Name: 次世代シーケンシングのための磁気ビーズベースの蚊DNA抽出プロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: 学ぶ磁気ビーズベースのDNA抽出法で、Aedes aegypti個体から高品質なDNAを抽出し、次世代シーケンシングを実現します。高価な自動機器不要で、リソースが限られた研究室でも利用可能です。

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我々は、米国が資金を提供する太平洋南西部地域ベクター媒介性疾患優秀センターからの資金援助を認める。 疾病管理予防センター(協同協定1U01CK000516)、CDC助成金NU50CK000420-04-04、USDA国立食品農業研究所(ハッチプロジェクト1025565)、UF/IFASフロリダ医学昆虫学研究所フェローシップ、Tse-Yuチェン、NSF CAMTech IUCRCフェーズII(AWD05009_MOD0030)、フロリダ州保健省(COJJJ)この記事の調査結果と結論は著者のものであり、必ずしも米国魚類野生生物局の見解を表すものではありません。

1. DNA抽出前の一般的なサンプル貯蔵および調製物
<ol><li>サンプルを>70%アルコールに保存して組織を軟化させる場合は、4°Cで1時間(または一晩)の100μL PCRグレードの水でサンプルを水和します。</li>
</ol>2. サンプルの中断
<ol><li>56°Cでインキュベーターまたは振度熱ブロックをセットします。</li>
	<li>プロテナーゼK(PK)バッファー/酵素ミックスを作ります。プロテインナーゼK(100mg/mL)2 μL、プロテナーゼKバッファー98 μL(合計100 μL)が個々の蚊の抽出に必要です。複数の標本のマスターミックスを準備するには、(すべての個々の標本のために合わせた)合計量を〜15%増加させ、十分な容積の入手可能性を確保します。</li>
	<li>抽出前にサンプルを水和した場合は、各サンプルチューブから水を捨てます。</li>
	<li>蚊のティッシュを含んでいる1.5 mLのマイクロ遠心分離管に、PKバッファー/酵素の混合物の100 μLを加える。</li>
	<li>マイクロ遠心分離チューブの害虫を使用して組織を均質化します。</li>
	<li>室温で9,600 x g で1分間サンプルを遠心分離します。</li>
	<li>56°Cで2〜3時間のサンプルをインキュベートする。</li>
	<li>インキュベーション中に、DNA抽出工程(ステップ3)を用いて他の試薬を調製する。</li>
</ol>3. DNA抽出
<ol><li>磁気ビーズマスターミックスを作ります。各サンプルに100 μLのリシスバッファー、100 μLのイソプロパノール、15 μL の磁気ビーズ(合計 215 μL)を混ぜます。複数の反応のためのマスターミックスを準備するには、(すべての個々の標本のために組み合わせた)合計量を〜20%増加させ、十分な量の可用性を確保します。</li>
	<li>インキュベーション時間(ステップ2.7)後、ピペットを使用して各ライセートをクリーンマイクロ遠心チューブまたはマイクロプレートウェルに移します。</li>
	<li>各サンプルに100 μLのリセートと215 μLの磁気ビーズマスターミックスを加えます。</li>
	<li>ピペットを使って10~20sをよく混ぜ、室温で10分間放置します。時折チューブを軽く振って、磁気ビーズとDNAの結合を最大限に引き出します。</li>
	<li>マグネットビーズのセパレータにチューブ/プレートを置き、溶液がはっきりするまで待ちます。</li>
	<li>ピペットを使用してチューブ/プレートから液体を捨てます。上清を取り除くときは、DNAを保持している磁気ビーズに触れたり邪魔したりしないようにしてください。</li>
	<li>チューブ/プレートを磁気ビーズ分離器から離し、各ウェルに325 μLの洗浄バッファー1を追加します。</li>
	<li>ピペットで十分に混ぜ、室温で1分間インキュベートします。</li>
	<li>手順 3.5 ~ 3.6 を繰り返します。</li>
	<li>チューブ/プレートを磁気ビーズ分離器から離し、250 μLの洗浄バッファー 1 を各ウェルに追加します。</li>
	<li>ピペットで十分に混ぜ、室温で1分間インキュベートします。</li>
	<li>手順 3.5 ~ 3.6 を繰り返します。</li>
	<li>チューブ/プレートを磁気ビーズ分離器から離し、各サンプルに250 μLの洗浄バッファー2を加えます。</li>
	<li>十分に混ぜ合わせ、室温で1分間インキュベートします。</li>
	<li>手順 3.5 ~ 3.6 を繰り返します。</li>
	<li>チューブ/プレートを磁気ビーズ分離器から離し、250 μLの洗浄バッファー 2 を各ウェルに追加します。</li>
	<li>十分に混ぜ合わせ、室温で1分間インキュベートします。</li>
	<li>手順 3.5 ~ 3.6 を繰り返します。</li>
	<li>チューブ/プレートを磁気ビーズ分離器から離し、溶出バッファーを各ウェルに 100 μL 追加します。</li>
	<li>十分に混ぜ合わせ、室温で2分間インキュベートします。</li>
	<li>マグネットビーズのセパレータ上でチューブ/プレートを上に移動し、溶液がはっきりするまで待ちます。</li>
	<li>新しいクリーンな0.5マイクロ遠心チューブまたはマイクロプレートウェルに上清をピペット。</li>
	<li>DNAサンプルは4°C(最大1週間)または-80°Cで保存してください。 マイクロプレートを使用している場合は、パラフィルムで覆います。</li>
	<li>任意の適切な方法を使用してDNAの収量を決定します。 注:本研究では、260/280 nmのDNAフルオロメーターの読み取りと吸光度が利用されました。</li>
</ol>

<ol><li>Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+extraction+protocol+for+improved+DNA+yield+from+individual+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes.</a> F1000Research. 4, 1314(2015).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+divergence+among+invasive+populations+of+Aedes+aegypti+in+California%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California.</a> BMC Genomics. 20 (1), 204(2019).</li>
<li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundance+of+conserved+CRISPR-Cas9+target+sites+within+the+highly+polymorphic+genomes+of+Anopheles+and+Aedes+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes.</a> Nature Communications. 11 (1), 1425(2020).</li>
<li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcontinental+dispersal+of+Anopheles+gambiae+occurred+from+West+African+origin+via+serial+founder+events%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events.</a> Communications Biology. 2, 473(2019).</li>
<li>Norris, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+introgression+in+an+African+malaria+mosquito+coincident+with+the+increased+usage+of+insecticide-treated+bed+nets%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).</li>
<li>Main, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+basis+of+host+preference+and+resting+behavior+in+the+major+african+malaria+vector%2C+Anopheles+arabiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis.</a> Plos Genetics. 12 (9), 1006303(2016).</li>
<li>Yamasaki, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+tools+for+genomic+DNA+library+construction+of+small+insects%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Improved tools for genomic DNA library construction of small insects.</a> F1000Research. 5, 211(2016).</li>
<li>Tabuloc, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+of+Tuta+absoluta+genome+to+develop+SNP+genotyping+assays+for+species+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pest+Science%22%5BJournal%5D)">Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification.</a> Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).</li>
<li>Campos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+mitogenome+sequence+of+Anopheles+coustani+from+S%C3%A3o+Tom%C3%A9+island%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrial+DNA.+Part+B%2C+Resources%22%5BJournal%5D)">Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from São Tomé island.</a> Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).</li>
<li>Cornel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+mitogenome+sequences+of+Aedes+%28Howardina%29+busckii+and+Aedes+%28Ochlerotatus%29+taeniorhynchus+from+the+Caribbean+Island+of+Saba%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrial+DNA.+Part+B%2C+Resources%22%5BJournal%5D)">Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba.</a> Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).</li>
<li>Lucena-Aguilar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+source+selection+for+downstream+applications+based+on+dna+quality+indicators+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreservation+and+Biobanking%22%5BJournal%5D)">DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis.</a> Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここで説明するプロトコルは、他の昆虫種に適合させることができる。Niemanら 1 で導入されたプロトコルの元のバージョンは、Aedes aegypti、 Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, アノフェレス・アラビエンシス, アン・コルッツィー, アン・クスタニ、アン・ダーリンリ、アン・ファネスタス、アン・ガンビア、アン・クアドリアヌラトゥス、アン・ルフィペス、キュレックス・ピピエンス、Cx.クインケファシアトゥス、Cx.フェイレリ、ショウジョウバエ・スズキイ、クリソドラ・アエネコリス・トゥタ・アルソルタ、カイフェリア・リコパこのプロトコルは、これらだけでなく、他の節足動物のために動作することが期待されます。
理想的に...

改良されたDNA抽出プロトコル1の最近の開発は、全ゲノムシーケンシング2、3、4、5、6を含む多くの影響の大きい下流の研究を可能にしました。この磁気ビーズベースのDNA抽出プロトコルは、個々の蚊のサンプルからの信頼性の高いDNA収量を提供し、フィールドコレクションから十分な数のサンプルを取得することに関連するコストと時間を削減します。
近年の人口や景観のゲノミクスの進歩は、全ゲノムシーケンシングのコスト削減と直接相関しています。以前のDNA抽出プロトコル1 は、高スループットシーケンシングに関連する効率を高めますが、資金のない小規模なラボ/研究は、プロトコルを実装するためのコスト(例えば、特殊な機器のコスト)のために、これらの新しい強力な景観と人口ゲノミクスツールの使用をオプトアウトする可能性があります。
ここでは、Neiman et al. 1と同様の磁気ビーズ抽出ステップを使用 して高純度DNAを得るが、組織のリシスおよびDNA抽出のための高コストの器具に依存しない改変DNA抽出プロトコルが提示される。このプロトコルは、高品質DNAの>10 ngを必要とする実験に適しています。

<table><tbody><tr><td>AEバッファー</td><td>Qiagen</td><td>19077</td><td>溶出バッファー</td></tr><tr><td>ALバッファー</td><td>Qiagen</td><td>19075</td><td>溶解バッファー</td></tr><tr><td>AW1 バッファー</td><td>Qiagen</td><td>19081</td><td>洗浄バッファー</td></tr><tr><td>1 AW2 バッファー</td><td>Qiagen</td><td>19072</td><td>洗浄バッファー 2</td></tr><tr><td>MagAttract 懸濁液 G</td><td>Qiagen</td><td>1026901</td><td>磁気</td></tr><tr><td>ビーズ マグネティックビーズセパレーター</td><td>Epigentek</td><td>Q10002-1</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000</td><td>微量分光光度計</td></tr><tr><td>PK バッファー</td><td>ThermoFisher</td><td>4489111</td><td>プロテイナーゼ K</td></tr><tr>バッファー<td>Proteinase K</td><td>ThermoFisher</td><td>A25561</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Qubit Invitrogen</td><td>Q33238</td><td>蛍光光度計</td></tr></tbody></table>

次世代シーケンシングのための磁気ビーズベースの蚊dna抽出プロトコル

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

磁気ビーズと自動DNA抽出装置を用いた最近発表されたDNA抽出プロトコルは、下流の全ゲノムシーケンシングに十分な保存状態の良い個々の蚊から高品質および量のDNAを抽出することが可能であることを示唆した。しかし、高価な自動DNA抽出装置への依存は、多くの研究所にとって非常に困難な場合があります。ここでは、低スループットから中程度のスループットに適した予算に優しい磁気ビーズベースのDNA抽出プロトコルを提供します。ここで説明するプロトコルは、個々の Aedes aegypti 蚊サンプルを使用して正常にテストされました。高品質のDNA抽出に伴うコストの削減により、リソース制限のあるラボや研究に高スループットシーケンシングを適用できます。

蚊頭/胸郭組織あたりのDNA収量の平均は、100 μLの溶出バッファーを使用して溶出した場合のフルオロメーターを用いて測定した4.121 ng/μL(N = 92、標準偏差3.513)であった。全ゲノムライブラリ構築1,7に必要な10〜30ngゲノムDNA入力要件に対して十分である。DNAの量は、蚊の体の大きさと保存条件に応じて0.3〜29.7 ng/μLの間で変化する可能性があります。ばらつきの高い部分は、研究で使用される磁気ビーズの特性によるものです。磁気ビーズの異なるブランドは、前のレポート1に示すように、より一貫した濃度を生成する可能性があります。また、蚊種の大きさが異なり、DNAの収量はそれらの個体および種のサイズ範囲に依存していることも留意すべきである。DNA濃度が典型的な範囲を下回る場合、タンパク質化K反応(ステップ2.7)でインキュベーション期間を調整してもよいが、この延長は16時間以下でなければならない。さらに、プロテイナーゼKおよび/またはリシスバッファ...

ここで説明するDNA抽出プロトコルは、蚊から高品質のDNA抽出を生成するために磁気ビーズを使用する。これらの抽出は、下流の次世代シーケンシングアプローチに適しています。

次世代シーケンシングのための磁気ビーズベースの蚊DNA抽出プロトコル

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...

この予算に優しい磁気ビーズベースのDNA抽出プロトコルは、リソース制限のあるラボや研究にアクセスできる高スループットシーケンシングを可能にします。このプロトコルは、高品質のDNA抽出のために高価な機器を必要とせず、高スループットシーケンシングのための品質で十分な量のDNAを得ることが困難である特定の診断または研究状況で有用であり得る。このプロトコルは、1 回限りのデモで簡単に複製できます。ワークフローを理解するには、まず少数のサンプルを試してください。まず、70%以上のアルコールに貯蔵された蚊組織サンプルを水分補給するには、100マイクロリットルのPCRグレードの水を加え、4°Cで1時間インキュベートして組織を軟化させます。インキュベーション後、水を捨て、100マイクロリットルのプロテアーゼKバッファー酵素ミックスを加えます。次に、マイクロ遠心分離チューブの害虫を使用して、組織を均質化します。均質化後、組織を遠心分離し、摂氏56度で2〜3時間インキュベートする。DNAを抽出するために、100マイクロリットルの組織が新しいクリーンマイクロ遠心チューブにリゼートします。次に、磁気ビーズマスターミックスの215マイクロリットルを追加します。ピペットを使用して、ライセートと磁気ビーズ混合物を10〜20秒間混ぜ、室温で10分間放置します。インキュベーション中に、時折チューブを軽く振って、DNAと磁気ビーズの結合を最大限に引き出します。次に、溶液が明らかになるまで、マグネットビードセパレータの上にチューブを置きます。次にピペットを用いて、DNAを保持する磁気ビーズを邪魔することなく、チューブから液体を穏やかに吸引する。チューブを磁気ビーズ分離器から離し、325マイクロリットルの洗浄バッファー1を加えてビーズを洗います。ピペットで十分に混ぜ、室温で1分間インキュベートします。インキュベーションの後、チューブを磁気ビーズ分離器に置き、前述のように上清を取り除き、チューブを磁気ビーズ分離器から離し、洗浄バッファー1でビーズを1回洗います。2回目の洗浄後、バッファー1で2回目の洗浄を行い、250マイクロリットルの洗浄バッファー2を同様にして2回洗浄する。最後の洗浄後、チューブを磁気ビーズ分離器から離し、溶出バッファーを100マイクロリットル加えます。ピペットで十分に混ぜ合わせ、室温でチューブを2分間インキュベートしてから磁気セパレータに戻します。溶液が明らかになったら、上清を新しい0.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに移し、適切に保管します。0.5ミリモルEDTAを含む溶出緩衝液中の蚊DNAの典型的なマイクロ体積フルオメーターの読み取りとしてここに示す。平均260~280ナノメートルの吸光度比は2.3です。次の表に、さまざまな抽出方法について、1 営業日に処理されたサンプルのコストと数を示します。このプロトコルによる抽出のための典型的な試薬および消耗品のコストは、サンプルあたり約9.50です。このコストは、一般的な磁気ビーズベースの抽出方法と同等です。このプロトコルの主なコストメリットは、自動DNA抽出装置を必要としないことです。複数のサンプルを使用する場合は、必ずサンプル間でピペットチップを変更して、DNAのクロスコンタミネーションを防ぎます。全ゲノムシーケンシングに、この方法で抽出した高品質のDNAを用いています。現在、シーケンシングデータを使用して、公衆衛生および疾病管理における昆虫剤耐性または免疫遺伝子の新しい突然変異を同定しています。高スループットシーケンシングのための手頃な価格のソリューションを持つことは、多くの新しい遺伝的制御戦略の成功に影響を与える蚊の分散と遺伝子の流れを理解することを目的とした集団ゲノミクスと景観ゲノミクスのためのエキサイティングな扉を開きます。

a-magnetic-bead-based-mosquito-dna-extraction-protocol-for-next

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