薄層クロマトグラフィーによるマイコバクテリアの脂質組成の解析
April 16th, 2021
広範囲のマイコバクテリアの細胞壁の総脂質含有量を抽出するプロトコルが提示される。さらに、異なる種類のマイコール酸の抽出および分析プロトコルが示されている。これらのマイコバクテリア化合物をモニタリングする薄層クロマトグラフィープロトコルも提供される。
マイコバクテリア脂質は、属の重要な特徴であり、宿主のマイコバクテリア相互作用において重要である。速度および多様性はこのプロシージャの主な利点である。この方法は、脂質の役割とマイコバクテリアの病原性と免疫刺激効果を理解するために使用することができます。
非共有結合脂質抽出の場合、1~2個のクロロホルムの15ミリリットルを、層流フードの下にPTFEライナースクリューキャップを備えたガラスチューブにメタノール溶液を加えます。次に、固形培地から200ミリグラムのマイコバクテリアを掻き、マイコバクテリアをガラス管に加えます。一定の攪拌でチューブを一晩インキュベートします。
翌日、フィルターペーパーが並んだガラス漏斗を通して有機溶剤をガラス管にろ過します。窒素ガスフラックスを使用した後、チューブ内の液相を蒸発させ、チューブを窒素ガスで満たし、チューブを摂氏4度で貯蔵する。次に、2から1クロロホルムの15ミリリットルを加えて、メタノール溶液を細胞の破片に加え、一定の攪拌しながらチューブを一晩インキュベートします。
翌日の朝、パスツールピペットを使用して有機溶剤をフィルター用紙に入れ、同じガラスコレクションチューブに有機溶剤を移す前に、混合物を1時間休ませてください。次に、示されているように液相を蒸発させ、4°Cの貯蔵のために窒素ガスでチューブを補充する。マイコチル酸抽出では、2~5ミリリットルの攪拌溶液と200ミリグラムのマイコバクテリアバイオマスを、PTFEライナースクリューキャップ付きの気膜ガラスチューブに加え、渦巻きで内容物を混合します。
一晩摂氏80度で乾燥した浴の中で混合物をインキュベートします。翌日、チューブが室温を冷却したら、2ミリリットルのNヘキサンを加え、渦を加え30秒間混ぜます。2つの明確な相が現れるまでチューブを沈着させ、上のNヘキサン相を新しいチューブに移します。
チューブの内容とNヘキサンの2つの追加のミリリットルを混合し、再び上層を収集します。次に、窒素流でチューブの内容物を蒸発させ、実例のように窒素で覆われた試料を摂氏4度で保存します。TLCがTLCチャンバの1つの壁を濾紙で覆うことでサンプルを分析するには、チャンバーコーナーにワセリンを加えてチャンバを密閉し、溶媒混合物を濾紙の上に入れ、溶媒の残りの体積をTLCチャンバの底に加えることができます。
TLCチャンバーを少なくとも20分間閉じて飽和させます。一方、クロロホルムの200〜1000マイクロリットルでガラス管に脂質を溶解し、キャピラリーガラスチューブを使用して10マイクロリットルの脂質クロロホルム懸濁液をTLCプレートに直接塗布します。サンプルを5分間乾燥させた後、飽和TLCチャンバーにプレートを挿入し、移動相がTLCを通って動くようにします。
溶媒がプレートの上端から1センチメートルに達したら、シリカが完全に乾燥するまでプレートを層束の下に置きます。その後、乾燥したプレートに15~20ミリリットルの10%モルデータリン酸水和物をエタノールに入れ、プレートが明るい黄色になるまでスプレーし、120°Cで2~5分間加熱します。本代表分析では、各種マイコバクテリア種から抽出したマイコリン酸を、2つの異なる溶出系と2次元TLCを用いて1次元TLCを介して分析した。
また、5種類のマイコチル酸の存在を確認するために、2種類のメチル化手順を行った。両方の溶出系において、ミコグル酸はプレートの真ん中にほぼ位置していたが、5種類のマイコリン酸に対応するスポットは、鹸化後にのみ観察された。2次元TLCはまた、個々のマイコチル酸タイプの同定を可能にする。
例えば、1種類のマイコ酸酸のみを発現するブルマエミ菌、BCGはタイプ1と4を発現するマイコバクテリウム・ボビス、タイプ1と5を発現する抗酸菌、およびタイプ1と2つのマイコチル酸プロファイルを発現する抗酸菌のアブセッサス。各種マイコバクテリア種からの総脂質抽出物を、その極性と大きさの機能で分析した。PDIMのようなほとんどのA極性脂質は、BCGのマイコバクテリウム・ボビスに存在するが、抗酸菌のフォルツイタム、ブルマエ、Mabcessusの平滑形態型には存在しないことを明らかにしている。
フェノール糖脂質は、BCGのマイコバクテリウムボビスにのみ存在し、一方、グリコペプチド脂質は、抗酸菌アブセッサスからのサンプルでのみ観察される。マイコール酸と同様に、アシルグリセロールおよびPDDM、PIMsは、1次元TLCまたは2D TLC分析を通じて容易に視覚化することができる。2種類の汚れを用い、1次元TLCでPINを明らかにした。
このプロトコルを試みるときに覚えておかなく最も重要なことは、手順全体でプラスチック製の機器を使用しないことです。
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概要
この記事では、さまざまなマイコバクテリアの細胞壁から総脂質含有量を抽出するためのプロトコルを提示しています。また、さまざまな種類のマイコール酸の抽出と分析方法を詳述し、これらの化合物をモニタリングするための薄層クロマトグラフィープロトコルも含んでいます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 微生物学
- 生化学
- 病原性
背景
- マイコバクテリアの脂質は宿主との相互作用を理解する上で重要です。
- これらの脂質はマイコバクテリアの病原性に重要な役割を果たしています。
- 脂質の抽出を理解することで、その免疫刺激効果の研究に役立ちます。
- 説明されている方法は、脂質分析にスピードと汎用性を提供します。
研究の目的
- マイコバクテリアからの脂質抽出のための信頼性の高いプロトコルを提供すること。
- マイコール酸のマイコバクテリア生物学における役割を分析すること。
- マイコバクテリアの病原性メカニズムの研究を促進すること。
使用された方法
- クロロホルムとメタノールを使用した非共有結合性脂質の抽出。
- 抽出プロセスへのマイコバクテリアサンプルの組み込み。
- 完全な抽出を確実にするための一定の攪拌によるインキュベーション。
- 抽出された化合物をモニタリングするための薄層クロマトグラフィー。
主な結果
- マイコバクテリアの細胞壁から総脂質含有量の成功的な抽出。
- 分析方法を通じたさまざまなマイコール酸の同定。
- 脂質化合物のモニタリングにおける薄層クロマトグラフィーの有効性の実証。
結論
- 提示されたプロトコルはマイコバクテリアからの脂質抽出に効率的です。
- 脂質プロファイルの理解はマイコバクテリアの病原性に関する知識を向上させることができます。
- この方法は宿主とのマイコバクテリアの相互作用に関するさらなる研究に適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Comprehensive lipid profiling of mycobacteria using thin layer chromatography (TLC) enables precise characterization of cell wall components critical for understanding pathogenicity and immunomodulatory potential. This workflow supports early-stage target validation and mechanistic de-risking by distinguishing lipid classes and mycolic acid types across diverse mycobacterial species. The approach enhances predictive confidence for translational research and portfolio triage in infectious disease and immunotherapy pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of lipid-mediated virulence mechanisms and host-pathogen interactions.
- Supports functional target validation by differentiating species-specific lipid signatures.
- Facilitates mechanistic de-risking through direct visualization of mycolic acid and surface lipid diversity.
- Provides actionable data for prioritizing targets with immunomodulatory relevance.
Screening & Assay Development
- Prepares validated lipid extracts for downstream phenotypic or biochemical assays.
- Standardizes TLC-based lipid analysis for reproducible, quantitative comparison across strains.
- Enables scalable screening of lipid profiles to support compound evaluation and lead identification.
- Delivers robust platform for cross-study and cross-species lipidomic benchmarking.
Translational & Preclinical Research
- Aligns lipid biomarker profiles with disease-relevant mycobacterial models.
- Ensures continuity from discovery-stage lipid analysis to preclinical validation of immunomodulatory effects.
- Supports risk-adjusted advancement of candidates targeting lipid-mediated pathways.
- Provides mechanistic insights for translational biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
This TLC-based lipid analysis method integrates from early discovery through preclinical research, enabling hypothesis testing, target validation, and translational biomarker alignment in mycobacterial R&D.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven interrogation of lipid function and diversity in mycobacteria.
- Screening: Provides reproducible, quantitative lipid profiles for assay development and compound screening.
- Analytics: Delivers clear TLC readouts for comparative analysis of lipid classes and mycolic acid types.
- Translational Research: Connects lipidomic findings to disease models and immunomodulatory candidate evaluation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable analytical platform for broad mycobacterial lipid studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in lipid-targeted research.
- Operational Value: Standardizes lipid extraction and TLC analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by clarifying lipid-driven biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immunomodulatory and anti-infective candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lipid extraction, TLC operation, and interpretation of lipidomic profiles.
- Demands access to organic solvent handling infrastructure and glassware to avoid contamination.
- Necessitates cross-team standardization of extraction and TLC protocols for reproducibility.
- Adaptable to a wide range of mycobacterial species and model systems.
- Plastic instruments must be avoided to prevent interference with organic solvent extraction.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:33
Extraction of The Total Non-Covalent-Linked Lipids from Mycobacteria
2:13
Mycolic Acid Extraction by Acid Methanolysis
3:26
Thin Layer Chromatography (TLC) Analysis
4:57
Results: TLC Analysis of the Lipid Composition in Different Species of Mycobacteria
7:15
Conclusion
