Name: μTongue:生体内舌用マイクロ流体ベースの機能イメージングプラットフォーム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: 学ぶマイクロ流体統合型μTongueシステムを用いた生体内味細胞機能イメージング法。マウスを用いて生理的環境下で味細胞の応答を可視化し、細胞間コミュニケーションを解析する実験プロトコルです。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、韓国政府(MSIT)が出資する韓国国立研究財団(NRF)補助金(2019M3A9E2061789)、韓国政府(MSIT)が資金を提供する韓国国立研究財団(NRF)助成金(2019M3552223A11)によって支援されました。キム・ウンスーとユージン・リーの技術支援に感謝しています。

すべての外科的処置は、成均館大学及びソウル大学校の施設動物の世話及び使用委員会(IACUC)によって承認された。
1. ソリューションの調製: 人工唾液とタストタント
<ol><li>2 mM NaClを溶解して人工唾液を調製し、 5 mM NaHCO3,3mM KHCO 3,0.25 mM CaCl2,0.25mM MgCl2,0.12mM K2HPO,0.12mM KH2PO4,および1.8 mM HClを蒸留水(>1 L)に調整し、溶液のpHを7(1L)に調整する。 </li>
	<li>酸味などのタスタントを準備します: 10 mM クエン酸;塩辛い:400 mM NaCl、必要に応じて50 μMアミロライド。甘い:40 mMアセスルファムK;苦い:5 mMキニン、5 mMデナトニウムおよび20 μMシクロヘキシミドの混合物を、ステップ1.1で調製した人工唾液中に試飲薬を溶解させることによって。</li>
</ol>2. マイクロ流体システムの調製
注: タストタントは、加圧マルチチャンネル流体送達システムを使用してマウス舌に送達されました( 図1 および 材料表を参照)。
<ol><li>加圧流灌流システムの貯留層を人工唾液とタスタントで満たします。</li>
	<li>圧縮空気ラインをレギュレータ入力に接続し、流体送達システムで30~50 psiの間で空気圧を設定します。</li>
	<li>レギュレータの出力圧力を0.4 psiに設定し、この圧力の下でチューブから液体が出ているかどうかを確認します。</li>
	<li>貯留層からμTongueの入力ポートにマニホールドを接続します。</li>
	<li>μTongueの出力ポートをシリンジポンプに接続し、液体を~300 μL∙min-1で引き出して定常状態を確立します。μTongueの下に吊り下げ液滴の一定の体積を観察します。サンプルの高さに応じて設定パラメータの値を調整します。</li>
	<li>圧縮空気ラインを外し、プロトコルステップ3が完了するまでシリンジポンプを停止します。</li>
</ol>3.インビボイメージング用のマウスの準備 (図 2)。
注:すべての動物の製剤は、実験室のワークベンチで無菌条件下で昼間に行われました。
<ol><li>マウス麻酔<ol>
<li>どちらかのセックスの7週齢または古いマウスを準備します。味細胞内のカルシウム感知蛍光タンパク質を発現する遺伝子組み換えマウスラインを使用します。</li>
		<li>マウスは麻酔のために拘束されています。100 mg/kg ケタミンと 10 mg/kg キシラジンの混合物をマウス13に腹腔内注射する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>2.5%W/Vリン酸緩衝液生理食塩液中のTRITC-デキストラン(500kDa)は、画像化セッション中に血液循環を観察するために、レトロ軌道経路を介してマウスに静脈内投与される。</li>
	<li>マウスの頭蓋骨にヘッドフィクサーを取り付けて、動きのアーティファクトを最小限に抑えます。<ol>
<li>マウスヘッドは、マウスが、supineの位置に配置されている間、70%ETOHを噴霧されます。頭の皮を鉗子で軽く持ち上げ、はさみで約7mm2 を切り取ります。</li>
		<li>頭皮の周りの髪をきれいにし、皮膚の下の骨膜を取り除き、頭蓋骨に瞬間的な接着剤を塗布し、カスタマイズされたヘッドフィクサーを取り付けます。</li>
		<li>瞬間接着剤が硬化した後、ヘッドフィクサーの周りに歯科用接着剤を塗布し、歯の接着剤を固めるために青色光で点灯します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>μTongueの底部にマウス舌を置きます。<ol>
<li>マウスの下唇を瞬時に接着剤でμTongueの底部に取り付けます。</li>
		<li>ボード上にマウスを置き( 図1Bのマウス準備ボード)、μTongueの底部ユニットをポストに置きます( 図1BのμTongueホールドポスト)。下部のユニットの端にある穴が、ポストに揃えられていることを確認します。</li>
		<li>ボードのヘッドフィクサーホルダーにマウスヘッドフィクサーを締めます。次に、マウスヘッドとデバイスの間の距離を調整します。ヘッドフィクサーホルダーを使用して、マウスヘッドを約45°スムーズに回転させます。このプロセスは顕微鏡目的とマウスの鼻の物理的接触を防ぐ。</li>
		<li>プラスチック製のピンセットを使用してマウスの舌を優しく描き、舌の腹側をμTongueの底部の上側に取り付けます。次に、濡れた綿棒でマウス舌の表面を拭きます。</li>
		<li>人工唾液に紙を浸し、濡れた状態を維持するためにマウス舌の露出した表面に置きます。</li>
		<li>μTongueの底部の両端を保持するポストに湾曲したワッシャーを置きます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>顕微鏡のステージにマウスの準備を置きます。露出したマウス舌を顕微鏡目的領域の近似中心の下に置きます。ステージのダイナミックレンジから逸脱しないように注意してください。次に、ステージ上のマウスボードをねじで締めます。</li>
	<li>マウス本体の下に加熱パッドを置き、温度を36.5°C-37.5 °Cに保ちます。 温度センサーでマウスの体温を監視し、温度センサからのフィードバック信号を使用して加熱パッドの温度を制御します。</li>
	<li>薄い紙をひねってマウスの口に置き、液体がマウスの気管に入るのを防ぎます。</li>
	<li>マウスの舌から濡れた組織を取り出し、準備したμTongueをマウスの舌の上に置きます。舌にマイクロ流体チャネルを置き、その位置を調整して、画像窓から舌の表面を観察します。</li>
	<li>最小の圧縮圧力で両端を軽くねじ込んでμTongueを固定します。</li>
</ol>4. イメージング取得
<ol><li>920 nmの2光子レーザーと顕微鏡を使用前にオンにします。</li>
	<li>水浸物目的(16x、NA 0.80または25x、NA 1.1)を顕微鏡に取り付けます。μTongueのイメージングウィンドウに蒸留水を落とし、目的を浸します。</li>
	<li>カメラモードでは、水銀ランプを使用してライトを点灯し、舌の表面を照らします。</li>
	<li>Z軸を調整することで、フィリフォーム乳頭から自己蛍光信号を検索し、近似焦点面を見つけます。次に、XとYの調整ノブを使用して、味覚芽を見つけます。</li>
	<li>マルチフォトンモードに切り替えます。次のように画像取得条件を設定します: 励振波長: 920 nm;エミッションフィルタセット:447/60 nm、525/50 nm、および607/70 nm;双方向ラスタースキャンモード、フレームサイズ:512 x 512。</li>
	<li>X と Y の位置を調整して、イメージ ウィンドウの中央に味覚芽を配置します。</li>
	<li>味覚芽の約3分の2の高さで味覚芽を囲む血管を検索します。プロトコルステップ3.2からのTRITC-デキストラン(500 kDa)注入によって血液循環を視覚化する。血流が詰まっている場合は、固定ネジを少し緩めて血流を可能にします。</li>
	<li>Z軸を調整し、味覚細胞の十分な数を含む味覚芽のZ平面を見つけます。</li>
	<li>80 sの2-6 Hzでカルシウムイメージングを進めます。イメージング開始後に流体システムの貯留槽をオンにして20sの味液を提供する。味覚刺激の20のsの後、人工唾液に戻って貯水池を切り替えます。</li>
	<li>シーケンシャルイメージングが終了した後、次のイメージングセッションまで3~4分ほど待ちます。人工唾液をマウス舌に流し、前のイメージングセッションからタスタントのリマントを洗い流します。実験の設計に応じて、必要に応じてセッションを繰り返します。</li>
	<li>インビボカルシウムイメージングが完了したら、IACUC手順に従ってマウスを安楽死させる。麻酔下のマウスはCO2チャンバーで屠殺される。 メモ:つま先ピンチ反射を使用して麻酔の深さを確認してください。イメージングセッション中に、貯留層からの人工唾液を一貫して提供する必要があります。μTongueのイメージングウィンドウに気泡が現れた場合は、強い液体圧力を使用してμTongueの入力または出力を通して泡を取り除きます。</li>
</ol>5. 画像解析 (図 3)
<ol><li>画像変換<ol>
<li>フィジー14 または同様の画像解析ソフトウェアを使用して、生の画像ファイルを開きます。</li>
		<li>NPL バド アナライザコードを使用するには、イメージ ファイルを RGB スタック ファイルに変換します。<ol>
<li>画像>カラー>分割チャンネル</li>
			<li>
[イメージ>カラー>[チャンネルをマージ]を クリックし、ステップ 5.2.1 からイメージを選択します。</li>
			<li>画像>カラー > スタックから RGB</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>画像登録 注: データ分析には、カスタム記述されたコードを使用します。https://github.com/neurophotonic/Tastebud-analyzer を参照してください。<ol>
<li>Taste_GUI.mという名前のコードを実行します。NPL バド アナライザという名前の GUI ウィンドウがポップアップ表示されます。右上隅の[新規解析]ボタンをクリックし、ステップ5.1から変換された画像をロードします。ロードされたイメージの上のフレーム レートを設定します。</li>
		<li>登録のために、ロードされたイメージの上に関心領域(ROI)を描画します。選択したROIをダブルクリックすると、自動計算された登録が開始されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>相対的な蛍光強度変化を求める(ΔF/F)<ol>
<li>ステップ 5.2 から登録されたイメージを自動的に表示するには 、NPL バド アナライザ ウィンドウに戻ります。ユーザーがすでに reg ファイルを持っている場合は、[データのロード] ボタンをクリックして 、_reg.tif ファイルを選択します。</li>
		<li>CIRCLEまたはポリゴンボタンをクリックし、味覚芽の画像の上に味の細胞のROIを配置します。</li>
		<li>これは、味覚芽像の下で自動的に選択された味覚細胞の生蛍光強度とカルシウムトレース(ΔF/F)を示す。</li>
		<li>「トレースを保存」をクリックして、GUI の右側にカルシウムトレース (ΔF/F)を表示し、ROI は味覚芽のイメージの上に表示されます。ROI の選択が完了するまで、ステップ 5.3.2 から 5.3.4 を繰り返します。 注: ROI が誤って選択されている場合は、[ トレースの削除 ]ボタンをクリックして、最後に選択した ROI およびカルシウム トレースを削除します。</li>
		<li>ROI の選択が完了したら、右下隅にファイル名を書き込み、 完了 ボタンをクリックして、ΔF/F カルシウムトレースを.xls形式としてエクスポートし、タセ芽画像と ROI を.bmp形式でエクスポートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>カルシウムトレースの解析<ol>
<li>ステップ5.3から得られたカルシウムトレースを分析する。テイスト細胞は、tastantが送達された後にベースラインの標準偏差が2つ以上上昇したときにテイスト細胞がタスタントに反応し、p−値が0.01未満であると考え、対または非対t-tests10を用いた。</li>
		<li>味細胞は、特定のタスタントに応答する場合、3回の試験のうち2回以上(〜60%)15回を超えると考えてください。</li>
		<li>ステップ5.4.1から得られた個々のカルシウムトレースを平均化することによって代表的なカルシウムトレースを得る。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+subcellular+targeting+of+GCaMP-type+genetically-encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators.</a> PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).</li>
<li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+as+a+tool+to+study+blood+flow+and+neurovascular+coupling+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (7), 1277-1309 (2012).</li>
<li>Choi, M., Kwok, S. J. J., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fluorescence+microscopy%3A+Lessons+from+observing+cell+behavior+in+their+native+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">In vivo fluorescence microscopy: Lessons from observing cell behavior in their native environment.</a> Physiology. 30 (1), 40-49 (2015).</li>
<li>Caicedo, A., Samir Jafri, M., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+Ca2%2B+imaging+reveals+neurotransmitter+receptors+for+glutamate+in+taste+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells.</a> Journal of Neuroscience. 20 (21), 7978-7985 (2000).</li>
<li>Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breadth+of+tuning+and+taste+coding+in+mammalian+taste+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds.</a> Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).</li>
<li>Dando, R., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+communication+in+intact+taste+buds+through+ATP+signalling+from+pannexin+1+gap+junction+hemichannels%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell communication in intact taste buds through ATP signalling from pannexin 1 gap junction hemichannels.</a> The Journal of Physiology. 587 (24), 5899-5906 (2009).</li>
<li>Chandrashekar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cells+and+peripheral+representation+of+sodium+taste+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The cells and peripheral representation of sodium taste in mice.</a> Nature. 464 (7286), 297-301 (2010).</li>
<li>Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+salt+recruits+aversive+taste+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High salt recruits aversive taste pathways.</a> Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).</li>
<li>Choi, M., Lee, W. M., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopic+interrogation+of+peripheral+taste+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopic interrogation of peripheral taste sensation.</a> Scientific Reports. 5 (8661), 1-6 (2015).</li>
<li>Han, J., Choi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+functional+screening+of+taste+sensation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Comprehensive functional screening of taste sensation in vivo.</a> bioRxiv. 16419 (371682), 1-22 (2018).</li>
<li>Thestrup, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+ratiometric+calcium+sensors+for+functional+in+vivo+imaging+of+neurons+and+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes.</a> Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).</li>
<li>Danilova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glossopharyngeal+nerves+to+taste+stimuli+in+C57BL+%2F+6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BME+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glossopharyngeal nerves to taste stimuli in C57BL / 6J mice.</a> BME Neuroscience. 15, 1-15 (2003).</li>
<li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6 (8171), 1-11 (2015).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Tan, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut-brain+axis+mediates+sugar+preference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The gut-brain axis mediates sugar preference.</a> Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).</li>
<li>Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+anion+in+salt+%28NaCl%29+detection+by+mouse+taste+buds%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).</li>
<li>Kusuhara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+responses+in+mice+lacking+taste+receptor+subunit+T1R1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Taste responses in mice lacking taste receptor subunit T1R1.</a> Journal of Physiology. 591 (7), 1967-1985 (2013).</li>
</ol>

著者らは、競合する財政的利益を宣言する:J.ハンとM.チェは、この記事で説明されている特許を取得したμTongue技術の発明者であり、μTongueシステムはSciTech Koreaを介して市販されている。

ここで説明する詳細なプロトコルは 、インビボでの味細胞の機能活動の調査にμTongueを適用する。このプロトコルでは、遺伝的にコードされたカルシウム指標を用いて味細胞上で機能的イメージングが行われる。トランスジェニックマウスの使用に加えて、味細胞上のカルシウム染料(または電圧感知色素)の電気泳動負荷は代替オプションであり得る。
この実験では、1.336未満の屈折率の全ての味覚溶液を使用した。μTongueは安定した流体送達を提供し、レシオメトリック解析はイメージングアーティファクトを改善しますが、より高濃度のタスタント(例えば、1.338の屈折率を持つ>100 mMショ糖)を使用することは困難です。人工唾液と味液の屈折率の大きな差は、ポスト画像プロセスによって補正範囲よりも画像焦点面をシフトする。経験的には、リアルタイムで安定した細胞イメージングを可能にする味覚溶液の屈折率(1.336未満)の特定の範囲が得られる。
蛍光イメージングおよび動物処理の経験を有する研究者にとって、このプロトコルは繰り返し練習を通し...

生体内蛍光顕微鏡は、生体組織の時空間的ダイナミクスを研究するために広く使用されています。研究者たちは、生物学的プロセスの特異的かつ敏感な蛍光シグナルへの変換を提供する遺伝的にコードされたセンサーを急速に開発しています - 広く利用可能な蛍光顕微鏡を使用して容易に記録することができます1,2.げっ歯類のほとんどの内臓は顕微鏡を用いて調べられてきたが、舌への応用は成功していない3.
味覚細胞のカルシウムイメージングに関する以前の研究は、舌組織を薄く切り離して、舌組織を薄く切り離して、味覚芽4、5、6を得るか、または味覚上皮を剥離して真菌形態の味覚芽7、8を得ることによって行った。これらのサンプルの調製は必然的に侵襲的であったため、神経の内在性、透水性バリア、血液循環などの自然微小環境は、大部分が摂動された。最初のインビタル舌画像化ウィンドウは2015年にChoiらによって報告されたが、流動性タスタント刺激によって引き起こされる動き及び光学的アーチファクトのために信頼性の高い機能的記録は達成できなかった。
最近、マイクロ流体オンアタン(μTongue)が導入された10.この装置はマウスの舌のイメージ投射窓とマイクロ流体システムを統合する。画像撮影期間を通じてタスタント刺激の準定常状態の流れを達成することによって、流体運動からのアーチファクトを最小限に抑えることができる(図1)。入力ポートは一連のマルチチャンネル圧力コントローラによって供給され、出力ポートは0.3 mL/minを維持するシリンジポンプに接続されます。また、タスタント溶液の屈折率の差に起因する光学的アーチファクトは、カルシウム感受性指標(tdTomato)とカルシウムインジケーター(GCaMP6)11を導入した比分析により最小化された。この設計は、流体チャネル間の急激な切り替えでも、生体内の味細胞の微視的安定性を提供しました。その結果、μTongueは、インビボでマウスの味覚芽に複数のタストタントの信頼性の高い機能的スクリーニングを実施します。
このプロトコルでは、実験手順はμTongueを用いた 生体内 におけるマウス真菌形態味覚芽のカルシウムイメージングについて詳細に説明される。まず、人工唾液およびタスタント溶液の調製について説明する。第2に、準定常状態流を達成するためのマイクロ流体システムの設定が導入される。第三に、画像の取得を可能にするためにμTongueにマウス舌を取り付けるために使用される手順が描かれている。最後に、横運動アーチファクトの補正やレシオメトリーを含む画像解析の各ステップを指定します。このプロトコルはマウスの設備および2光子顕微鏡または同等の装置を用いてあらゆる実験室に容易に合わせることができる。

<table><tbody><tr><td>アセスルファムK</td><td>Sigma Aldrich</td><td>04054-25G</td><td>人工唾液・テイスタント</td></tr><tr><td>塩化カルシウム溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>21115-100ML</td><td>人工唾液・テイスタント</td></tr><tr><td>クエン酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0759-100G</td><td>人工唾液・テイスタント</td></tr><tr><td>シクロヘキシミド</td><td>Σ Aldrich</td><td>01810-5G</td><td>人工唾液・テイスタント</td></tr><tr><td>デナトニウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5765-5G</td><td>人工唾液/試飲</td></tr><tr><td>歯科用接着剤</td><td>Denkist</td><td>P0000CJT-A2</td><td>動物の準備</td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td>ImageJ</td><td>データ分析</td></tr><tr><td>IMP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57510-5G</td><td>人工唾液/試飲</td></tr><tr><td>インスタント接着剤</td><td>ロックタイト</td><td>ロックタイト 4161、ヘンケル</td><td>動物の準備</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786-100G</td><td>人工唾液/tastant</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541-500G</td><td>人工唾液/tastant</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Yuhan</td><td>Ketamine 50</td><td>動物製剤</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0662-25G</td><td>人工唾液/tastant</td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>237205-500G</td><td>人工唾液唾液/試飲</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathwork</td><td>MATLAB</td><td>データ解析</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td>人工唾液/試飲</td></tr><tr><td>MPG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>49601-100G</td><td>人工唾液/試飲</td></tr><tr><td>Mutiphoton顕微鏡</td><td>Thorlab</td><td>&nbsp;ベルガモII</td><td>顕微鏡</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014-500G</td><td>人工唾液/試飲</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Σ Aldrich</td><td>792519-500G</td><td>人工唾液/試</td></tr><tr><td>飲 対物</td>レンズ <td>ニコン</td><td>N16XLWD-PF</td><td>顕微鏡</td></tr><tr><td>オクタ</td><td>フローALA 科学機器</td><td>OCTAFLOW II</td><td>流体制御</td></tr><tr><td>PC</td><td>LG</td><td>Lg15N54</td><td>流体制御</td></tr><tr><td>PHメーター</td><td>Thermoscientific</td><td>ORION STAR AZ11</td><td>人工唾液・テイスタント</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>806562</td><td>人工唾液・テイスタント</td></tr><tr>キ<td>ニーネ</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>Q1125-5G</td><td>人工唾液・テイスタント</td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>Havard Apparatus</td><td>PHD ULTRA 4400</td><td>流体制御</td></tr><tr><td>TRITC-デキストラン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>52194-1G</td><td>動物用調製</td></tr><tr><td>超高速ファイバーレーザー</td><td>Toptica</td><td>FFultra920 01042</td><td>顕微鏡</td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>バイエル 韓国</td><td>ロンプン</td><td>動物用調製</td></tr></tbody></table>

μtongue:生体内舌用マイクロ流体ベースの機能イメージングプラットフォーム

&#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

生体内蛍光顕微鏡は、生きた動物の多細胞ダイナミクスを研究するために広く使用されるツールです。しかし、味覚官能器官ではうまく使用されていない。マイクロ流体を生体内舌イメージングウィンドウに統合することにより、μTongueは、複数のタストタントへの制御された暴露の下 で生体内 の味細胞の信頼性の高い機能的画像を提供します。本論文ではμTongueシステムを利用するための詳細なステップバイステップの手順を提示する。タスタントソリューションの準備、マイクロ流体モジュールのセットアップ、サンプル実装、機能画像データの取得、データ分析の5つのサブセクションがあります。μTongueを使用する際に生じる可能性のある実用的な問題を解決するためのヒントとテクニックも紹介しています。

Pirt-GCaMP6f-tdTomatoマウスを使用して、味覚芽画像を得た。マウス舌の表面は、自己蛍光フィリフォーム乳頭で覆われていた。味覚芽は舌の表面上にまばらに広がっている(図4A)。味覚芽とその構造の画像は、3つの異なるフィルタ検出器を使用して取得しました。607/70 nmフィルタセットを用いて、レシオメトリック解析用に味細胞からのtdTomatoシグナルを得た(図4B)。525/50 nmフィルタセットを用いて、味覚芽を囲む味細胞や血管からのGCaMPシグナルを取得した(図4B)。447/60 nmフィルターセットを用いて、味覚芽を構造的に支持するコラーゲン結合組織を獲得した(図4B)。
味覚芽および相対構造の画像を取得した後、インビボカルシウムイメージングは、プロトコルを使用して行った。Pirt-GCaMP6f-t...

本稿では、舌上の生体内イメージングウィンドウにマイクロ流体を統合することにより 、生体内で の機能性味細胞イメージング用μTongue(マイクロ流体術オン・ア・タン)デバイスを紹介する。

μTongue:生体内舌用マイクロ流体ベースの機能イメージングプラットフォーム

Intravital fluorescence microscopy is a tool used widely to study multicellular dynamics in a live animal. However, it has not been successfully used in ...

このプロトコルは、神経接続と血液循環がそのまま残っている自然な微小環境における味細胞の機能を観察することを可能にする。この技術を用いて、細胞間通信をインビボで調べることができる。まず、加圧流量灌流システムの貯留層を人工唾液およびタスタントで満たす。圧縮空気ラインをレギュレータ入力に接続し、流体送達システムの空気圧を1平方インチ当たり30~50ポンドに設定します。レギュレータの出力圧力を1平方インチあたり0.4ポンドに設定し、液体がチューブから流出し始めるかどうかを確認します。リザーバからマイクロタングの入力ポートにマニホールドを接続し、マイクロ舌の出力ポートをシリンジポンプに接続し、毎分約300マイクロリットルで液体を引き出して安定した状態を確立します。マイクロ舌の下に掛かる液滴の体積が一定であることを確認し、空気圧と流量を調整して所望のサンプル高さを得る。マイクロ流体システムが設定されたら、圧縮空気ラインを外し、マウスがin vivoイメージング用に準備されるまでシリンジポンプをオフにします。マウスに麻酔を投与した後、TRITC-dextranをレトロ軌道経路を通して静脈内注射し、イメージング中の血液循環を観察する。マウスをスピーヌ位置に置き、その頭に70%エタノールをスプレーします。鉗子を使って頭の皮を軽く持ち上げ、ハサミを使って約7平方ミリメートルの皮膚を切り取ります。頭皮の周りの毛をクリーニングした後、皮膚の下から骨膜を取り除き、頭蓋骨に瞬間的な接着剤を塗布します。次に、カスタマイズされたヘッドフィクサーを取り付けます。瞬間接着剤が硬化したら、ヘッドフィクサーの周りに歯の接着剤を適用し、青色光で照明によってそれを固めます。インスタント接着剤を使用してマウスの下唇をマイクロ舌の下のユニットに接着し、マウスの準備ボードにマウスを置き、マイクロ舌の端にある穴をポストに合わせることで、マイクロ舌の底部をホールドポストに固定します。ボードのヘッドフィクサーホルダーにマウスヘッドフィクサーを締め、マウスヘッドとデバイスの間の距離を調整します。次にヘッドフィクサーホルダーを使用して、マウスヘッドを約45度滑らかに回転させます。マウスをボードに固定した後、プラスチック製のピンセットを使用して舌を軽く引きます。次に、インスタント接着剤を使用して、舌の腹側をマイクロ舌の下の単位の上側に取り付けます。舌を湿らせた状態に保つには、濡れた綿棒で表面を拭き取り、舌の露出した表面に人工唾液に浸した組織を置きます。湾曲したワッシャーをポストに置き、マイクロ舌の下部を保持し、マウスの準備を顕微鏡の段階に移します。マウスの露出した舌を顕微鏡の目的領域の近似中心の下に置き、ステージのダイナミックレンジから逸脱しないようにし、ネジを締めてステージ上にマウスボードをしっかりと取り付けます。マウスの下に加熱パッドを置き、体温を36.5~37.5°Cの間で維持します。マウスの口の中に薄いねじれた紙を入れ、舌の表面に置かれた湿ったティッシュを取り除き、準備したマイクロ舌をマウスの舌の上に置き、舌の表面が画像窓から見えるように、マウスの気管に液体が入るのを防ぎます。最小の圧縮圧力で両端を静かにねじ込むことによってマイクロ舌を固定します。画像の取得を開始するには、顕微鏡ソフトウェアを開き、920ナノメートルの2光子レーザーをオンにします。マイクロ舌のイメージングウィンドウに目的を下げ、目的を浸漬して、マイクロスコープに水浸漬目的を取り付けます。カメラモードでは、水銀灯の青い光を点灯して舌の表面を照らします。近似焦点面を見つけるには、Z軸を調整し、フィリフォーム乳頭から自己蛍光信号を検索します。次に、XとY調整ノブを使用して、味覚芽を見つけます。マルチフォトンモードに切り替え、励起波長、発光フィルタセット、スキャンモード、フレームサイズを設定して画像取得します。画像窓の中央に味覚芽を使用して、味覚芽の約3分の2の高さで味覚芽を囲む血管を見つけ、血液循環を視覚化します。血流が詰まっている場合は、固定ネジを少し緩めて血流を再開します。Z軸を調整して、味覚細胞の数が十分にある味覚芽のZ平面を見つけ、80秒間2〜6ヘルツでカルシウムイメージングを進めます。イメージングが開始された後、流体システムのリザーバをオンにして、20秒間の味覚溶液を提供します。味覚刺激の20秒後、人工唾液に戻って貯水池を切り替えます。イメージング中は、セッションの間に約3〜4分待って、舌を湿らせ、前のセッションから残っているタスタントを洗い流すために人工唾液を一貫して提供します。Pirt-GCaMP6f-tdTomatoマウスの舌表面は、自己蛍光フィリフォーム乳頭で覆われ、味覚芽がまばらに広がっています。黄色のフィリフォーム乳頭は500〜550ナノメートルの光検出器を使用して捕獲され、深さ約25マイクロメートルまでの舌の表面から観察することができます。GCaMP信号を緑色に500~550ナノメートルフィルターで検出し、tdTomato信号を赤色で、607~670ナノメートルフィルタで検出し、味覚細胞を表す。比メトリック分析用にtdTomato信号を取得します。味覚芽を囲む血管は、447〜460ナノメートルフィルタセットを使用して、構造的に味覚芽を支えるコラーゲン結合組織に設定された500〜550ナノメートルフィルタを使用して取得されます。この代表的な例では、カルシウムイメージングを用いたインビボ味スクリーニングでは、各味細胞は破線で区切られる。今回の試験では、細胞2は甘味とうま味の両方のタスト剤に反応した。そして、細胞3は低塩と高塩味の両方に反応した。この味覚芽の細胞のどれも酸味に反応しませんでした。本実験の目的は、自然環境における細胞機能の味を観察することであるため、調製工程で蛍光を血管に送達し、実験中にその循環を確認することが重要である。

tongue-microfluidics-based-functional-imaging-platform-for-tongue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

標識された細胞の多光子顕微鏡を通して舌内に口腔癌と腫瘍浸潤の定量的なモニタリングのマウスモデルの生成に関わる技術の包括的な概要が表示されます。このシステムは、抗浸潤化合物の分子の評価と薬効のための有用なプラットフォームとして機能することができます。...

口腔扁平上皮癌の同所性マウスモデルにおける腫瘍細胞の浸潤の多光子イメージング

Lensfree光トモグラフィーは、&lt;1μmの空間分解能を提供して三次元顕微鏡技術である×&lt;1ミクロン×15〜100ミリメートルの大型イメージングボリューム上のそれぞれx、yおよびz次元において&lt;3μmの...

マルチアングル照明とピクセル超高解像度を採用しLensfreeオンチップ·トモグラフィー顕微鏡

ここでは、3次元の機能的および分子的なイメージングのための新しく開発されたハンドヘルド光音響(光音響)システムを用いたイメージングのための実験プロトコルの詳細な説明を提供します。実証された強力な性能と汎用性は、前臨床研究および臨床診療における光音響技術の新たな応用分野を定義する可能性があります。...

ディープティシュ人間血管造影および機能前臨床研究のためのユニバーサルハンドヘルド三次元光音響イメージングプローブリアルタイムで

この研究は、成功したトランスレーショナ嚥下障害の研究を促進する目的で、マウス疾患モデルで使用するための人間のvideofluoroscopic嚥下研究（VFSS）メソッドを適応さ。...

マウス疾患モデルで嚥下障害を検出し、特徴づけるために、人間のVideofluoroscopicツバメ調査方法を適応させる

超音波画像は、発話中の舌の形状と動きをリアルタイムで表示するために使用できます。画像を使用して、音声エラーの性質を判断できます。舌の視覚的フィードバックは、臨床集団における発話音の生成の改善を促進するために使用できます。...

舌の超音波画像：スピーチサウンドエラーの評価および修復のためのチュートリアル

ターゲット特定プローブなど各種疾患 (例えば炎症、感染、腫瘍) におけるタンパク質発現の分子機構を解析するための革新的なツールを表します。本研究では F4/80...

検出とマクロファージによるマウス腸管炎症の定量化のための蛍光を介したトモグラフィー

我々は、舌の筋緊張および粘弾性を決定するための麻酔したラットモデルにおける外科的処置を記載する。この手順は、舌下神経の特異的刺激、および受動的リサージュ力/変形曲線の筋肉への適用を含む。...

ラット舌の機械的および粘弾性的特性のインビボ評価

我々は、胚および成体マウス舌の上皮および間線質/結合組織から大量の高品質単一細胞を解離するための一般化されたプロトコルを開発した。...

12.5日目および8週齢マウスの舌上皮・間分性/結合組織からの細胞解離

このプロトコルは、成体マウスの後味乳頭から単離された味覚幹細胞に由来する言語オルガノイドを培養および処理するための方法を提示する。...

成人マウス味幹細胞由来の舌下オルガノイドの生成と培養

OCTOPUSと呼ばれるマルチサブフェーズ交換で実装されたペンダントドロップサーフェスフィルムバランスは、元のバルク溶液をシミュレートされた胃腸液と順次サブフェーズ交換することにより、消化状態を模倣することができます。シミュレートされた in vitro 消化は、消化された界面層の界面張力を in situ で記録することによってモニターされる。...

インビトロ 模擬胃腸液の多相交換 による 単一液滴中のエマルジョンの消化

このプロトコルの目的は、異なる分子サイズの蛍光標識デキストトランスを歯 肉表面に局所的に塗布し、その後単一光子顕微鏡システムを用いて 体外 画像を施すことで、マウスの歯肉上皮上皮障壁の完全性を定量的に評価する標準化されたアプローチを提供することです。...

蛍光トレーサーを用いたマウスの歯肉上皮障壁の機能評価

学ぶマイクロ流体統合型μTongueシステムを用いた生体内味細胞機能イメージング法。マウスを用いて生理的環境下で味細胞の応答を可視化し、細胞間コミュニケーションを解析する実験プロトコルです。

μTongue:生体内舌用マイクロ流体ベースの機能イメージングプラットフォーム

さらに動画を探す