Name: 遺伝子およびタンパク質発現解析のためのマウス肩甲間褐色脂肪組織からの褐色脂肪細胞の単離(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: 学ぶマウス肩甲間褐色脂肪組織からの褐色脂肪細胞単離法。酵素消化とヨーデキサノール密度勾配遠心により高純度細胞を取得し、UCP1やPDGFAの遺伝子発現およびタンパク質解析を正確に行う手法です。

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Z. Linは、国立衛生研究所HL138454-01とフリーメーソン医学研究所の資金によって支援されました。

すべてのマウスは病原体のない状態で維持され、すべての手順はフリーメーソン医学研究施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。UCP1::Cre9 およびRosa 26tdTomatoes マウス系統13 が以前に報告された。すべてのマウスを12時間の明暗サイクルで室温に保ちました。
1.溶液と褐色脂肪組織(BAT)の準備
<ol><li>消化液と分離液を15 mL遠沈管で調製します。</li>
	<li>10 mLのBAT消化溶液:10 mLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に、3.5 mg / mLのディスパーゼII、1 mg / mLのコラゲナーゼII、および10 mM CaCl2 を加えてBAT消化溶液を作ります。</li>
	<li>10 mLの12%ヨージキサノール溶液(分離溶液):1 mLの10x PBS、2 mLの60%ヨージキサノール、0.01 mLの1 M MgCl 2、0.025 mLの1 M KCl、0.1 mLの0.2 Mエチレンジアミン四酢酸(EDTA)および6.865 mLのddH2 Oを混合して、12%のヨージキサノールを得る。</li>
	<li>1匹の成体マウスをCO2 過剰摂取で安楽死させる。簡単に説明すると、マウスケージを1分当たり10〜30%ケージ容積の変位率で100%CO2 で満たす。 5分後、目に見えて呼吸がないことを確認して死亡を確認する。</li>
	<li>動物を解剖し、肩甲骨間BATを収集します。実体顕微鏡でWATと筋肉層を取り除きます。</li>
	<li>十分な消化を行うには、各BATローブを~3 mm3 の部分にカットし、金属攪拌子と5 mL消化溶液を入れた清潔な50 mLフラスコに入れます。消化を開始する前に、BATと消化バッファーを含むフラスコを氷上に1時間置きます。 注:次の手順では、褐色脂肪細胞の分離に約80 mg BATを使用しました。</li>
</ol>2. BAの分離手順
<ol><li>インキュベーターに封入されたマグネチックスターラーにフラスコを置きます。攪拌速度をそれぞれ60rpmに、インキュベーターの温度を35°Cに設定する。消化は約30分間続きます。消化中にBATスライスがスターラーバーの周りに塊を形成する場合は、1 mLピペットチップを使用して凝集組織を破壊します。</li>
	<li>清潔な50 mL遠心チューブの上に70 μmのストレーナーフィルターを置きます。約4 mLの細胞懸濁液をストレーナーに通してピペットで入れます。4 mLの12%ヨージキサノール溶液でストレーナーを洗浄します。ピペットを上下に動かして、細胞とヨージキサノール溶液を混合します。細胞混合物を2本の透明な5 mLポリスチレン試験管に移します。 注:消化の終わりには、消化溶液は濁っているはずで、十分な消化を示しています。毎回新鮮な消化液を使用してください。調製したら、消化溶液は2時間以内に使用する必要があります。</li>
	<li>消化が十分でない場合は、手順2.2と2.3をもう一度繰り返します。</li>
	<li>分離溶液とBAが入った透明なポリスチレンチューブを氷上に1時間放置します。BAは上部にレイヤーを形成します。</li>
	<li>顕微鏡検査のために20 μLの単離されたBAを取り出します。</li>
</ol>3. BAからのRNAおよびタンパク質の単離
<ol><li>BA層を2本の1.7 mLマイクロ遠心チューブにピペットで入れ、RNAとタンパク質を分離します。BAs層を乱すことなく、過剰なヨージキサノール溶液を慎重に除去します。</li>
	<li>1 mLのトリゾールを加えて、RNA、DNA、タンパク質を同時に細胞溶液に分離します。細胞を溶解するのに十分に混合する。</li>
	<li>200 μLのクロロホルムを加えて相を分離します。</li>
	<li>チューブを9,981 x g 、4°Cで10分間遠心分離します。</li>
	<li>遠心分離後、RNA単離には水相を使用します。本研究では、逆転写には全RNAを用い、リアルタイムPCRを用いて定量RT-PCRを実施した。プライマー配列は 材料表に記載されています。</li>
	<li>300 μLの有機相を2 mLの微量遠心チューブに移します。</li>
	<li>有機相に、2.5容量の100%エタノールとボルテックスを10秒間加えます。</li>
	<li>200 μLの1-ブロモ-3-クロロプロパンを加え、10秒間ボルテックスします。</li>
	<li>600μLの二重蒸留水とボルテックスを10秒間加えます。</li>
	<li>混合溶液を室温で10分間放置する。</li>
	<li>9,981 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 このステップで、フェーズが分離されます。タンパク質相は中間層に局在する。</li>
	<li>一番上の水溶液を取り除きます。残りの溶液に1 mLの100%エタノールを加えます。</li>
	<li>10分間遠心分離、9,981 x g、4°C。 遠心分離後、タンパク質ペレットが形成されます。上澄み液を捨てる。</li>
	<li>ペレットを1mLの100%エタノールで洗浄する。</li>
	<li>10分間遠心分離、9981 x g、4°C。 ペレットを保存し、上清を廃棄する。</li>
	<li>ペレットを室温で10分間風乾します。</li>
	<li>ウェットペレットの重量を測定します。20 μL/mgペレットの比率で1%SDS溶液を追加します。</li>
	<li>チューブを加熱シェーカーに入れてペレットを溶解します。温度を55°C、速度を11 x gに設定します。タンパク質ペレットを完全に溶解するのに通常5〜10分かかります。 注:溶解タンパク質の濃度は、BCAアッセイ14によって測定することができる。</li>
</ol>

<ol><li>Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical%2C+physiological%2C+and+functional+diversity+of+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue.</a> Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).</li>
<li>Symonds, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue+growth+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Scientifica%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue growth and development.</a> Scientifica. 2013, Cairo. 305763(2013).</li>
<li>Giralt, M., Villarroya, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((White%2C+brown%2C+beige%2Fbrite%3A+Different+adipose+cells+for+different+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">White, brown, beige/brite: Different adipose cells for different functions.</a> Endocrinology. 154, 2992-3000 (2013).</li>
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<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13, 133-140 (2010).</li>
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<li>Chey, S., Claus, C., Liebert, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+simultaneous+isolation+of+proteins+and+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Improved method for simultaneous isolation of proteins and nucleic acids.</a> Analytical Biochemistry. 411, 164-166 (2011).</li>
<li>Ford, T., Graham, J., Rickwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iodixanol%3A+A+nonionic+iso-osmotic+centrifugation+medium+for+the+formation+of+self-generated+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Iodixanol: A nonionic iso-osmotic centrifugation medium for the formation of self-generated gradients.</a> Analytical Biochemistry. 220, 360-366 (1994).</li>
<li>Kovacovicova, K., Vinciguerra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+senescent+cells+by+iodixanol+%28OptiPrep%29+density+gradient-based+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Proliferation%22%5BJournal%5D)">Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation.</a> Cell Proliferation. 52, 12674(2019).</li>
<li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((versatile+manufacturing+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+at+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale.</a> Human Gene Therapy. 21, 1259-1271 (2010).</li>
<li>Marin, R. D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RELi+protocol%3A+Optimization+for+protein+extraction+from+white%2C+brown%2C+and+beige+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues.</a> MethodsX. 6, 918-928 (2019).</li>
<li>Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invited+Review%3A+effects+of+heat+and+cold+stress+on+mammalian+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression.</a> Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).</li>
<li>Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+autonomous+myogenic+cell+populations+revealed+by+ablation+of+Myf5-expressing+cells+during+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis.</a> Development. 135, 1597-1604 (2008).</li>
</ol>

本研究では、遺伝子およびタンパク質発現解析のためのBAを単離する新しい方法を開発しました。
公開されているBA分離プロトコルでは、3%BSA溶液を使用してBA12を濃縮しました。それにもかかわらず、この公開されたプロトコルによって達成された濃縮BAは、タンパク質発現分析に直接使用することはできませんでした。これは、BAs溶液に存在する濃縮BSAがフォローアップタンパク質抽出を妨げるためです。3% BSA溶液で濃縮されたBAをTrizol試薬で処理すると、粘着性のあるタンパク質凝集体が形成され、その大部分はGTPCタンパク質抽出プロセスに溶解しませんでした。さらに、GTPCタンパク質抽出産物では、タンパク質の大部分がBSAであった(図3B)。この新しいプロトコルでは、BAを精製するために3%BSA分離溶液を6%ヨージキサノールに置き換えました。6%ヨージキサノール溶液はBAを非BAから効率的に分離し、単離されたBAは形態を維持していました(<strong class="xfig...

マウスとヒトの両方に、白色脂肪組織(WAT)と褐色脂肪組織(BAT)の2種類の脂肪組織があります1。WATは白色脂肪細胞に中性脂肪の形でエネルギーを蓄え、BATの褐色脂肪細胞(BA)は化学エネルギーを熱2として放散します。BAは、その発生起源に基づいて、胚発生中に形成される古典的なBA(cBA)と、ストレス条件下で白色脂肪細胞から変換された白色脂肪細胞由来のBA(ベージュ/ブライト細胞)にさらに分類されます3。BAは多房性であり、熱発生タンパク質脱共役タンパク質1(UCP1)4を発現します。肩甲骨間BAT(iBAT)デポーは、小型哺乳類の主要なcBAデポの1つです5が、ベージュ色の細胞はWAT6内に分散しています。 
エネルギーを散逸させる性質上、BAは肥満を減らすための治療標的として多くの注目を集めています7。肥満の治療を目的としてBAを利用するためには、BAの機能、生存、および動員を制御する分子メカニズムを理解することが不可欠です。BATおよびWATを含む脂肪組織は不均一である。脂肪細胞を除いて、脂肪組織には内皮細胞、間葉系幹細胞、マクロファージなど、他の多くの細胞タイプが含まれています8。UCP1::Creライン9など、マウスBAの候補遺伝子を特異的に枯渇させる遺伝的ツールが利用可能であるが、BATまたはWATからBAを精製する技術は限られており、単一細胞レベルでBAを研究することは困難である。さらに、純粋なBAを取得しないと、BAと非BAの関係が明確に描写されません。例えば、血小板由来成長因子受容体α(PDGFRα)は、未分化間葉系細胞のマーカーとして使用されており、BATの内皮細胞や間質細胞で発現しています。低温ストレスBATでは、PDGFRα陽性前駆細胞が新しいBA10を生じさせる。PDGFRαは、間葉系細胞の成長および増殖を調節する成長因子であるリガンドPDGFによって活性化される11;しかし、BAがPDGFを分泌することによってPDGFRα陽性前駆細胞の挙動に影響を与えるかどうかは不明である。 
最近、蛍光活性化セルソーティング(FACS)12に基づくBAs分離プロトコルが公開されました。このプロトコルでは、3%ウシ血清アルブミン(BSA)溶液を使用してBAを非BAから分離し、濃縮BAをFACSでさらに精製しました。このプロトコルの適用は、機器とFACSの両方の操作経験に依存するFACSプロセスの要件によって制限されます。本研究では、BATからBAを分離するための新しいプロトコルが開発されました。このプロトコルによって単離されたBAは、遺伝子およびタンパク質発現研究に直接使用できます。さらに、この研究のデータは、BAが主要なPDGFリソースであることを示唆しています。

<table><tbody><tr><td>抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗原</td><td>Company</td><td>Catalog</td><td></td></tr><tr><td>PPAR&gamma;</td><td>LSBio</td><td>LS-C368478</td><td></td></tr><tr><td>PDGFRa</td><td>サンタクルーズ</td><td>sc-398206</td><td></td></tr><tr><td>UCP1</td><td>R&Dシステム</td><td>IC6158P</td><td></td></tr><tr><td>Chemical and solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ、タイプII</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>1-ブロモ-3-クロロプロパン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B62404</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)&nbsp;</td><td>Goldbio</td><td>A-421-10</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Bio Basic</td><td>CT1330</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>IBI Scientific</td><td>IB05040</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II, protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5693</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio Basic</td><td>EB0107</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>IBI Scientific</td><td>IB15724</td><td></td></tr><tr><td>LiQuant Universal Green qPCRMaster Mix</td><td>LifeSct</td><td>LS01131905Y</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>Boston BioProducts</td><td>P-855</td><td></td></tr><tr><td>OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix</td><td>ABM</td><td>G454</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep (Iodixanol)</td><td>Cosmo Bio USA</td><td>AXS-1114542</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>Caisson Labs</td><td>PBL07</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td>Caisson Labs</td><td>PBL06</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCAタンパク質アッセイキット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>ボストンバイオプロダクツ</td><td>P-1435</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue safe Stain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>75746</td><td></td></tr><tr><td>Trizol 試薬</td><td>ライフテクノロジー</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Primers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>遺伝子名(種)&nbsp;</td><td>フォワード</td><td>リバース</td><td></td></tr><tr><td>Pdgfra(マウス)</td><td>CTCAGCTGTCTCCTCACAgG</td><td>CAACGCATCTCAGAGAAAAGG</td><td></td></tr><tr><td>pdgfa(マウス)</td><td>TGTGCCCATTCGCGCAGGAAGAG</td><td>TTGGCCACCTTGACACTGCG</td><td></td></tr><tr><td>36B4(マウス)</td>TGCTGAACATCTCCCCCTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCGCCAGGAC <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ucp1</td><td>ACTGCCACACCTCCAGTCATT</td><td>CTTTGCCTCACTCAGGATTGG</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社名</td><td>Application</td><td></td></tr><tr><td>Keyence BZ-X700</td><td>Keyence</td><td>Imaging brown adipocytes</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stirrer</td><td>VWR</td><td>Dissociate BAT</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td><td>Appliedバイオシステム</td><td>定量PCR</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Fc イメージングシステム</td><td>LI-COR</td><td>ウェスタンブロットイメージング</td><td></td></tr></tbody></table>

遺伝子およびタンパク質発現解析のためのマウス肩甲間褐色脂肪組織からの褐色脂肪細胞の単離(英語)

Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis

褐色脂肪組織(BAT)は哺乳類の非震え熱発生に関与しており、褐色脂肪細胞(BA)はBATの機能単位です。BAは多房性脂肪滴と豊富なミトコンドリアの両方を含み、脱共役タンパク質1(UCP1)を発現します。BAは、その起源に基づいて、胚由来の古典的BA(cBA)と白色脂肪細胞由来のBAの2つのサブタイプに分類されます。BAは密度が比較的低いため、従来の遠心分離法ではBATから分離できません。本研究では、遺伝子およびタンパク質発現解析のためにマウスからBAを単離する新しい方法を開発しました。このプロトコルでは、成体マウスの肩甲骨間BATをコラゲナーゼおよびディスパーゼ溶液で消化し、解離したBAを6%ヨージキサノール溶液で濃縮した。次に、単離したBAをTrizol試薬で溶解し、RNA、DNA、およびタンパク質を同時に単離しました。RNA単離後、ライセートの有機相をタンパク質抽出に使用した。私たちのデータは、6%ヨージキサノール溶液がフォローアップ遺伝子およびタンパク質発現研究を妨げることなくBAを効率的に濃縮することを示しました。血小板由来成長因子(PDGF)は、間葉系細胞の増殖および増殖を調節する成長因子である。褐色脂肪組織と比較して、単離されたBAは Pdgfaの発現が有意に高かった。要約すると、この新しい方法は、褐色脂肪細胞の生物学を単一の細胞型レベルで研究するためのプラットフォームを提供します。

褐色脂肪細胞単離のための肩甲間BATの調製 褐色脂肪細胞(BA)の単離プロセスを 図1Aに示します。BATおよび消化/分離溶液の調製から単離されたBAの取得までのプロセス全体には、約4時間かかります。
成体マウスでは、肩甲骨間領域に豊富なBATが存在する。この肩甲骨間BAT(iBAT)は、筋肉層とWATで覆われています(図1B)。消化手順を開始する前に、筋肉層とWATを除去して、きれいなiBATを生成する必要があります(図1C)。公開されているBA分離プロトコルでは、ミンチBATがBA分離12に使用されました。この研究では、3 mm3 サイズのBATを消化すると(図1D)、ミンチBATよりも多くのBAが得られました。
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この研究では、遺伝子およびタンパク質発現解析のためにマウス褐色脂肪細胞を単離する新しい方法について説明します。

Brown adipose tissue (BAT) is responsible for non-shivering thermogenesis in mammals, and brown adipocytes (BAs) are the functional units of BAT. BAs ...

褐色脂肪組織の生物学的側面を調べるためには、精製された褐色脂肪サイズをクリアすることが不可欠です。現在、褐色脂肪サイズの精製は行われておらず、質量が利用可能です。この研究では、この問題に対処するための簡単なプロトコルを開発しました。現在、このプロトコルには1つのスキルが必要です。他の方法よりもはるかに少ない研究材料を必要とし、精製された褐色脂肪サイズは遺伝子およびタンパク質発現分析に直接使用できます。このプロトコルは、古典的な褐色脂肪サイズの生物学を研究するための新しい方法を提供します。また、白色脂肪細胞の褐変過程の研究にも適用することができる。手順を実演するのは、私の研究室の研究助手であるアマンダです。BATと消化溶液を入れたフラスコを、摂氏35度のインキュベーター内で毎分60回転のマグネチックスターラーに30分間置くことから始めます。1ミリリットルのピペットを使用して、スターラーバーの周りのBATスライスの凝集組織塊を破壊します。消化後、清潔な50ミリリットルの遠沈管の上に70マイクロメートルのストレーナーフィルターを置き、ストレーナーを通して約4ミリリットルの細胞懸濁液をピペットで送ります。次に、4ミリリットルの12%ヨージキサノール溶液で洗浄します。ピペットを上下に動かして細胞をヨージキサノール溶液と混合し、細胞混合物を2本の透明な5ミリリットルのポリスチレン試験管に移します。セル混合物を含むポリスチレンチューブを氷上に1時間置き、BAを上部に層を形成します。顕微鏡検査のために20マイクロリットルの分離されたBAを取り出します。RNAとタンパク質を単離するには、BA層を2本の1.7ミリリットルのマイクロセンターフュージチューブにピペットで入れます。次に、BA層を乱すことなく、過剰なヨウ素溶液を慎重に除去します。次に、1ミリリットルのTRIzolを細胞溶液に加え、RNA、DNA、およびタンパク質を同時に分離し、細胞を溶解するのに十分な混合を行います。相を分離するには、200マイクロリットルのクロロホルムと遠心分離機を9, 981 Gで摂氏4度で10分間チューブに加えます。遠心分離後、RNA単離には水相を使用します。300マイクロリットルの有機相を2ミリリットルの微量遠心チューブに移し、750マイクロリットルの100%エタノールを加える。10秒間ボルテックスした後、200マイクロリットルの1-ブロモ-3-クロロプロパンを加え、再び10秒間ボルテックスします。600マイクロリットルの二重蒸留水を加えてから、10秒間ボルテックスします。混合溶液を室温で10分間放置する。遠心分離後、摂氏4度で10分間9, 981 Gを加えます。相は、中間層に局在するタンパク質相と分離されます。一番上の水溶液を取り除き、残りの溶液に1ミリリットルの100%エタノールを加えます。摂氏4度で10分間9, 981 gで遠心分離した後、上清を捨て、ペレットを1ミリリットルの100%エタノールで洗浄します。摂氏4度で10分間9, 981 gで遠心分離します。上澄み液を除去した後、ペレットを室温で10分間風乾し、湿潤ペレットの重量を測定する。ペレット1ミリグラムあたり20マイクロリットルの比率で1%SDS溶液を追加します。チューブを摂氏55度と11Gの加熱シェーカーに5〜10分間入れて、ペレットを完全に溶解します。プロトコルでは、3%BSAを含むPBSを使用してBAをBATから分離しました。単離された細胞はラズベリー型で、内部に多房性脂肪滴があり、tdTom陽性であり、BAであることが確認されました。タンパク質は、改良されたGTPCプロトコルを用いてBAから単離され、次いでSDS-PAGEゲルで検査された。BSAに関連する優勢なバンドがBAサンプルで観察され、タンパク質抽出におけるBSAの干渉を示唆しています。BSA干渉を回避するために、典型的なラズベリー形状を有し、多房性脂肪滴を含むBAの単離に6%ヨージキソナール溶液を使用した。これらのBAから抽出されたタンパク質は、SDS-PAGEゲル中で十分に分離された。これらの細胞はtdTomato陽性であるのに対し、ペレットから回収された細胞はtdTomatoes陰性であり、明らかな脂肪滴はなく、非脂肪細胞からのBAの効率的な分離が示唆された。遺伝子発現解析では、UCP1およびPDGFAのmRNAレベルは、単離されたBAで有意に高かった。しかし、PDGFRAのmRNAはBATでのみ検出されました。UCP1タンパク質は、単離されたBAに富んでいることがわかりました。EDGFRアルファはBATでは検出されましたが、単離されたBAでは検出されませんでした。これらの結果は、BAの単離方法の効率を確認し、単離されたBAが遺伝子およびタンパク質発現研究に適していることを示しています。このプロトコルを試みるときは、新鮮な消化バッファーを使用して褐色脂肪組織を解離し、消化期間中の組織塊の形成を回避します。この新しい方法により、単一細胞タップレベルで褐色脂肪組織の生物学を簡単に調査できます。この方法を応用することで、褐色脂肪細胞遺伝子発現プログラムを精密に解剖した純褐色脂肪細胞を用いたGNおよびタンパク質発現研究を、もともと無脂肪細胞由来のコンタミネーションを心配することなく行うことができる。

isolating-brown-adipocytes-from-murine-interscapular-brown-adipose

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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マウス腹腔内脂肪貯蔵所からの脂肪形成性および線維炎症性間質細胞亜集団の単離

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組織解離剤を用いたマウス白色脂肪組織からの間質血管画分の半自動単離(英語)

ここでは、マウスの鎖骨上褐色脂肪組織の組織学的および遺伝子発現解析を解剖および実行するための実用的な手順を提供します。...

マウス鎖骨上褐色脂肪組織の解剖、組織学的処理、遺伝子発現解析

本論文では、特定のリガンドへの白血球の走化性応答を決定し、生細胞イメージング技術を用いて細胞表面の受容体と細胞質のタンパク質間の相互作用を識別するための方法論を説明します。...

ロイコトリエンBのリアルタイムイメージング 4介在細胞の移行とβ-アレスチンとBLT1の相互作用

学ぶマウス肩甲間褐色脂肪組織からの褐色脂肪細胞単離法。酵素消化とヨーデキサノール密度勾配遠心により高純度細胞を取得し、UCP1やPDGFAの遺伝子発現およびタンパク質解析を正確に行う手法です。

遺伝子およびタンパク質発現解析のためのマウス肩甲間褐色脂肪組織からの褐色脂肪細胞の単離(英語)

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