ダイヤモンド光源におけるビームラインI23上の真空中長波長結晶構造解析のためのサンプル調製および移送プロトコル
April 23rd, 2021
ここでは、長波長高分子X線結晶構造解析実験のために、ダイヤモンド光源のビームラインI23上の真空端局への極低温サンプル調製および結晶の移送のためのプロトコルを提示する。
長波長高分子結晶構造解析は、タンパク質や核酸に天然に存在する光原子からの異常なシグナルを利用します。この技術は、結晶学的顔の問題を実験的に解決し、これらの元素の同一性と位置を決定するために使用されます。ダイヤモンド光源のビームラインI23は、最大5オングストロームの長波長での実験に最適化されたユニークなシンクロトロン装置です。
これにより、カルシウム、カリウム、塩素、硫黄、リンなどの生物学的関連性の高い元素の吸収端にアクセスできます。長波長レジームでは空気によるX線の有意な吸収のために、これらの実験は真空環境で行われる。真空環境内の極低温でサンプルを維持するために、結晶は専用の熱伝導性サンプルホルダーに取り付けられています。
液体窒素から真空エンドステーションへの極低温サンプル移送は、クライオ電子顕微鏡で使用される技術と非常によく似ています。このプロトコルは、ダイヤモンド光源で開発されたツールと機器を使用して結晶を真空環境に移送する手順を示しています。まず、サンプルホルダーがベースに取り付けられたままになり、バイアルが蓋に保持されるように、蓋をCombiPuckのベースから分離します。
バイアルで蓋を液体窒素に浸し、サンプルホルダーとアダプターを磁気杖に取り付けて結晶を採取します。各サンプルを冷却してCombiPuckに直接流し、サンプルの位置を確認します。パックを閉じるには、パックの杖を使用してベースを蓋に取り付けます。
CombiPuckを液体窒素から乾式荷送人または貯蔵庫に移します。空の移送ブロックをすでに取り付けたブロックパックのベースをフォーム容器内の支持ベースに置き、液体窒素で満たします。次に、液体窒素を充填した発泡容器にCombiPuckを入れ、パックのベースが発泡容器内部の磁気ホルダに固定されていることを確認する。
必要なすべてのツールを液体窒素で予冷します。次に、パックセパレータツールを使用して蓋をベースから分離し、ベースが磁気ホルダーに取り付けられたままになるように、サンプルホルダーを液体窒素の内部にさらします。分離器の杖をサンプルホルダーとアダプターの上に置き、できるだけ下まで置き、杖が垂直であることを確認します。
セパレーター杖の小さなレバーを親指で下へ動かし、カチッと音がしてサンプルホルダーを内部に固定し、サンプルホルダーをアダプターから引き出します。セパレータを目的の転写ブロックの位置に下げ、3本の突起のうちの1つが転写ブロックの中央の穴の内側に収まることを確認します。レバーを上に動かしてサンプルホルダーを離します。
サンプルを次の転送ブロックにロードするには、カルーセルキーツールを使用して空の転送ブロックを水平位置に回転させます。すべてのサンプルホルダーが移されたら、蓋を液体窒素に入れてブロックパックを閉じます。温度が平衡化するのを待ってから、蓋をベースに合わせ、静かに持ち上げてカルーセルから解放します。
ステーションにシャトルを取り付けます。窒素ガスとエアバルブを開き、ガスが流れていることを確認します。次に、CTS の電源を入れます。
バスとシャトルの両方を液体窒素で冷やします。付属の漏斗をシャトルの充填口に置き、スクリーン上のレベルを監視しながら液体窒素をゆっくりと漏斗に注ぎます。インジケータが赤から青に変わったら停止します。
漏斗を使用して浴を液体窒素で満たします。付属のパックセパレータツールを使用して、ブロックパックを液体窒素からCTSバスに移します。ブロックパックの蓋を外し、CTSバスの蓋を閉めます。
シャトルにトランスファーブロックを導入するには、時計回りに90度回転させてシャトルハンドルのロックを解除し、ハンドルのガイド付きトラックが正しい移動経路を強制するようにバスに向かって進めます。ブロックカバーが冷却されたら、ハンドルを引いてブロックをシャトルに導入します。トランスファーブロックをシャトルにロックするには、ハンドルを時計回りに 180 度回転させます。
ハンドルを元の背面位置に引っ込め、反時計回りに 90 度回転させて所定の位置にロックします。表示画面のシャトルバルブポンプを閉じるを押して、シャトルの排気を開始します。「シャトルを動かす準備ができました」と「ロッドを動かさない」というメッセージが表示されたら、バルブが閉じた状態がタッチスクリーンに表示され、シャトルの下のレバーを押し、上部のハンドルを使用して慎重に持ち上げます。
シャトルを真空エンドステーションのエアロックに直立させて運び、取り付けます。タッチスクリーン上の対応するボタンを押し、サンプルホテルを正しい積載位置に移動することにより、容器内の空のブロック位置を選択します。サンプルホテルの位置が決まったら、開くボタンを押して真空インターロックシーケンスを開始します。
シーケンスが完了し、ステータスがエアロックオープンに変わったら、シャトルでブロックし、ハンドルを時計回りに90度ねじってロッドのロックを解除します。ロッドを容器にそっと押し込み、ガイド付きトラックがサンプルホテルへの正しい移動経路を強制するようにします。画面に表示されたビデオフィードを使用して転送ブロックをホテルにゆっくりと挿入し、タッチディスプレイのブロック位置アイコンがアクティブになっていることを確認します。
アクティブになったら、ハンドルを反時計回りに180度回転させて移送ブロックを解放し、ロッドを容器から引き出します。完全に引っ込んだら、ハンドルを反時計回りに 90 度回転させてロッドをロックします。閉じるボタンを押してエンドステーションの真空バルブを閉じ、シャトルと容器の間のスペースを大気圧に通気します。
エアロック ディスプレイに「取り外しOK」というステータスが表示されたら、シャトルを取り外します。シャトルをCTSバスに戻し、シャトルバルブを開くを押してシャトルを排気し、次のサンプルブロックをロードします。信号が緑色になり、ロッドを移動してOKというメッセージが表示されたら、次の転送ブロックをシャトルに導入できます。
次の転送ブロックを準備するには、ブロックパックをバス内で回転させます。アクリル製の蓋の上部にある内蔵の回転キーを、ブロックパックの中央にあるロックに押し込みます。キーを押しながらキーを回して、目的の転送ブロックをピックアップ位置に配置します。
すべてのブロックが転送されたら、シャトルバルブが開いていることを確認し、タッチスクリーンのベイクボタンを押し、バースとシャトルの両方を選択してから、ベイク開始を押します。ダイヤモンド光源の長波長高分子結晶構造解析ビームラインI23は、カルシウム、カリウム、塩素、硫黄、リンなどの生物学的に重要な元素の吸収端にアクセスでき、これらの元素をフェージングまたは巨大分子内で位置決めするために使用できる強化された異常信号を与える。回折データは、波長2.75オングストロームの単一のソーマチン結晶から収集され、より長い波長での異常信号の増加とサンプル吸収効果との間の妥協点として選択された。
真空セットアップにより、サンプルによって散乱されたX線のみが検出器に到達し、ブラッグ反射の周囲に低い背景が提供されます。データセットは非常に強い異常信号を生成し、自動フェージングパイプラインCRANK2による構造ソリューションを容易にしました。得られた電子密度マップの高品質は、ソーマチンのアミノ酸配列の100%を正しく配置して、自動モデル構築に成功しました。
ソーマチン内の16個のシステイン残基は8つのジスルフィド架橋を形成し、それらはすべて電子密度マップではっきりと見える。真空中長波長タンパク質結晶構造解析は新しい分野であるため、新しいサンプル処理ツールと機器を開発しました。このプロトコルは、ダイヤモンド光源のビームラインI23上の真空エンドステーションにサンプルを安全に転送する際のガイドです。
真空環境は、他のビームラインではアクセスできない波長範囲で回折実験を行うユニークな機会を開きます。長波長X線結晶構造解析により、天然結晶から直接高分子を実験的に段階的に測定することができます。また、分子に結合したイオンの明確な同定も可能になる。
概要
この記事では、Diamond Light SourceのビームラインI23での真空エンドステーションへの結晶の移動と低温サンプル調製の詳細なプロトコルを紹介します。生物学的高分子における軽い原子からの異常信号を活用する長波長高分子X線結晶解析実験に焦点を当てています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 高分子結晶解析
- 構造生物学
- シンクロトロン放射光技術
背景
- 長波長高分子結晶解析は、生物学的高分子における軽い原子からの異常信号を利用します。
- ビームラインI23は長波長実験に最適化されており、重要な生物学的要素へのアクセスを可能にします。
- 実験は空気によるX線の吸収を軽減するために真空中で行われます。
- 低温は専用のサンプルホルダーを使用して維持されます。
研究の目的
- 真空環境への結晶移動の包括的なプロトコルを提供すること。
- 移動プロセス中のサンプルの完全性を確保すること。
- 長波長X線結晶解析実験を促進すること。
使用された方法
- サンプルアクセスのためのCombiPuckの蓋とベースの分離。
- 低温保存のためのサンプルの液体窒素への浸漬。
- 正確なサンプル移動のためのパックセパレータツールの使用。
- サンプル導入のための制御された真空環境の実装。
主要な結果
- 低温保存された結晶の真空エンドステーションへの成功した移動。
- サンプルの完全性を維持するプロトコルの有効性の実証。
- 長波長高分子結晶解析の手順の検証。
- Diamond Light Sourceでの将来の実験のための信頼性の高い方法の確立。
結論
- このプロトコルは、低温サンプル移動のための堅牢な枠組みを提供します。
- 長波長X線結晶解析実験の実現可能性を高めます。
- 将来の応用は、様々な生物学的研究のためにこの方法論を基に構築できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
In-vacuum long-wavelength macromolecular crystallography on beamline I23 enables direct experimental phasing and native ion identification in proteins and nucleic acids, eliminating the need for external labeling. This capability enhances predictive confidence in structural biology, supporting early discovery and target validation inflection points across biopharma portfolios. The protocol's reproducibility and data quality facilitate risk-adjusted advancement of structural targets for downstream drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct structure solution of macromolecules using native anomalous scatterers for robust target validation.
- Supports mechanistic de-risking by unambiguously identifying biologically relevant ions and cofactors.
- Improves predictive confidence in target structure and binding site characterization.
Screening & Assay Development
- Provides high-quality, reproducible structural data for assay development and compound screening campaigns.
- Facilitates standardization of sample preparation and transfer workflows across research teams.
- Enables reliable evaluation of ligand binding and structural perturbations in validated systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural insights with disease-relevant systems by resolving native ion binding and post-translational modifications.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by preserving sample integrity and data quality.
- Supports translational biomarker identification through precise structural mapping.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing to lead identification and preclinical validation, leveraging in-vacuum crystallography for high-confidence structural outputs.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing and pathway clarification by enabling native anomalous phasing and ion identification.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative diffraction data supporting assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Provides robust statistical outputs and electron density maps for comparative analysis of structural conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by maintaining sample fidelity and enabling biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable workflow for structural studies across multiple targets and programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target structures.
- Operational Value: Standardizes sample handling and transfer, ensuring reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk through high-quality structural data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryogenic sample handling and macromolecular crystallography.
- Demands access to specialized instrumentation, including the Cryogenic Transfer System and vacuum-compatible sample holders.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation and transfer protocols.
- Adaptation may be needed for different macromolecular systems or crystal morphologies.
- Practical limitations include the need for vacuum-compatible infrastructure and specialized training.
