Name: ダイヤモンド光源におけるビームラインI23上の真空中長波長結晶構造解析のためのサンプル調製および移送プロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 学ぶ、長波長マクロ分子結晶構造解析のための低温サンプル調製・移送プロトコル。Diamond Light SourceのビームラインI23で、真空環境への結晶移送と高品質回折データ収集の手法を解説。

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Adam Taylor、Adam Prescott、Ken Jones、Arvinder Palaha、Kevin Wilkinsonが極低温サンプル移送システム(CTS)の開発を支援してくれたことに感謝します。この研究は、欧州委員会のHorizon 2020プログラムによって資金提供されたiNEXT-Discovery(Grant 871037)によって資金提供されました。

1. クリスタルハーベスティング
メモ: 可能な場合は、適切な個人用保護具(ゴーグルと手袋)を使用してください。
<ol><li>SHがコンビパックでユーザーラボに到着したら(図3C)、SHがベースに取り付けられたままになるように蓋をコンビパックのベースから分離し、バイアルを蓋に保持します。</li>
	<li>バイアルで蓋を液体窒素に浸します。磁気杖にSH+アダプター(図3B、右)を取り付け、いつものように結晶を採取します。</li>
	<li>各サンプルをコンビパックに直接フラッシュクールし、サンプルの位置を書き留めます。パックを閉じるには、パックの杖を使用してベースを蓋に取り付けます。</li>
	<li>コンビパックを液体窒素からドライシッパーまたは液体窒素貯蔵デュワーに移します。ドライシッパーをダイヤモンド(https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Common/Common-Manual/Shipping-Samples.html)に発送します。</li>
</ol>2. 真空へのサンプル移送
<ol><li>コンビパックから転送ブロックへのSHのロード<ol>
<li>空の移送ブロック(図3D)がすでに取り付けられたブロックパックのベース(図3H)を、発泡容器内の液体窒素の内側の支持ベースに置きます(図3J-b)。 注:移送ブロックの向きは、真空容器内のサンプル移送の精度にとって重要です。そのため、ブロックをブロックパックベースに配置して、 図3D の矢印でマークされたピンがブロックの左側にあることを確認する必要があります。</li>
		<li>液体窒素で満たされた発泡容器にバイアルパックを置き、パックのベースが発泡容器内の磁気ホルダーに固定されていることを確認する(図3J-a)。</li>
		<li>必要なすべてのツールを液体窒素で予冷します。高設定Hの図3Gに示すパックセパレータツールを使用して、ベースが磁気ホルダに取り付けられたままになり、SHが液体窒素の内部に露出するように、蓋をベースから分離します。</li>
		<li>アダプタから各SHを取り外すには、セパレータ杖(図3F)を使用してSHをコンビパックベースからピックアップし、 図3J-bのカルーセルの水平位置にある転送ブロックの適切な位置に配置します。<ol>
<li>セパレーターの杖をSH +アダプターの上に置き、サンプルに触れないように、杖が垂直であることを確認します。</li>
			<li>セパレータ杖の小さなレバーを親指でカチッと鳴らして下に動かし、SHを内部に固定し、SHをアダプタから引き出します。</li>
			<li>セパレータを目的のブロック位置に下げ、3本の突起のうちの1つがブロックの中央の穴の内側に収まることを確認します。</li>
			<li>レバーを上に動かして SH を離します。SH ごとにこれらの手順を繰り返します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>サンプルを次のサンプルブロックにロードするには、カルーセルキーツール(図3E)を使用して、空のブロックを水平位置に回転させます。</li>
		<li>図3Gに示すパックセパレータツールを、低設定Lでブロックパックの蓋に時計回りにねじ込みながら取り付けます。</li>
		<li>すべてのSHが移されたら、ブロックパックを閉じるには、蓋を液体窒素に入れ、温度が平衡化するのを待ってから、 図3Iのように蓋をベースに合わせます。セパレーターツールを取り付けた状態で、慎重に持ち上げてカルーセルから離します。</li>
		<li>この段階で、ブロックパックをCTS(図4B)または液体窒素貯蔵デュワーに移すことができます。</li>
	</ol></li>
	<li>真空容器への移送ブロックの装填<ol><li>シャトルがステーションにしっかりと接続されていることを確認します。窒素ガスとエアバルブを開き、ガスが流れていることを確認します。CTS の電源を入れます。</li>
		<li>ディスプレイに警告メッセージが表示されない場合は、液体窒素でバスとシャトルの両方を冷却してください。供給された漏斗をシャトルの充填口に置き、スクリーン上のレベルを監視しながら液体窒素を漏斗にゆっくりと注ぎます。インジケータが赤から青に変わったら停止します。 メモ:タッチスクリーンに表示されるコールドシートの温度が100 K未満の場合、シャトルはすぐに使用できます。サンプルステーションバスは、バスの壁にマークされたレベルまたは液体窒素レベルディスプレイに100%マークされたレベルまで、正しい漏斗を使用して同時に充填することができます。液体窒素レベルと温度センサーは、動作中常に監視する必要があります。いくつかのトップアップが必要になります。</li>
		<li>シャトルのコールドシート温度が100 Kを下回り、シャトルとバスの液体窒素レベルが安定したら、付属のパックセパレータツールを使用してブロックパックを液体窒素からCTSバスに移します。ブロックパックの蓋を外し、CTSバスの蓋を閉めます。</li>
		<li>シャトルにブロックを導入するには、CTS バルブ (まだ開いていない場合は、ディスプレイの [シャトル バルブを開く ] ボタンを押して開きます)。時計回りに90°回転させてシャトルハンドルのロックを解除し、ハンドルのガイド付きトラックがバスに向かって正しい移動経路を強制するようにバスに向かって進めます。ブロックカバーがお風呂の中に入ったら、カバーを冷やします。カバー周辺の液体窒素のバブリングが止まった後、移送ブロックに進める。</li>
		<li>トランスファーブロックをシャトルにロックするには、ハンドルを時計回りに180°回転させます。</li>
		<li>ハンドルを元の背面の位置に引っ込め、反時計回りに90°回転させて所定の位置に「ロック」します。</li>
		<li>表示画面の Close Shuttle Valve & Pump を押して、シャトルの避難を開始します。</li>
		<li>「シャトルを 取り外す準備ができました」という メッセージがタッチスクリーンに表示されたら、シャトルの下のレバーを押し、上部のハンドルを使用してシャトルを慎重に持ち上げます。</li>
		<li>シャトルを真空エンドステーションのエアロックに直立させて運びます。</li>
		<li>シャトルを真空エンドステーションのエアロックに取り付けます。 メモ:しっかりと取り付けると、エンドステーションのタッチスクリーンがシャトルとインターロックのステータスを確認します。</li>
		<li>タッチスクリーン上の対応するボタンを押し、サンプルホテルを正しい積載位置に移動することにより、船舶内の空のブロック位置を選択します。</li>
		<li>サンプルホテルの位置が整うと、[ 開く] ボタンがアクティブになります。このボタンを押すと、真空インターロックシーケンスが開始されます。 メモ:ポンプが起動し、進行状況がモニターに表示されます。この処理が完了するまでに最大 2 分かかる場合があります。</li>
		<li>シーケンスが完了すると、ステータスが エアロックオープン、転送中に変わります。ハンドルを時計回りに90°ひねってロッドのロックを解除し、ロッドを容器に静かに押し込んで、ガイド付きトラックが再びサンプルホテルの位置に向かって正しい移動経路を強制するようにします。画面に表示されたビデオフィードを使用して、ゆっくりとブロックをホテルに挿入し、タッチディスプレイのブロック位置ライトがアクティブになっていることを確認します。アクティブになったら、ハンドルを反時計回りに180°回転させてブロックを解除し、ロッドを容器から引き出します。完全に引っ込んだら、ハンドルを反時計回りに90°回転させてロッドをロックします。</li>
		<li>ロッドがロックされると、 閉じる ボタンがアクティブになります。これを押してエンドステーションの真空バルブを閉じ、シャトルと容器の間のスペースを大気圧に通気し、完了まで最大20秒待ちます。</li>
		<li>シーケンスが完了したら、ディスプレイに「 OK」という ステータスが表示されるまで待ちます。この時点で、シャトルを取り外し、CTS に戻り、次のブロックに対してこのプロセスを繰り返します。</li>
		<li>転送のために次のブロックを準備するには、バス内でブロックパックを回転させます。アクリル製の蓋の上部にある内蔵の回転 キー を、ブロックパックの中央にある ロック に押し込みます。キーを押しながら キー を回して、目的のブロックをピックアップ位置に配置します。</li>
		<li>すべてのブロックが転送されたら、CTS に取り付けられたシャトル バルブが開いていることを確認します。タッチスクリーンの ベイ ク ボタンを押し、 バス と シャトルの両方を選択してから、 ベイクを押します。 注:これはシャトルとバスの両方を暖めて液体窒素を沸騰させ、その後、次の使用前に蓄積された氷/凝縮を蒸発させます。ベークが開始されると、ガスと空気をオフにすることができます。</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

現在のプロトコルは、ビームラインI23での真空中長波長MX実験のサンプル調製要件に準拠するために開発されました。過去1年間、ビームラインで使用されており、複数のプロジェクトの成功裏の完了に貢献してきました。ここに示した結果が示すように、このプロトコルは、回折品質を維持しながら、真空エンドステーションへのサンプルの安全で信頼性の高い移送を可能にします。これはビームライン運用にとって重要な側面であり、ビームラインスタッフによる対面式ユーザートレーニングが伴います。手順のいくつかは、手順を成功裏かつ安全に完了するために重要であるとして強調する価値があります:コンビパックベースからサンプルブロックへのサンプルの転送には、サンプルの損傷を避けるために精度と注意が必要です(ステップ2.1.4を参照)。すべての段階で液体窒素レベルを監視することは、サンプルが空気にさらされたり、適切に冷却されていない部品(2.1.3および2.2.2)に密着したりしないようにするために重要です。 Close シーケンス (2.2.14) が完全に終了するまで待ってから、エンドステーションからシャトルを取り外します (2.2.15)、エンドステーションの真空度の低下を回避します。
このプロトコルの構想は、タンパク質結晶を真空環境に移送するための専用装置の開発を目的としたエンジニアリング努力とともに開始されました。このプロジェクトの最終製品は、CTSと上記の関連するサンプル処理ツールでした。CTSは、前身のLeica EM VCT10014を大幅に改善し、移送中のサンプルシールドと真空環境の欠如、液体窒素浴内の氷の蓄積、直感的なユーザーインターフェイスと安全機能の欠如など、複数の制限を取り除きます。ユーザーエクスペリエンスを向上させるCTSの追加の特徴は、シャトルとサンプルステーション内の温度と液体窒素レベルの監視、1つではなく4つのブロックを同時に収容する大容量のバス、およびシャトル操作のためのセルフガイド機構です。CTSは、ユーザーフレンドリーなタッチスクリーンインターフェースと、エンドステーションとのインターフェース時の真空および機械的安全性の向上により、ビームライン制御システムに完全に統合されています。
ビームラインI23は、この種の最初の長波長MXシンクロトロン装置であり、タンパク質結晶を高真空環境に導入し、極低温で保存するには、かなりの努力が必要でした。サンプル調製ツールとプロトコルの改善、およびプロセスを合理化するための取り組みは進行中です。ユーザーサポートの一環として、ビームラインスタッフは常にトラブルシューティングを支援します。そのようなシナリオの1つの例は、真空システムの完全性を損なう問題であり、CTSまたはエンドステーションエアロックのいずれかにシャトルを取り付けたり取り外したりすることが困難になります。さまざまなレベルのテストが毎週および毎日実行され、ユーザートレーニングでは、シャトルが接続するインターフェイス上のOリングの目視検査など、潜在的な障害を回避するための追加のチェックをカバーします。真空環境は、他のビームラインではアクセスできない波長範囲で回折実験を行う機会を開きますが、追加の転送ステップは、全体的なサンプルスループットを低下させます。
搬送ブロックあたりわずか4サンプル、真空容器内の最大5ブロックの手動搬送では、総容量が20サンプルに制限されます。したがって、サンプル間の変動が大きいプロジェクトでは、サンプルをダイヤモンドハイスループットビームラインで事前にスクリーニングし、その後の最適化された長波長実験のために最も有望なサンプルのみを転送する必要があります。サンプルホルダーとトランスファーブロックは数年前の最初の導入から変わっていませんが、ここで紹介するハンドリングツールはすべて新しい開発です。I23専用サンプルホルダーは、ビームラインの冷却コンセプトにおける役割のために不変です。そのため、サンプルハンドリングツールの設計は、この新しいタイプのホルダーと、MXユーザーコミュニティが長い間採用してきた標準的な市販ツール(コンビパック、クリスタルハーベスティングワンド、ドライシッパー輸送システムなど)との間のリンクを作成することを目的としていました。彼らの設計には、ユーザーコミュニティとの重要な協議が必要であり、完了するまでに数回の反復が必要でした。ここで紹介する機器、ツール、プロトコルは、ダイヤモンド光源のビームラインI23での実験のためのユーザーサンプルを転送するためのシンプルで堅牢なシステムを表しています。真空中長波長高分子結晶構造解析のためのこの装置は、構造生物学のための新しい機会を開きます。

長波長X線回折は、巨大分子に天然に存在する特定の光原子の異常な散乱特性を利用するために使用される。これは、結晶学的相の問題を解決し、巨大分子内のそのような元素の同一性および位置を明確に確認するのに役立つ。高分子結晶学の黎明期には、 de novo 構造は複数の同形置換によって解決されましたが1、シンクロトロンでの同調可能なX線ビームラインの出現により、多波長および単一波長(SAD)異常回折技術に基づく実験的フェージングが支配的な方法になりました2.どちらの方法も歴史的に重金属からの同形または異常なシグナルに依存しており、共結晶化または結晶浸漬によって人工的に結晶に導入する必要があります3。試行錯誤のアプローチと予測不可能な結果は、これらの実験をイライラさせるほど時間がかかる可能性があります。タンパク質発現中のセレノメチオニンの取り込み4は、 これらの制限を克服し、短波長での異常な回折を利用するための非常にエレガントな方法ですが、真核生物のタンパク質発現系では非常に困難な場合があります。
長波長MXは、さらなる治療を行わずに成功した結晶化試験から直接結晶を使用する利便性のために、ネイティブSAD実験5,6による構造決定に非常に魅力的です。さらに、カルシウム、カリウム、塩素、硫黄、リンなどの生物学的に重要な元素の吸収端にアクセスすると、巨大分子中のこれらの元素の位置を直接特定する機会が開かれます7,8,9,10。中分解能および低分解能では、2Fo-Fc電子密度および化学環境に基づく元素割り当ては、特に電子数が同程度または部分的に占有する弱く結合したイオンを有する元素では困難であり得る。これらの曖昧さは、関心のある要素の吸収端の下方および上方のデータを収集し、結果として生じるモデル位相異常差フーリエマップ11、12の解釈によって解決することができる。これらのマップで硫黄原子の位置を特定することは、低分解能電子密度マップへのモデル構築にも役立ちます13。これらの軽元素の吸収端は、λ = 3 ~ 6 Å の間の波長で観察されます (図 1、上を参照)。この波長範囲は、シンクロトロンMXビームラインの能力をはるかに超えており、この範囲での効率的な運用には、以下に概説するように、いくつかの技術的課題を克服する必要があります。
英国のダイヤモンド光源にあるビームラインI23は、λ = 1.13〜5.9Å(E = 2.1〜11keVのエネルギー範囲)の波長範囲で調整可能な、長波長MX実験を容易にするために特別に設計されたユニークな装置です。高真空環境で動作することにより14、空気の吸収と散乱が排除され、その結果、回折実験の効率と信号対雑音比が向上します。大きな真空エンドステーションには、半円筒形のPilatus 12M検出器、多軸ゴニオメーター、オンライン表示およびコリメーションシステム、サンプルの移送と保管のための特注機器など、サンプル環境のすべてのコンポーネントが含まれています(図2)。各機器は、最高品質の長波長データを収集できるように最適化されています。湾曲したPilatus 12M検出器は、回折角2θ = ±100°まで収集できるため、最長波長でも十分に高分解能の回折データが得られます(図1、下段)。120個の検出器モジュールは、低エネルギー互換性のために特別に選択され、追加の超高利得モードのための較正が提供されています。
検出器のスレッショルドは1.8keVと最も低く、3.6keV未満のエネルギーではコーナーとエッジの影響が大きくなり、最長波長、特にモザイ度の低い結晶ではデータ品質の低下が観測されます。この効果は、検出器量子効率15の低下と相まって、実験を計画する際に考慮する必要がある。多軸ゴニオメーターは、結晶の向きを変えることを可能にし、異常な信号の品質と強度、および収集された異常なデータの完全性を最大化するデータ収集戦略を可能にします。サンプル吸収は、特に最長波長での実験の制限要因です。吸収補正は、一般的に使用されるMX処理ソフトウェアパッケージ16,17で実装されているように、3Å前後の波長に対してうまく機能しています。より長い波長では、断層再構成18またはレーザーアブレーションに基づく分析吸収補正が必要となり、非回折性物質を除去し、結晶をはっきりとした形状に切断します19。後者は、より長い波長でのX線回折実験がより小さな結晶に対してより効率的であるため、より大きな結晶のサイズを小さくするのにも役立ちます14。データ収集中にサンプルを極低温に保つという課題は、オープンフローの低温ガス流デバイスを使用することは真空環境と互換性がないため、導電性冷却によって対処されます。したがって、サンプルをパルス管クライオクーラーに接続するには、銅などの熱伝導性材料が必要です。MX全体で使用されるステンレス鋼のSPINE標準ピン、およびその他の市販のサンプルマウントは、熱伝導率が低いため、真空中長波長MXには適していません。
真空中MXのサンプルホルダ(SH)は、除熱熱経路の重要な部分でなければなりません(図3A)。このように、それらは熱伝導性の銅体とピンで構成され、2つの重要な特徴を含みます:冷たいゴニオメータヘッドへの適切な熱リンクを確保するための強力な磁石ベースと、X線吸収と散乱を最小限に抑えるためのポリイミド製のサンプルマウント20。クリスタルハーベスティングとフラッシュ冷却のユーザーエクスペリエンスが、標準的なMXプラクティスに関連するものとほぼ同じであることを保証するための努力が払われました。専用のI23 SHは他のシンクロトロンビームラインと直接互換性がないため、他のMXビームライン上の結晶収穫磁気ワンドおよび既存のゴニオメータインターフェースとの互換性のためにステンレス鋼アダプタが使用されます(図3B)。このアダプターは、ALSタイプのロボットグリッパーヘッド21とunipuckスタイルのベースレイアウト22に基づく他のDiamond MXビームラインの自動化機能を利用するためにも重要です。サンプル調製およびローディングプロトコルは、次の 2 つの段階に分けることができます。
ステージ1:結晶の収穫と、ユーザーが自分の研究室で行うフラッシュフリーズ
I23データ収集に対するプロジェクトの適合性の評価後、水晶サイズに一致するループ(アダプターで事前に組み立てられた)を備えたサンプルホルダーは、結晶収穫のためにユーザーラボに送られます。損傷を防ぐために、SHとアダプターは分離してはならず、標準的な水晶採取磁気杖を使用して適切なサイズのループで水晶を釣る目的で1つのユニットとして使用する必要があります。MXでよくあるように、この作業は顕微鏡下で手動で行われ、結晶は液体窒素23による泡のデュワーで直ちにフラッシュ冷却される。磁力の不一致のため、SHは現在ユニパックと互換性がありません。保管と出荷は、コンビパック( 材料表を参照)を使用して実現され、要求に応じてユーザーが利用できるとともに、互換性のあるドライシッパーインサート(図3C)を使用します。これらのパックは、広く使用されているユニパックと同じベースプレートを共有し、他のDiamond MXビームラインでのサンプルの迅速な事前スクリーニングを可能にします。この機器をユーザーに貸与することは、オーダーメイドのサンプルホルダーが市販されるまで、現在最良の取り決めです。ビームラインへの輸送には、MXコミュニティで使用される標準的なドライシッパーが必要です。
ステージ2:真空端電場への凍結冷却サンプルの移送
サンプルがビームラインに到着すると、真空エンドステーションへの移送の準備が整います。これには、コンビパックからのSHの除去とアダプターからの分離が含まれます。真空への生体試料の導入は、クライオ電子顕微鏡の分野で日常的に行われている。十分に確立された概念のいくつかは、I23サンプル転送に適合しました。要するに、SHは液体窒素下で移送ブロック上に転写されます(図3D)。これらのブロックは、優れた熱伝導率と顕著な熱質量を有し、真空中に結晶がガラス転移温度に達するのを防ぎます。最大4つのブロック(それぞれ4つのサンプルの容量を持つ)は、液体窒素の下でブロックパックにロードされ(図3H)、サンプルを極低温移送システム(CTS)に移送するか、実験間の液体窒素デュワーに保管するために使用されます。
ダイヤモンド光源で開発された極低温搬送システムは、サンプルステーションとシャトルの2つのサブアセンブリで構成されています(図4A)。サンプルステーションは、タンパク質結晶を一時的に保管するための液体窒素浴で構成され、安全性を確保し、ユーザーフレンドリーな体験を可能にする特定の機能を備えています(図5)。CTSは、ユーザーフレンドリーなタッチスクリーンインターフェースを介してプログラム可能なロジックコントローラによって制御されます。サンプルステーションには、より優れた視覚化のために発光ダイオードが組み込まれており、サンプルが移送された後の液体窒素浴の乾燥を自動化するためにクローズループで制御される一連のヒーターがあります。また、システムの安全性と効率的な機能を保証するためのさまざまなセンサーも備えています。サンプルステーションは、サンプル移送のための粗い真空へのポンピング、液体窒素レベルとシャトル内の温度の監視など、操作のためにシャトルと対話するための信頼性の高い電気インターフェースを提供するオーダーメイドのハードウェアを備えています。
シャトル(図6)は、サンプルステーションの液体窒素浴から移送ブロックを拾い上げ、極低温および真空環境内でエンドステーションに移送するために使用されるポータブルデバイスです。これには、移送中にサンプルを低温に保つための液体窒素デュワー、デュワー内の液体レベル監視、および操作とユーザーの安全のためのさまざまなセンサーが含まれています。トランスファーアームには磁気ドライブが装備されており、機械加工された溝が含まれており、ユーザーがトランスファーブロックをエンドステーションに安全にロードおよびアンロードできるようにガイドします。シャトルから真空容器への移動は、エアロックを介して行われる。エアロックは、シャトルとエンドステーションの真空バルブを開く前に、シャトルとエンドステーションの間のインタースペースを排気するために使用されるエンドステーション上のシャトルのインターフェースです。ポンピングシーケンスとベントシーケンスは完全に自動化されており、ユーザーフレンドリーなインターフェースを備えた大型タッチスクリーンを介して操作できます(図4C)。現在のプロトコルは、データ収集のためにソーマチン結晶を真空エンドステーションに転送するために使用されます。

<table><tbody><tr><td>12M検出器</td><td>Dectris, Switzerland</td><td></td><td>単一光子計数用X線検出器</td></tr><tr><td>CombiPuck</td><td>MiTeGen</td><td>SKU: M-CBP-P1</td><td>Cryopucks I23サンプルホルダーとサンプルの極低温保存と輸送に使用</td></tr><tr><td>クリスタルハーベスティング磁気ワンド</td><td>分子寸法</td><td>MD7-411</td><td></td></tr><tr><td>ドライシッパー(CX100)</td><td>分子寸法</td><td>MD7-21</td><td>I23サンプルホルダーとサンプルの極低温保管と輸送に使用</td></tr><tr><td>ドライシッパーインサート(CombiPuck Transport Cane)</td><td>MiTeGen</td><td>SKU:M-CBP-PTC1</td><td>I23サンプルホルダーとサンプルカ</td>プトンポリイ</tr><tr><td>ミド</td><td></td><td></td><td>の極低温保管と輸送に使用カプトンポリイミド製のサンプルマウント</td></tr>、<tr><td>パーセックス蓋</td><td></td><td></td>、<td>回転キー内蔵アクリル蓋</td></tr>、<tr><td>タウマチンパウダー</td><td>&nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>T7638</td><td>蒸気拡散によるソーマチン結晶の製造に使用</td></tr></tbody></table>

ダイヤモンド光源におけるビームラインi23上の真空中長波長結晶構造解析のためのサンプル調製および移送プロトコル

Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

長波長高分子結晶構造解析(MX)は、硫黄、リン、カリウム、塩素、カルシウムなど、高分子に天然に存在することが多い元素の異常な散乱特性を利用します。これにより、追加の標識を必要とせずに実験的な段階的段階的処理を介してタンパク質および核酸の直接構造溶液が可能になる。この波長レジームにおけるX線の有意な空気吸収を排除するために、これらの実験は真空環境で行われる。英国のダイヤモンド光源にあるビームラインI23は、5Åまでの長波長範囲でのMX実験用に設計および最適化された、この種の最初のシンクロトロン装置です。 
これを可能にするために、大きな真空容器はサンプル環境のすべての終端コンポーネントを囲んでいます。真空中での保管およびデータ収集中にサンプルを極低温に維持する必要性は、熱伝導性サンプルホルダーの使用を必要とする。これにより、効率的な熱除去が容易になり、サンプルを約50Kまで冷却できます。現在のプロトコルは、サンプル調製とビームラインI23上の真空へのサンプルの移送に使用される手順を説明しています。高分子結晶構造解析コミュニティ内ですでに確立されている実践と方法の均一性を確保し、液体窒素温度へのサンプル冷却は、標準的なMXツールを備えた任意の実験室設定で実行できます。 
サンプルの極低温貯蔵および輸送は、標準的な市販の装置のみを必要とする。極低温で冷却された結晶を液体窒素から真空エンドステーションに移送するには、特殊な装置が必要です。オーダーメイドのサンプル処理ツールと専用の極低温搬送システム(CTS)が社内で開発されています。このプロトコルを使用して調製されたサンプルで収集された回折データは、優れたマージ統計を示し、サンプルの品質が手順中に変化しないことを示しています。これにより、標準的なシンクロトロンビームラインを超える波長範囲の真空中MXのユニークな機会が開かれます。

ソーマチン結晶を、上記で概説したプロトコルを用いて真空端局に導入した。回折データは、波長2.7552 Å(E = 4500 eV)で、1画像あたり0.1°の回転増分および0.1秒の露出を有する3600画像として収集された。ビームサイズを150 μm x 150 μmに調整し、透過率を10%に低減し、対応するフラックス測定は7.1 x 109 光子/秒でした。λ = 2.7552 Åの選択は、異常な信号とサンプル吸収効果の増加と、より長い波長への分解能の低下との間の妥協点に基づいています。硫黄の理論吸収端(λ= 5.0095 Å)には近くないが、この波長では、硫黄f"の散乱係数に対する想像上の寄与は1.57e- であり、1.7〜2Åの間の波長と比較して1.6〜2.1の係数が大きい。その結果、より強い異常信号により、より困難なプロジェクトでS-SADフェージングを成功させることができます。
ビームラインI2324、25、26、27では、この波長で収集されたデータを用いて、さまざまな困難な段階的実験がすでに行われています。S-SADによる位相調整ははるかに短い波長を使用して可能ですが、多くの場合、多くの同形結晶からのデータをマージして異常な信号を構築して10028を超える多重度値に達する必要があります。より長い波長での異常信号の強化により、I23で解決されたほとんどのフェージングプロジェクトでは、1つの水晶振動子からのデータしか必要ありませんでした。代表的な回折像を図7左に示す。Xia2-3dii29を使用したデータ処理は、表1に概説されているように、優れたマージ統計を生成しました。図7(右)は、ソーマチンデータセットの代表的な回折画像の一部を示し、ブラッグ反射を囲む低い背景を示していますが、これは真空セットアップで典型的に観察される大きなI / σ(I)値に寄与し、サンプルによって散乱されたX線のみが検出器に到達することを保証します。
達成可能な最大分解能1.8Åは、検出器の形状とX線放射の選択された波長によるものです。データセットは非常に強い異常信号を生成し、異常正規確率パラメータの中間勾配2.677に反映され、自動フェージングパイプラインCRANK2による構造解を容易にした。得られた電子密度マップの高品質は、Crank231内のBuccaneer30モジュールによる自動モデル構築に成功し、ソーマチンのアミノ酸配列の100%を正しく配置することができました。ANODE11で計算された段階的異常差フーリエマップは、表2の異常散乱体の位置におけるピークの18の有意な高さによって確認されるように、2つの代替立体配座を有するCys159からの16個の非常に整然とした硫黄原子および1個の硫黄原子を明らかにする。ソーマチン内の16個のシステイン残基は8個のジスルフィド架橋を形成しており、これらはすべて2Fo-Fcマップにおいて明瞭に見える(図8)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig01.jpg"> 図1:長波長MX実験による高分解能回折データ。 (A)エネルギーに対するf"値のプロットは、ビームラインI23上でアクセス可能な軽元素の吸収端を示す。(B)エネルギーに対してP12M検出器の角で達成可能な最大分解能。略語:MX =高分子結晶構造解析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig02.jpg"> 図2:エンドステーションのすべてのコンポーネントを含む真空容器を通る水平断面。 省略形: OAV = 軸上表示システム。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig03.jpg"> 図3:サンプル処理ツール 。(A)I23サンプルホルダー(B)アダプター付きI23サンプルホルダー(右)の横のMXスパイン標準ピン(左)。( C) I23サンプルホルダー付きコンビパック蓋とベース(青)。ブロックパックの蓋と2つの転送ブロック(金)を備えたベース。コンビパックとブロックパックの両方と互換性のあるドライシッパーステッキが背面に表示されます。 (D) 4つのI23サンプルホルダーを備えたトランスファーブロック。 (E) ブロックパックベースの回転に使用されるキーツール。 (F) セパレータ杖。 (G) 高と低の設定を示す2つの矢印を持つパックセパレータツール。 (H) 4つの空のCuブロックを持つブロックパックベース。 (I) ブロックパックの蓋。 (J) サンプルホルダーをコンビパックベースから銅ブロックに移すために必要なすべてのツールを備えたフォーム容器。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig04.jpg"> 図4:極低温搬送システム(A)シャトルが取り付けられ、充填に使用される漏斗を備えたCTSサンプルステーション。(B) CTS の内側に 2 つの転送ブロックを配置したブロックパック。 略語:CTS =極低温移送システム。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig05.jpg"> 図5:極低温搬送システムサンプルステーション 略語: LED = 発光ダイオード;LN2 = 液体窒素。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig06.jpg"> 図6:極低温搬送システムシャトル 略語: LED = 発光ダイオード;LN2 = 液体窒素。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig07.jpg"> 図7:回折画像。左は、 ソーマチン結晶上に収集したデータセットからの回折画像である。 右は、低カウントの背景ピクセルで囲まれた回折スポットです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig08.jpg"> 図8:自動パイプラインCRANK2(デフォルト設定、その後の改良なし)によるソーマチンの構造解。(A)1.6σの2Fo-Fcマップ(青)と5σの段階的異常差フーリエマップをANONODE(緑)で計算したソーマチンの概要。(B)5σにおける位相異常差フーリエ写像のみを示すソーマチンの概要。(C)1.6σ(青色)の2Fo-Fcマップと5σの段階的異常差フーリエマップを有するソーマチンに存在するジスルフィド橋のクローズアップ図。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig08large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>名前</td>
			<td>ソーマティン</td>
		</tr>
<tr>
<td>データ収集波長 (Å) (エネルギー (eV))</td>
			<td>2.7552 (4500)</td>
		</tr>
<tr>
<td>画像数×ウェッジサイズ(°)</td>
			<td>3600×0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>スペースグループ</td>
			<td>
P 41212</td>
		</tr>
<tr>
<td>単位セル定数</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>(a = b, c)(Å)</td>
			<td>57.8, 150.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>(α = β = γ)(°)</td>
			<td>90</td>
		</tr>
<tr>
<td>解像度 (Å)</td>
			<td>150.22–1.80 (1.84–1.80)</td>
		</tr>
<tr>
<td>完全</td>
			<td>96.3 (81.1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>イサ</td>
			<td>36.48</td>
		</tr>
<tr>
<td>ルメアス</td>
			<td>0.042 (0.118)</td>
		</tr>
<tr>
<td>リピム</td>
			<td>0.01 (0.049)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC1/2 ·</td>
			<td>1 (0.989)</td>
		</tr>
<tr>
<td>I/σ(I)</td>
			<td>57.9 (14.7)</td>
		</tr>
<tr>
<td>多様 性</td>
			<td>15.0 (5.4)</td>
		</tr>
<tr>
<td>ミッドスロープ</td>
			<td>2.677</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:ビームラインI23、DLSにおける波長2.755Åでのソーマチンのデータ収集と処理統計。解像度、完全性、Rmerge、Rmeas、Rpim、CC1/2、I/σ(I)、および多重度のために、高解像度シェルは括弧内に示されています。略語: DLS = ダイヤモンド光源。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>最も近い原子</td>
			<td>ピーク高さ(シグマ)</td>
		</tr>
<tr>
<td>サイス9</td>
			<td>25.83</td>
		</tr>
<tr>
<td>サイス56</td>
			<td>25.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>メット112 ·</td>
			<td>24.54</td>
		</tr>
<tr>
<td>サイス149</td>
			<td>24.37</td>
		</tr>
<tr>
<td>サイス126</td>
			<td>24.21</td>
		</tr>
<tr>
<td>サイス145</td>
			<td>24.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>サイス134</td>
			<td>23.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>サイス177</td>
			<td>23.48</td>
		</tr>
<tr>
<td>サイス204</td>
			<td>23.43</td>
		</tr>
<tr>
<td>サイス66</td>
			<td>23.17</td>
		</tr>
<tr>
<td>サイス164</td>
			<td>22.54</td>
		</tr>
<tr>
<td>サイス193</td>
			<td>22.15</td>
		</tr>
<tr>
<td>サイス158</td>
			<td>21.51</td>
		</tr>
<tr>
<td>サイス77</td>
			<td>21.21</td>
		</tr>
<tr>
<td>サイス121</td>
			<td>20.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>サイス71</td>
			<td>19.17</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS159_1</td>
			<td>12.27</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS159_2</td>
			<td>8.34</td>
		</tr>
</tbody></table>表2:異常な差 CRANK2から段階的かつ自動的に構築されたモデルを使用してANANOによって計算されたフーリエマップピーク高さ。

ここでは、長波長高分子X線結晶構造解析実験のために、ダイヤモンド光源のビームラインI23上の真空端局への極低温サンプル調製および結晶の移送のためのプロトコルを提示する。

ダイヤモンド光源におけるビームラインI23上の真空中長波長結晶構造解析のためのサンプル調製および移送プロトコル

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

長波長高分子結晶構造解析は、タンパク質や核酸に天然に存在する光原子からの異常なシグナルを利用します。この技術は、結晶学的顔の問題を実験的に解決し、これらの元素の同一性と位置を決定するために使用されます。ダイヤモンド光源のビームラインI23は、最大5オングストロームの長波長での実験に最適化されたユニークなシンクロトロン装置です。これにより、カルシウム、カリウム、塩素、硫黄、リンなどの生物学的関連性の高い元素の吸収端にアクセスできます。長波長レジームでは空気によるX線の有意な吸収のために、これらの実験は真空環境で行われる。真空環境内の極低温でサンプルを維持するために、結晶は専用の熱伝導性サンプルホルダーに取り付けられています。液体窒素から真空エンドステーションへの極低温サンプル移送は、クライオ電子顕微鏡で使用される技術と非常によく似ています。このプロトコルは、ダイヤモンド光源で開発されたツールと機器を使用して結晶を真空環境に移送する手順を示しています。まず、サンプルホルダーがベースに取り付けられたままになり、バイアルが蓋に保持されるように、蓋をCombiPuckのベースから分離します。バイアルで蓋を液体窒素に浸し、サンプルホルダーとアダプターを磁気杖に取り付けて結晶を採取します。各サンプルを冷却してCombiPuckに直接流し、サンプルの位置を確認します。パックを閉じるには、パックの杖を使用してベースを蓋に取り付けます。CombiPuckを液体窒素から乾式荷送人または貯蔵庫に移します。空の移送ブロックをすでに取り付けたブロックパックのベースをフォーム容器内の支持ベースに置き、液体窒素で満たします。次に、液体窒素を充填した発泡容器にCombiPuckを入れ、パックのベースが発泡容器内部の磁気ホルダに固定されていることを確認する。必要なすべてのツールを液体窒素で予冷します。次に、パックセパレータツールを使用して蓋をベースから分離し、ベースが磁気ホルダーに取り付けられたままになるように、サンプルホルダーを液体窒素の内部にさらします。分離器の杖をサンプルホルダーとアダプターの上に置き、できるだけ下まで置き、杖が垂直であることを確認します。セパレーター杖の小さなレバーを親指で下へ動かし、カチッと音がしてサンプルホルダーを内部に固定し、サンプルホルダーをアダプターから引き出します。セパレータを目的の転写ブロックの位置に下げ、3本の突起のうちの1つが転写ブロックの中央の穴の内側に収まることを確認します。レバーを上に動かしてサンプルホルダーを離します。サンプルを次の転送ブロックにロードするには、カルーセルキーツールを使用して空の転送ブロックを水平位置に回転させます。すべてのサンプルホルダーが移されたら、蓋を液体窒素に入れてブロックパックを閉じます。温度が平衡化するのを待ってから、蓋をベースに合わせ、静かに持ち上げてカルーセルから解放します。ステーションにシャトルを取り付けます。窒素ガスとエアバルブを開き、ガスが流れていることを確認します。次に、CTS の電源を入れます。バスとシャトルの両方を液体窒素で冷やします。付属の漏斗をシャトルの充填口に置き、スクリーン上のレベルを監視しながら液体窒素をゆっくりと漏斗に注ぎます。インジケータが赤から青に変わったら停止します。漏斗を使用して浴を液体窒素で満たします。付属のパックセパレータツールを使用して、ブロックパックを液体窒素からCTSバスに移します。ブロックパックの蓋を外し、CTSバスの蓋を閉めます。シャトルにトランスファーブロックを導入するには、時計回りに90度回転させてシャトルハンドルのロックを解除し、ハンドルのガイド付きトラックが正しい移動経路を強制するようにバスに向かって進めます。ブロックカバーが冷却されたら、ハンドルを引いてブロックをシャトルに導入します。トランスファーブロックをシャトルにロックするには、ハンドルを時計回りに 180 度回転させます。ハンドルを元の背面位置に引っ込め、反時計回りに 90 度回転させて所定の位置にロックします。表示画面のシャトルバルブポンプを閉じるを押して、シャトルの排気を開始します。「シャトルを動かす準備ができました」と「ロッドを動かさない」というメッセージが表示されたら、バルブが閉じた状態がタッチスクリーンに表示され、シャトルの下のレバーを押し、上部のハンドルを使用して慎重に持ち上げます。シャトルを真空エンドステーションのエアロックに直立させて運び、取り付けます。タッチスクリーン上の対応するボタンを押し、サンプルホテルを正しい積載位置に移動することにより、容器内の空のブロック位置を選択します。サンプルホテルの位置が決まったら、開くボタンを押して真空インターロックシーケンスを開始します。シーケンスが完了し、ステータスがエアロックオープンに変わったら、シャトルでブロックし、ハンドルを時計回りに90度ねじってロッドのロックを解除します。ロッドを容器にそっと押し込み、ガイド付きトラックがサンプルホテルへの正しい移動経路を強制するようにします。画面に表示されたビデオフィードを使用して転送ブロックをホテルにゆっくりと挿入し、タッチディスプレイのブロック位置アイコンがアクティブになっていることを確認します。アクティブになったら、ハンドルを反時計回りに180度回転させて移送ブロックを解放し、ロッドを容器から引き出します。完全に引っ込んだら、ハンドルを反時計回りに 90 度回転させてロッドをロックします。閉じるボタンを押してエンドステーションの真空バルブを閉じ、シャトルと容器の間のスペースを大気圧に通気します。エアロック ディスプレイに「取り外しOK」というステータスが表示されたら、シャトルを取り外します。シャトルをCTSバスに戻し、シャトルバルブを開くを押してシャトルを排気し、次のサンプルブロックをロードします。信号が緑色になり、ロッドを移動してOKというメッセージが表示されたら、次の転送ブロックをシャトルに導入できます。次の転送ブロックを準備するには、ブロックパックをバス内で回転させます。アクリル製の蓋の上部にある内蔵の回転キーを、ブロックパックの中央にあるロックに押し込みます。キーを押しながらキーを回して、目的の転送ブロックをピックアップ位置に配置します。すべてのブロックが転送されたら、シャトルバルブが開いていることを確認し、タッチスクリーンのベイクボタンを押し、バースとシャトルの両方を選択してから、ベイク開始を押します。ダイヤモンド光源の長波長高分子結晶構造解析ビームラインI23は、カルシウム、カリウム、塩素、硫黄、リンなどの生物学的に重要な元素の吸収端にアクセスでき、これらの元素をフェージングまたは巨大分子内で位置決めするために使用できる強化された異常信号を与える。回折データは、波長2.75オングストロームの単一のソーマチン結晶から収集され、より長い波長での異常信号の増加とサンプル吸収効果との間の妥協点として選択された。真空セットアップにより、サンプルによって散乱されたX線のみが検出器に到達し、ブラッグ反射の周囲に低い背景が提供されます。データセットは非常に強い異常信号を生成し、自動フェージングパイプラインCRANK2による構造ソリューションを容易にしました。得られた電子密度マップの高品質は、ソーマチンのアミノ酸配列の100%を正しく配置して、自動モデル構築に成功しました。ソーマチン内の16個のシステイン残基は8つのジスルフィド架橋を形成し、それらはすべて電子密度マップではっきりと見える。真空中長波長タンパク質結晶構造解析は新しい分野であるため、新しいサンプル処理ツールと機器を開発しました。このプロトコルは、ダイヤモンド光源のビームラインI23上の真空エンドステーションにサンプルを安全に転送する際のガイドです。真空環境は、他のビームラインではアクセスできない波長範囲で回折実験を行うユニークな機会を開きます。長波長X線結晶構造解析により、天然結晶から直接高分子を実験的に段階的に測定することができます。また、分子に結合したイオンの明確な同定も可能になる。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

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ダイヤモンド光源におけるビームラインI23上の真空中長波長結晶構造解析のためのサンプル調製および移送プロトコル

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