Name: マウスの内リンパ嚢の解剖 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 34 s
Description: 学ぶマウスの内リンパ嚢の可視化とマイクロ解剖法。薄い上皮構造を持つこの組織を周囲組織から分離し、免疫組織化学やトランスクリプトーム解析などの下流応用を可能にする技術を解説する。

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<ol><li>Dror, A. A., Brownstein, Z., Avraham, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+human+and+mouse+genetics+reveals+pendrin+function+in+hearing+and+deafness%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Integration of human and mouse genetics reveals pendrin function in hearing and deafness.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 28 (3), 535-544 (2011).</li>
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<li>Honda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+underlying+fluid+absorption+by+the+developing+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture underlying fluid absorption by the developing inner ear.</a> Elife. 6, (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>EDTA 0.5 M</td><td>Crystalgen</td><td>221-057</td><td></td></tr><tr><td>1 mL TUBERCULINシリンジ、27G x 13mm</td><td>BD</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>9ウェルスポットガラスプレート</td>付き <td>Pyrex</td><td>13-748B</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-conjugated phalloidin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A34055</td><td></td></tr><tr><td>Artery&nbsp;はさみ&nbsp;- ボールチップ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14080-11</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>入射光で画像を撮影するカメラ</td><td>ライカ</td><td>DFC 495</td><td></td></tr><tr><td>蛍光画像を撮影するカメラ</td><td>ライカ</td><td>DFC 7000 GT</td><td></td></tr><tr><td>遠心チューブ 15 mL</td><td>コーニング</td><td>430053</td><td></td></tr><tr><td>遠心チューブ50 mL</td><td>コーニング</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ/ディスパーゼ</td><td>ロシュ</td><td>10269638001</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>コーニング</td><td>2940-223</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #4 鉗子</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #5 鉗子</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>デュモン#55鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>エクストラファインボンはさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>代替:エクストラファインマイクロ解剖はさみ。直;シャープポイント;20mmの刃の長さ;3 1/2インチ 全長</td><td>Roboz</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ 抗ウサギ Alexa Fluor 488-標識二次抗体</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>マイクロスライド スーパーフロスト</td><td>VWR</td><td>48311-702</td><td></td></tr><tr><td>オービタルシェーカー、例えばミニシェーカー</td><td>ダイガー</td><td>980275</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド(PFA) 16% 水溶液</td><td>電子顕微鏡Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗ペンドリン抗体</td><td>社内</td><td></td><td>RRID:AB_2713943, PB826 (Choi et al., 2011)</td></tr><tr><td>Ring Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11106-09</td><td></td></tr><tr><td>ロッキングシェーカー、例えば GyroMini</td><td>Labnet</td><td>S0500</td><td></td></tr><tr><td>PlanApo 1.0x 対物レンズを装備した実体顕微鏡</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ステンレススチール シングルエッジブレード、.009"</td><td>GEM Personna</td><td>62-0176</td><td></td></tr><tr><td>組織培養皿 60 mm</td><td>ファルコン</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>透明マニキュア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>ACROS Organics</td><td>32737-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

マウスの内リンパ嚢の解剖

Dissection of the Endolymphatic Sac from Mice

出生後5日目(P5)マウスの野生型内リンパ嚢のこのマイクロダイセクションの各ステップは、関連するビデオで詳細に説明されており、この解剖の主要なステップと内リンパ嚢の開口部のスナップショットが図1と図2に示されています。
このプロトコルに続いて、胚の 16.5 日目 (E16.5)、P5 および P30 で tdTomato 蛍光を発した内リンパ嚢の解剖の代表的な結果を図 3 および補足図 1 および補足図 2 に示します。蛍光付き解剖顕微鏡を使用すると、Cre発現:Ai9(LSL-RCL-tdT)のレポーターの存在下で、導入遺伝子Tg(ATP6V1B1-Cre)を保有するマウスの脳を切除した後、頭蓋骨内で内リンパ嚢を容易に視覚化できます(図3A-B、および解剖のさまざまな段階で内リンパ嚢の入射光とtdTomato蛍光で撮影された画像については補足図1を参照)。これらのマウスでは、Creは内リンパ嚢および内リンパ管全体に沿って細胞内でモザイクとして発現します(図3、蛍光レポーターありとなしの内リンパ嚢の視覚化については補足図2も参照してください)。このレポーターの発現は、この上皮の2つの細胞タイプの1つである内リンパ嚢16のミトコンドリアに富む細胞に限定されるAtp6v1b1の内因性発現に特異的ではありませんが(図5E)、内リンパ嚢を同定し解剖するのに役立つ補助材料です。
前庭水道の拡張のためにマウスモデルから解剖された内耳を 図4に示します。対照同腹仔と比較して、SLC26A4(ペンドリン)が不足しているマウスの内リンパ嚢と管が肥大しています。
図5に、結合組織の有無にかかわらず、無傷の内リンパ嚢の免疫組織化学の代表的な画像を示します。P5野生型マウスの開放内リンパ嚢の免疫組織化学の結果も示されています(図5F-G)。内リンパ嚢は、袋状の構造に折り畳まれた上皮の単層で構成され、その内腔に内リンパが含まれています。この上皮は、ミトコンドリアに富む細胞とリボソームに富む細胞の2つの細胞タイプで構成されています(図5E)。ホールマウントの内リンパ嚢は、内リンパが存在しなくなったため、平らになります。嚢は上皮の2つの絡み合った層として現れるため、この上皮で発現するタンパク質の細胞内局在を特定することは困難です。内リンパ嚢を開くことにより、単層上皮を容易に視覚化でき、内リンパ嚢内腔に対する目的のタンパク質の相対的な分布をより明確に決定できます。これらのタンパク質の潜在的な頂端(内リンパがある場所は管腔)と基礎の濃縮はより正確に決定できます。一例として、SLC26A4はミトコンドリアが豊富な細胞の頂端側で濃縮されています(図5F)。
<img alt="内耳解剖図、蝸牛と神経の詳細なマッピング、解剖学的研究のセットアップ。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62375/62375fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図 1.出生後5日目(P5)の野生型マウスの内リンパ嚢の全マウント解剖。 (A)発達したマウスの内耳の膜迷路の模式図(右)。内リンパ嚢の位置、および蝸牛と前庭の構造が示されています。この図はHonda et al.16から修正されています。 (B)左半頭蓋骨を示す矢状中央部。内リンパ嚢の位置が示されています(矢印)。(O、後頭部;F、前頭) (C)側頭骨の扁平上皮部分と一緒に耳嚢。 (D)パネルCの点線ボックスに重ねられた重要なランドマーク(ES、内リンパ嚢;ED、内リンパ管;VA、前庭水道;ASC、前半規管;PSC、後部半規管;CC、一般的なクリュ;SS、S状結腸洞) (E)内リンパ嚢を通るパネルDの連続した白い線に沿った断面の概略図。内リンパ嚢の近位側は、内リンパ管とともに前庭水道と呼ばれる骨管で覆われています。遠位側では、結合組織(CT)に囲まれた内リンパ嚢が骨迷路の外側に伸びて突き出ており、側頭骨の扁平上皮部分(TB)で硬膜(DM)とS状結腸洞の間に挟まれています。 (F)細い針を使用して内リンパ嚢の周りを切断します(パネルDの黄色の点線に従います)。 (G)アスタリスク(*※、パネルEにも示されている)で示された位置に組織を保持し、それを剥がすことにより、調製物を側頭骨から慎重に取り除きます。 (H)周囲の組織を持つ孤立した全内リンパ嚢。 (I)この孤立した内リンパ嚢と周囲の組織の概略図。 (J)周囲の組織のない孤立した内リンパ嚢。 スケールバー:2 mm(B)、1 mm(J)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62375/62375fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="解剖シリーズ、食道露出、解剖図、組織サンプル、使用された手術器具。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62375/62375fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 図 2.P5野生型マウスの開いた内リンパ嚢の解剖。 (A)ステップ2.4では、前庭水道の切開線をわずかに前方(赤い点線)に配置して、内リンパ嚢内腔に切開します。 (B)製剤のステム部分を持ち、内腔に27ゲージの針を挿入し、それを動かして内リンパ嚢を2枚にカットします。 (C)パネルBの概略図。 (D)各シートの端を鉗子で保持し、互いに分離します。 (E)パネルDの概略図。 (F)内リンパ嚢は、上皮と周囲の組織を含む2枚のシートに分離されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62375/62375fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="マウス脳の発達、蛍光顕微鏡、E16.5〜P30ステージ、神経組織イメージング。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62375/62375fig3v3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 図 3. R26LSL-RCL-tdT/+の解剖;Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn マウス内リンパ嚢E16.5、P5、P30。提示されたすべての画像は、tdTomato蛍光の検出用に装備された1 x対物レンズを備えた実体顕微鏡を使用して得られたtdTomato蛍光を示しています。 (A、B)E16.5 R26LSL-RCL-tdT/+の頭蓋骨の中央矢状部分。Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn マウスの(A)および(B)半脳除去前および(B)後。tdTomato蛍光は、内耳の位置を概説します。内リンパ嚢は、解剖しなくても容易に見えます(矢印)。 (C、E、G)E16.5、P5、P30マウスからそれぞれ内耳を分離した。 (D、F、H)対応する微小解剖された内リンパ嚢と管の高倍率画像。P30では、内リンパ管が骨にカプセル化されているため、分離が特に困難です。スケールバー:2 mm(A、B、C、E、G)、500 μm(D、F、H)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62375/62375fig3v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="遺伝子研究のために顕微鏡画像に示された2つの内耳切片、Slc26a4+/-とSlc26a4-/-。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62375/62375fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 図 4.肥大した内リンパ嚢を有する耳嚢の肉眼的解剖学的構造。Slc26a4+/-(左)およびSlc26a4-/-(右)マウスの内耳はP105で同腹仔を飼っています。前庭水道と内リンパ嚢および管(黒い点線)は、Slc26a4-/-マウスのものと比較してSlc26a4-/-マウスで拡大されます。スケールバー:2 mm。 この<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62375/62375fig04large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="免疫蛍光アッセイ、SLC26A4およびACTBタンパク質、上皮細胞図、顕微鏡検査結果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62375/62375fig5v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 図 5.SLC26A4 E16.5およびP5の内リンパ嚢上皮におけるミトコンドリアに富む細胞の発現。 (A、B)抗SLC26A4抗体(緑)とβ-アクチンを標識するファロイジン(ACTB、赤)で標識したE16.5マウスから単離された内リンパ嚢。 (C)抗SLC26A4抗体(緑)で標識したP5マウスの開いた内リンパ嚢の低倍率画像。ファロイジン(ACTB、赤)は、内リンパ嚢の存在とその周囲の結膜組織を強調するために使用できます。 (D)抗SLC26A4抗体で標識された単離された内リンパ嚢(緑)。 (E)頂端表面が微絨毛で覆われているミトコンドリアリッチ細胞とリボソームリッチ細胞の2種類の細胞の存在を強調した内リンパ嚢上皮の模式図。 (F-G)内リンパ嚢を開き、抗SLC26A4抗体(緑)とファロイジン(ACTB、赤)で標識した後のP5の内リンパ嚢上皮の高倍率画像。頂端膜レベルでの代表像をGに、点状の白線レベルでのzスタックから再構成した断面をFに示します。細胞の核はDAPI(青)で標識されています。 スケールバー:100μm(A、B);200 μm (C, D) ;20 μm (F, G)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62375/62375fig5v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図1.P5 R26LSL-RCL-tdT/+の入射光とそれに対応するtdTomato蛍光画像;Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mnマウスの内耳を3段階の解剖で観察します。 内リンパ嚢と内リンパ管は、tdTomato蛍光を使用して容易に視覚化できます。 (A-B)P5 R26LSL-RCL-tdT/+の無傷の半頭蓋骨の後部にある内耳の領域。Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mnマウス。 (C-D)皮膚と頭蓋骨の一部を切除することで、内リンパ嚢の領域をよりよく視覚化することができます。 (E、F)内リンパ嚢がまだ結膜組織に関連付けられている孤立した内耳。 (A、C、E)入射光で撮影された画像。(B、D、F)対応する組織のtdTomato蛍光。スケールバー:2 mm(AB)、1 mm(CF)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62375/JoVE_HondaLee_SupplementaryFigure1.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図2.R26LSL-RCL-tdT/+の単離された内リンパ嚢の蛍光の比較; E16.5およびP5の Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/MnおよびR26LSL-RCL-tdT/+同腹仔マウス。tdTomato蛍光は、内リンパ嚢と内リンパ管の認識を大幅に促進します。  (A-C)E16.5 R26LSL-RCL-tdT/+の微小解剖された内リンパ嚢;Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn (A) および R26LSL-RCL-tdT/+ 同腹仔マウス (B, C). (D-F)P5 R26LSL-RCL-tdT/+の微小解剖された内リンパ嚢;Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn (D) および R26LSL-RCL-tdT/+ 同腹仔マウス (E, F). (A、B、D、E)tdTomato蛍光。(C、F)B、Eに対応する入射光像 スケールバー:500μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62375/JoVE_HondaLee_SupplementaryFigure2.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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Research

JoVE Journal

Biology

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