Name: 液滴界面二層の温度制御アセンブリと特性 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: 学ぶ液滴界面二層の温度制御アセンブリ法。アルミニウム治具と抵抗加熱素子を用いて、高融点脂質や天然細胞抽出物からDIBを形成し、電気的・光学的特性を測定することで、温度依存性の膜構造と輸送特性を詳細に解析できます。

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国立科学財団グラントCBET-1752197と空軍科学研究研究グラントFA9550-19-1-0213によって財政的支援が提供されました。

著者は利害の対立を持っていません。

本明細書に記載されているプロトコルは、Dibを形成するために使用される油および液滴の温度を制御する実験システムを組み立て、操作するための指示を提供する。RT以上の融解温度を有する脂質を用いてDIB形成を可能にする上で特に有益である。さらに、油溜めの温度を正確に変化させることにより、二層温度を操作して、容量、面積、厚さ、熱伝導相変化、膜活性種の運動論、および二層37,38の接着のエネルギーを含む様々な膜特性および特性に対する高温の影響を研究することができる。
プロトコルは、DIB研究で使用する前の3つの部分で構成されています: 1) 加熱ステージ器具の準備とアセンブリ;2)様々な楽器を接続します。3)選択された比例および積分制御の利益と適切な温度制御性能を確認する。パート 2 で最も重要なのは、パワー アンプ(&gt;mA 電流)とパッチ クランプヘッドステージ(pA-nA 電流)の出力間の共有伝導経路を避ける必要があります。不注意なショートは、ヘッドステージに永久的...

細胞膜は、何千もの脂質タイプ1、タンパク質、炭水化物、ステロールから構成され、すべての生きた細胞をカプセル化して細分化する選択的透過性バリアです。その組成がそれらの機能にどのような影響を与えるかを理解し、自然分子と合成分子が細胞膜とどのように相互作用し、接着し、破壊し、トランスポジションするかを明らかにすることは、生物学、医学、化学、物理学、材料工学において広範囲に及ぶ影響を持つ重要な研究分野です。
これらの発見は、合成脂質または天然脂質から組み立てられた脂質二重層を含むモデル膜を組み立て、操作、および研究するための実証済みの技術から直接利益を得ることを目的としています。近年、油脂中の脂質被覆水滴間に平坦な脂質二重層を構築するための液滴界面二重層(DIB)法2、3、4は、5、6、7、8、9、11、1に大きな注目を集めている2,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,およびモデル膜形成のための他のアプローチよりも実用的な利点を示している:DIB法は、実行が簡単である、 洗練された製造や準備を必要としない(例えば、 膜を支える基質の「絵画」)は、一貫して優れた膜を生み出す長寿は、標準的な電気生理学的測定を可能にし、非対称リーフレット組成物3を有するモデル膜の形成を簡素化する。二重層は液滴と各液滴の間に自発的に形成されるため、位置と化粧で調整することができます。 DIB技術は、刺激応答性膜18、24、25、26、27、28、28、バランスのとれた区画化および輸送14、30、31、および組織状材料17、23、32、33、34、35、36を使用して構築する細胞に触発された材料システムの開発にも大きな関心を集めています。
モデル膜に関する公開実験の大半は、DIBを含め、室温(RT、〜20~25°C)および一握りの合成脂質(例えば、DOPC、DPhPCなど)で行われている。この実習では、モデル膜で研究できる生体物理学的な質問の範囲が制限され、観察に基づいて、DIBを組み立てるために使用できる脂質の種類も制限できます。例えば、42°Cの融解温度を有するDPPCのような合成脂質は、密に詰まった単層を組み立てないか、またはRT37でDDBを形成する。室温でのDIB形成は、哺乳類(例えば、脳総脂質抽出物、BTLE)38または細菌(例えば、大腸菌全脂質抽出物、ETLE)37などから生じる天然抽出物に対しても困難であることが証明されている。多様な組成物の研究を可能にすることで、生物学的に関連する条件で膜介在プロセスを理解する機会を提供します。
油の温度を上げることは2つの目的を果たすことができます:それは単層アセンブリの運動学を増加させ、脂質が液体乱れた相に達するために溶融遷移を受ける可能性があります。両方の結果は、単層アセンブリ39、DIBの前提条件を助ける。二重層形成のための加熱に加えて、形成後の膜を冷却して、カロリー測定を用いて検出が困難な天然脂質混合物(例えば、BTLE)内のものを含む単一脂質二重層38における熱的な遷移を同定するために使用することができる。脂質の熱的な遷移を評価する以外に、DIBの温度を正確に変化させることで、膜構造38 の温度誘発変化を研究し、脂質組成および流動性が膜活性種(例えば、気孔形成ペプチドおよび膜貫通タンパク質37)に与える影響を調べることができます。
本明細書において、改変されたDIB油貯留層を組み立て、RTよりも高い温度で単層アセンブリおよび二層形成を可能にするフィードバック温度コントローラを動作させる方法の説明が説明される。以前のプロトコル40とは区別して、オイル貯蔵所のDIBのアセンブリおよび特性評価に平行して温度を測定し、制御するために必要な器械使用の統合に関して明記された詳細が含まれている。したがって、この手順により、ユーザーはさまざまな科学的文脈で温度範囲にわたってDiIbを形成し、研究するためにこの方法を適用することができます。さらに、代表的な結果は、温度が変化するにつれて起こり得る膜構造およびイオン輸送の両方における測定可能な変化の種類についての具体的な例を提供する。これらの技術は、異なる膜組成における膜活性種の運動学の研究を含む、DIBで効果的に設計および実施することができる多くの生物物理学的研究に重要な追加である。

<table><tbody><tr><td>25 mm x 40 mm x 1 mmの絶縁ゴム(x2)</td><td>任意</td><td></td><td>顕微鏡のステージからアルミニウム固定具の底を絶縁</td></tr>します <tr><td>25 mm x 40 mm x 6 mmの絶縁ゴム(x2)</td><td>任意</td><td></td><td>顕微鏡ステージクリップによって発熱体が損傷を受けるのを防ぎ、発熱体の上部を断熱します。</td></tr><tr><td>3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3183</td><td>脂質溶液用緩衝剤</td></tr><tr><td>アクリル基材</td><td>HTD_STG_2</td><td></td><td>~1000 uL アクリル井戸で製造され、ポカヨケの外装プロファイルで向きを固定</td></tr><tr><td>アルミニウム固定具</td><td>住宅で製造</td><td>HTD_STG_1</td><td>ベース固定具 アシリック固定具を保持する油井と、発熱体用の油井に隣接する 2 つのフラットパッドを含むベース固定具&nbsp;</td></tr><tr><td>脳総脂質抽出物</td><td>Avanti</td><td>131101C-100mg</td><td>25 mg / mL豚脂質抽出物&nbsp;</td></tr><tr><td>コンパクトDAQシャーシ(cDAQ)</td><td>National Instruments&nbsp;</td><td>cDAQ-9174&nbsp;</td><td>複数のタイプのセンサ計測モジュールまたは出力モジュールを収納できるシャーシ</td></tr><tr><td>データ取得システム(DAQ)</td><td>分子デバイス&nbsp;</td><td>デジデータ1440A&nbsp;</td><td>高解像度アナログ-デジタルコンバータ</td></tr><tr><td>固定ゲインアンプ/電源</td><td>ヒューリットパッカード</td><td>HP 6826A</td><td>は、電圧出力モジュールからのDC電圧出力を増幅します</td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ</td><td>コーニング</td><td>CLS284525</td><td>アルミニウムベースの底をシールし、二層の光学特性評価を可能にします</td></tr><tr><td>発熱体 (x2)</td><td>オメガ</td><td>KHLV-101/5</td><td>25 mm x 25 mmポリイミドフィルムカプトン発熱体、5ワットの電力制限付き。</td></tr><tr><td>M3ステンレス鋼ネジマク</td><td>マスター</td><td>カー90116A150</td><td>は、熱電対をアルミニウム固定具</td></tr><tr><td>パッチクランプアンプ</td><td>分子デバイスに固定します&nbsp;</td><td>アクソパッチ 200B&nbsp;</td><td>ヘッドステージへの電流と出力電圧を測定</td></tr><tr><td>パーソナルコンピュータ</td><td>複数の高速USBポートと最低6 Gbのラムを備えた任意の</td><td></td><td></td>コンピュータ</tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td>解離イオンの電解質溶液</td></tr><tr><td>温度入力モジュール</td><td>National Instruments&nbsp;</td><td>NI 9211</td><td>:cDAQシャーシの開放型および冷接点熱電対の計測が可能</td></tr><tr><td>Thermocouple</td><td>Omega</td><td>JMTSS-020U-6&nbsp;</td><td>直径0.02インチ、長さ6インチのU型熱電対</td></tr><tr><td>UV硬化型接着剤ロック</td><td>タイト</td><td>19739</td>ガラス<td>カバースリップをアルミニウムベースフィクスチャに固定</td></tr><tr><td>電圧出力モジュール</td><td>ナショナルインスツルメンツ&nbsp;</td><td>NI 9263</td><td>アナログ電圧出力モジュール、cDAQシャーシ用</td></tr><tr><td>、波形発生器</td><td>Agilent</td><td>33210A&nbsp;</td><td>10mV、10Hzの正弦波を出力するために使用</td></tr></tbody></table>

液滴界面二層の温度制御アセンブリと特性

Temperature-Controlled Assembly and Characterization of a Droplet Interface Bilayer

油中の脂質被覆水滴間で脂質二重層(すなわち、DIB)を組み立てる液滴界二重層(DIB)法は、他の方法に対して重要な利点を提供する:DIBは安定しており、しばしば長持ちし、二重層領域は可逆的に調整することができ、リーフレット非対称性は液滴組成物を介して容易に制御され、二重層の組織状ネットワークは、多くの滴を介して容易に制御され、二重層の組織状ネットワークは、多くの滴によって得ることができる。DIBを形成するには、液滴の表面で高密度脂質単層に脂質を自発的に集める必要があります。これは一般的な合成脂質の室温で容易に起こるが、十分な単層または安定な二重層は、いくつかの細胞脂質抽出物を含む室温以上の融点を有する脂質に対して同様の条件で形成できない。この動作は、モデル膜研究におけるDIBの組成(おそらく生物学的関連性)を制限している可能性があります。この問題に対処するために、DIB液滴をホストする油溜層を慎重に加熱し、脂質膜に対する温度の影響を特徴付ける実験プロトコルが提示される。具体的には、このプロトコルは、熱伝導性のアルミニウムフィクスチャと、フィードバックループによって制御される抵抗加熱要素を使用して、より広い脂質タイプの単層アセンブリおよび二層形成を改善する高温を規定する方法を示す。膜の構造的特性は、二重層を含む脂質の熱的な相転移と同様に、DIBの電気容量の変化を測定することによって定量される。この手順を組み合わせることで、多成分脂質混合物の有効な融解温度(TM)の決定を含む、様々な温度にわたってモデル膜の生物物理学的現象を評価するのに役立ちます。この機能は、モデル膜における自然相転移のより緊密な複製を可能にし、細胞の異質性をより良く捕捉するものも含め、より広い範囲の膜構成体からのモデル膜の形成と使用を促進する。

図1は、DIB形成用の顕微鏡ステージ上でアルミニウム製の器具およびアクリルオイル貯留層がどのように調製されているかを示しています。組み立てステップ1.2-1.4は、より効率的な加熱のために、ステージからフィクスチャを熱絶縁するのに役立ちます。ステップ1.5-1.7は、熱電対をフィクスチャに適切に取り付け、オイル貯蔵所を配置する方法を示し、ステップ1.8 -1.9はこれらの部分に油を分配するための推奨場所を示しています。
図 2 は、フィードバック温度制御を確立し、DIB で電気測定を行うコンポーネントの概要を示しています:PC、固定ゲインパワーアンプ、パッチクランプアンプ、DAQシステム(または電圧を印加してpA-nAレベル電流を測定するための同等の機器)、適切なアナログ入力と出力を備えた2番目のDAQ、波形発生器、および取り付けられたレジストヒーター付きアルミニウム製の固定具。DAQ-2は2つのモジュールを利用しています(<strong class="xfig"...

このプロトコルは、溶融温度の上昇を伴う脂質の脂質単層アセンブリおよび液滴界面二重層形成を促進するためのフィードバック温度制御加熱システムの使用、および膜の温度駆動変化を特徴付ける容量測定の詳細を示す。

The droplet interface bilayer (DIB) method for assembling lipid bilayers (i.e., DIBs) between lipid-coated aqueous droplets in oil offers key benefits ...

このプロトコルにより、研究者は液滴界面二重層(DIB)モデル膜を正確に加熱することができ、細胞環境で起こる様々な温度関連の効果を研究することができます。コアの利点は、DIBの電気的または光学的特性評価へのアクセスを妨げることなく、低体積貯留層の浴温を局所的に測定し、制御する能力に由来する。流体浴を正確に加熱する能力は、天然細胞抽出物を含む膜構成物のはるかに広い種類から形成されたDIBの輸送およびシグナル伝達特性を研究する可能性を解き放ちます。これは、十分な実験精度を達成するために密接に従わなければならない複数の機器を活用したマルチステッププロトコルであり、したがって、視覚的なデモンストレーションを通じて、書かれたプロセスのあいまいさを明らかにすることができます。長さ25×40ミリメートルにトリミングされた厚さ1ミリメートルの絶縁ゴムの2枚、25×40ミリメートルの6ミリメートルの厚さのゴムの2枚、準備されたアルミニウムベースの固定アセンブリ、およびアルミニウムベースの据え付け具の表示窓に収まるアクリルオイルリザーバーを集め始めます。細いゴム片を顕微鏡のステージに置き、各部分の長いエッジがステージ開口部に接するようにします。アルミベースの固定具を、対物レンズの上に中央に据えた器具の表示窓を持つ絶縁パッドの上に置きます。各抵抗発熱体の上に厚いゴム片を置き、顕微鏡ステージクリップを使用して、ステージクリップによる損傷から発熱体を保護し、偶発的な電気ショートから絶縁します。熱電対の測定端を慎重に曲げて、端から約4ミリメートルで90度の角度を達成します。熱電対の曲がった先端をアルミニウム製の器具の左下隅に挿入し、ロックねじで静かに固定します。アクリル貯留器のウェルにアクリル貯留槽を入れて、アルミニウム製の器具のウェルに六方体油を加えて、アクリルの窓と下の部分の間に気泡をトラップするリスクを最小限に抑えます。約1,000マイクロリットルの六方体油をアルミニウム器具の井戸に分配し、熱伝達のための最大表面積を提供し、油が器具の端を顕微鏡ステージまたは対物レンズにこぼれないようにします。約1,000マイクロリットルのヘキサデカンオイルをアクリル貯蔵所に過剰充填せずに分配します。二層形成が可能な設定点から油浴の温度を下げながら、膜内の脂質の熱的な相転移を識別しながら、膜の公称静電容量を測定します。GUI の温度グラフを右クリックし、表示データをクリアして、バッファ内の十分な領域が後続の記録に使用できることを確認します。パッチクランプアンプに接続された波形発生器を使用して、液滴界面二重層(DIB)を横切って三角電圧波形を適用し、二重層を介して誘導電流応答を記録します。設定点温度を5度刻みで下げることで二重層を冷却し、望ましい温度が達成されるまで温度変化の間に新しい定常温度で最低5分待ちます。オイルバスを使用して二重層を希望の最低温度まで冷却した後、GUI の温度グラフをもう一度右クリックし、温度データ対時間をスプレッドシート ソフトウェアにエクスポートします。現在の記録を停止します。測定電流から、冷却期間中の時間に対する方形波電流応答の公称静電容量を計算します。公称キャパシタンス対温度をプロットして膜容量がどのように変化したかを観察し、静電容量と温度の非単調な変化を見つけて溶融温度を特定します。同様に、オイルバスと二重層領域の温度を連続的に増分することによって、固定温度での二重層の準静的特異性容量を評価する。GUI を使用して設定点温度を摂氏 10 度単位で変更し、システムが新しい温度に平衡化できるようにします。前述の手順に従って、容量電流と記録の測定を開始します。マイクロマニピュレータを使用して電極の位置を慎重に調整して、二重層領域を変更します。正波電流が定常状態に達し、DIBの画像を収集して膜面積対時間の計算を可能にします。顕微鏡に取り付けられたカメラを使用して、絞りから見た二重層を画像化します。現在の記録ソフトウェアにデジタルタグを追加して、画像コレクションの対応するタイムポイントをマークします。合計5枚のDIB画像と二層電流の定常領域を得て、温度をリセットして撮像を繰り返す。定常二重層領域に対応するタグ付きタイムポイントでの現在の記録とDIB画像を解析し、各温度の二重層容量と面積を抽出します。各温度の容量対面積をプロットし、各温度における二重層の特定のキャパシタンスを表す第1次回帰の傾きを計算します。次に、特定の静電容量の値とそれぞれの温度をプロットします。非単調な変動の特定の静電容量と温度データを調べて、融解温度を特定します。二重層全体でDC電圧ステップ入力を生成することにより、電圧依存性イオンチャネル形成のダイナミクスを評価します。初期電圧をミリボルト単位で希望ステップ値に設定し、最終電圧とステップサイズを希望ステップより高い値に設定します。ステップ入力の希望の持続時間を秒単位で設定し、ステップ入力に必要な極性を選択します。パッチクランプアンプを切り替えて、ラボビューまたは電圧出力モジュールからヘッドステージに発送するコマンド電圧をヘッドステージに送り、電圧をオンにして誘導電流応答を記録します。別に、必要な温度で膜の動的電流電圧関係を取得し、イオンチャネルの挙動などの電圧依存関係を明らかにします。パッチクランプアンプを切り替えて、波形発生器からヘッドステージに発送するコマンド電圧を送信し、電流記録を開始します。波形発生器で、希望の振幅、オフセット、周波数を持つ連続正弦波波形を出力します。1つまたは複数のサイクルにわたって誘導電流応答を記録し、異なる正波振幅、周波数、温度に応じて繰り返します。温度制御システムは、脳総脂質抽出物、またはBTLE、脂質から形成されたDIBの温度依存性を示すために使用された。静電容量電流と温度対時間の測定値は、室温から摂氏約60度までの加熱サイクル中に示されています。60°Cでの初期二重層形成後、1つの完全な冷却/加熱サイクルにわたる公称静電容量対温度の変化が文書化された。異なる温度での特定の静電容量の準静的測定は、脂質溶融温度を同定するために使用することができる。二重層面積と二重層領域のキャパシタンスをプロットすると、線形回帰が可能になり、この傾きは特定のキャパシタンスの値を表します。DIB画像は、温度が融解温度を下回ると、膜が、よく分離された電極によって引き起こされる伸張液滴からの張力下でも、接着性の高い状態を採用することを示している。示された電流対電圧トレースは、二つの異なる温度で誘導電流を測定する、内膜電圧を印加することによって得られた。矢印とその後の数字は、時間に対して、中弦波電圧の連続する四分の一を視覚化するのに役立ちます。同じ電圧レベルと2つの異なる温度でのモナゾマイシンドープBTLE膜の測定された電流密度をここに示します。六方体油をアルミニウムフィクスチャのウェルに正しく分配することが重要です。これが順序外に行われるか、慎重に行われていない場合は、アクリルウェルの下に気泡が形成され、DIBのボトムアップビューが妨げられます。また、ユーザーは、完全な記録を確実にするために、各測定の前に温度制御ソフトウェアのデータバッファをクリアすることを忘れないでください。この手順は、膜構造および輸送の温度依存性を研究するために必要な温度の範囲にわたってバイオミメティック膜を特徴付けることを可能にする。さらに、この機能は、生物学的イオンチャネルおよび工学的ナノ材料のような他の膜活性種のナノスケール効果を明らかにするために使用することができる。

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Bioengineering

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液滴界面二層の温度制御アセンブリと特性

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