側を穏やかに簡単に微調整します。その後、慎重にフィルター用紙の一部に対してグリッド水のドロップを逆さまに保持します。グリッドを覆い、ピンセットに入れて空気を乾かします。
ガラススライドに堆積した銅グラフシートの上に4つの洗浄グリッドを配置し、各グリッドをイソプロパノールの滴で覆い、単層グラフェンとグリッドの間に親密な接触を可能にします。イソプロパノールの完全な蒸発後、ガラスペトリ皿の塩化第二鉄溶液にグリッドを持つ銅グラフェンシートを浮かべます。その後、空気中の汚染を避けるために皿を覆い、一晩室温でエッチングにしておきます。
TEMグリッドサイズよりも大きな直径のループを使用して、グラフェン単層に浮かぶグリッドを釣り上げ、洗浄用の二重蒸留水を含むガラスペトリ皿に慎重に移します。グリッドを水で2回洗い、サンプル調製と凍結が完了するまでサンプルバッファーを含むペトリ皿にグリッドを移します。浮遊ブロックのウェルにサンプルの10〜12マイクロリットルを加えます。
サンプルがブロックで準備ができたら、きれいなピンセットのペアを使用してバッファ溶液からグラフェンコーティングされたグリッドを選び、それをよく含むサンプルの表面に置きます。適切なインキュベーション期間の後、きれいな凍結ピンセットでグリッドを拾い、ブロッティングとガラス化を進めます。支持浮揚ブロックで調製された負の染色されたグリッドは、典型的には、グリッド表面全体にわたってアモルファスカーボンで覆われる。
炭素膜の破損は、いくつかの例では発生するが、グリッドの正方形の多数は、手付かずであるため、負の染色目的に適用されます。同様に、良好なフィルムカバレッジは、グラフェン酸化物プロトコルを使用してグリッド全体にわたって日常的に達成されます。酸化グラフェングリッドは原料から迅速に調製することができ、サンプルの保護が高い。
グラフェンを凍結直前に濡れ、サンプル塗布をその場で維持することは、クライオEMに適した氷層を生成するのに十分です。このプロトコルは、グラフェン親水性をレンダリングする機器を必要とせず、サンプル回収の利点を提供します。支持浮揚ブロックは、グリセロール勾配から派生したサンプルのために非常に有用であるC2でバッファ拡張を可能にする各ウェルの部位に2つの針ポートを有する。
浮遊ブロックは、小容量の制御可能な緩衝液流と機能化された支持膜を利用して、グリッドアフィニティー精製法の探索を可能にした。
概要
この記事では、新しいフロテーションブロックを使用したクライオ電子顕微鏡法（cryo-EM）サンプルの調製のための改良されたプロトコルを紹介します。この方法は、サンプルを空気-水界面からの損傷から保護し、EMコミュニティにとってのアクセス性を向上させます。
主要な研究構成要素
科学分野
- クライオ電子顕微鏡法
- サンプル調製技術
- 構造生物学
背景
- サンプル調製はクライオEMワークフローのボトルネックです。
- サポートフィルムは繊細なサンプルを安定させるために重要です。
- 現在の方法は高価で複雑になる可能性があります。
- 新しいフロテーションブロックはプロセスを簡素化できます。
研究目的
- クライオEMサンプル調製のためのアクセス可能なプロトコルを提供すること。
- サポートフィルムの取り扱いにおけるフロテーションブロックの使用を示すこと。
- サンプルの安定性を向上させ、変性リスクを減少させること。
使用された方法
- TEMグリッドの洗浄とプラズマ洗浄。
- サンプルとネガティブ染色の適用のためのフロテーションブロックの使用。
- サンプル保護の強化のためのグラフェンオキシドの組み込み。
- 調製中のグリッドの慎重な取り扱いと移動。
主な結果
- 変性の減少によるサンプル安定性の向上。
- クライオEMのためのグラフェンオキシドの成功的な適用。
- サンプル調製におけるフロテーションブロックの有効性の実証。
- プロトコルはアクセス可能で、高価な処理を必要としません。
結論
- フロテーションブロック法はクライオEMサンプル調製を向上させます。
- プロトコルはEMコミュニティにより広く採用できます。
- 改良された方法はサンプルのより良い構造分析を促進します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Efficient and reproducible sample preparation for cryo-EM is critical for structural biology pipelines, yet remains a bottleneck due to sample fragility and contamination risks. The support flotation block enables streamlined transfer of delicate support films, reducing manual handling and preserving sample integrity for high-resolution imaging. This innovation enhances predictive confidence in early discovery and supports robust portfolio progression by minimizing artifacts and sample loss.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables reliable interrogation of macromolecular structure by protecting samples from air-water interface denaturation.
- Supports functional target validation by maintaining native conformations during grid preparation.
- Reduces mechanistic ambiguity by minimizing sample damage and contamination.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated EM grids for downstream structural screening workflows.
- Improves reproducibility and standardization of support film application across batches.
- Enables rapid, scalable preparation of grids with amorphous carbon, graphene, or graphene oxide supports.
Translational & Preclinical Research
- Preserves sample integrity for translational studies requiring high-fidelity structural data.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling robust imaging of challenging samples.
- Mitigates risk of false negatives due to sample denaturation or contamination.
Pipeline & Workflow Integration
The flotation block method integrates at the sample preparation stage, bridging early discovery and lead identification with preclinical imaging workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling high-quality structural data acquisition.
- Screening: Delivers reproducible, contamination-minimized grids for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative, high-integrity imaging outputs for comparative analysis.
- Translational Research: Maintains sample fidelity for downstream biomarker or mechanistic studies.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, reusable protocol adaptable to various support films and sample types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces structural ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines workflows, reduces manual steps, and minimizes contamination risk.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by improving data quality and reproducibility.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by reducing sample loss and preparation failures.
Implementation Considerations
- Requires expertise in EM grid handling and support film transfer.
- Needs access to flotation block, plasma cleaning, and standard EM preparation infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducible results across projects.
- Adaptable to carbon, graphene, and graphene oxide supports as demonstrated.
- Potential limitations include occasional film breakage and need for careful contamination control.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:47
Preparation of Negatively Stained Samples with Amorphous Carbon Support
2:21
Preparation of Graphene Oxide-coated TEM Grids
3:27
Preparation of Samples on Monolayer-graphene Films Using the Flotation Block
4:44
Results: Examples of Sample Support Films Prepared Using the Floatation Block
5:34
Conclusion
