都市環境のスワッピング - 環境貯留層からのSARS-CoV-2のサンプリングと検出のためのパイプライン
2021年4月9日
市民科学プロジェクトは、SARS-CoV-2の環境サンプルを収集するためにサンディエゴの住民を募集するように設計されました。多言語 Web ベースのプラットフォームは、使いやすいモバイル デバイス インターフェイスを使用してデータ送信用に作成されました。ラボ情報管理システムは、リアルタイムの結果追跡により、数千もの地理的に多様なサンプルの収集を促進しました。
この研究は、ガスポンプハンドル、遊び場、ATMなど、都市環境でほとんど洗浄されない表面上のSARS-CoV-2を検出するための新しいワークフローを提示する。パンデミックでは、物資が不足しています。簡単に入手できる材料や試薬、装置を基本的な実験室で利用しています。
RNAをコールドチェーンなしで保存する抽出法と、阻害剤に耐性のある検出方法を使用しています。このプロトコルは公衆衛生上の利益です。これは、将来の世界的な流行の間に現在のCOVID-19パンデミックおよび他の感染性薬剤のための環境ウイルス貯留層の評価のためのフレームワークを提供する。
地元やソーシャルメディアを通じてリリースされた行動への直接的かつ明確な呼びかけを使用して市民科学者を募集します。ソーシャル メディア のコンテンツ間でトピックを接続するためのソーシャル メディア ハンドルを作成します。オンラインフォームで指定されたバイオセーフティ関連の質問に答えることによって、個人が環境サンプリングの取り組みに参加するために適用できるように、多言語でナビゲーションを可能にする多言語プラグインを提供し、SMPへのリンクを作成します。
英語とスペイン語のサンプリング セクショングラフィックとオーディオビジュアル プロトコルに含めます。クラウド コンピューター サービス プロバイダーが容易に行う地理空間アプリケーション プログラミング インターフェイスを使用して、地理空間データを視覚化します。SMP を介して LIMS に送信されたデータを保存して、一元化されたストレージ、処理ワークフローの追跡、およびロジスティクスの管理を容易にします。
サンプル キット ID、サンプル ID、日付、時刻、および全地球測位システム座標などの事前読み込み情報により、データ型の準拠を有効にし、エラーを最小限に抑えることができます。参加者の集荷要求リンクのサンプルを含めます。マスクや手袋、サンプリングプロトコル、バイオセーフティ関連情報など、必要な個人用保護具を含むすべてのサンプリング用品を含むキットを構築します。
綿棒は、洗剤で1センチメートルの正方形のポリエステル吸収綿棒を濡らし、10センチメートル平方の表面を振り回すことによって、家庭や都市環境で表面を消毒することはめったにありません。爪楊枝に助けられ、200マイクロリットルのグアニジニウム・チオシアネートを含む事前標識チューブに各サンプル綿棒を沈下させる。クロスコンタミネーションを避けるために、各サンプルの収集用に用意されたマスクと新しい手袋を着用してください。
サンプリングを終了した後、付属の手指消毒剤を使用してください。彼らは実験室に輸送されるまで、4摂氏でチューブを保存します。サンプルが実験室に到着したら、マイナス80度で保管してください。
スクリーニングの速度を上げるには、サンプルをプールで処理します。プールが陽性の場合は、各サンプルのRNAを個別に抽出します。各サンプルサンプルを2つのプールに組み合わせるには、8個のサンプルの50マイクロリットルをマイクロ遠心チューブにプールし、残りのサンプルをマイナス80°Cで保存します。
80マイクロリットルのクロロホルムと渦を15秒間加えます。その後、摂氏4度で20分間インキュベートします。摂氏4度で20分間Gの13,000倍の遠心分離機。
水性層を新しいマイクロ遠心チューブに移します。残りのインターフェースとピンクの液体をマイナス80°Cの冷凍庫に保管してください。これらの画分にはDNAとタンパク質が含まれています。
回収した水層から、グアニジニウム・チオシアネートベースのRNA粗抽出プロトコルを用いてRNAを抽出する。10%の過剰なボリュームで室温でRT-LAMP反応ミックスを準備し、ピペッティングロスを考慮します。サンプル反応に5マイクロリットルのRNAと5マイクロリットルのRNAと合成SARS-CoV-2 RNAの2.5マイクロリットルをスパイク反応に加えます。
2.5マイクロリットルの合成SARS-CoV-2 RNAを正のコントロールに加え、5マイクロリットルの水を陰性対照に加えます。よく混ぜて、反応をスピンダウンします。測色観測では、負の結果はピンクで示され、正の結果は黄色で示されます。
RT-LAMPの後、ゲル電気泳動を行う。サンプルコレクションサイトの分布を以下に示します。キットの大半が完成し、対応するデータがLIMSにアップロードされました。
100%の頻度での検出の限界は、反応の25マイクロリットルあたり500コピーであった。カラーメトリック RT-LAMP では、pH シフトが 8 から 5.5 に変わったため、正のサンプルがピンクから黄色に色を変更しました。低いコピー数では、サンプルをアガロースゲル上で実行し、得られたはしご状のパターンで陽性を確認した。
RT QPCR法は環境試料で試験した。すべてのマスターミックスは、陽性対照の低コピー数濃度で阻害剤に敏感であった。テンプレートの低濃度では、従来のRT PCR法は偽陽性および偽陰性を示した。
最後に、ローリングサークル増幅と呼ばれる技術は、ターゲットシーケンスの少量を検出しました。しかし、RNAテンプレートがない場合にはプローブの増幅を示した。サンプリングは本当にそのコミュニティのすべてのメンバーの暴露のリスクを表すために、コミュニティのすべてのセクターに到達する行動への呼びかけをリリースすることが重要です。
このフレームワークはSARS-CoV-2遺伝物質を検出する。ウイルスの生存率をテストするための研究は、次のステップです。
概要
本記事では、COVID-19パンデミック期間中における、清掃頻度の低い都市表面でのSARS-CoV-2検出に向けた、シチズンサイエンスに基づくワークフローを提示します。このプロトコルは、容易に入手可能な材料と試薬を活用しており、サプライチェーンの制約がある状況下でも、大規模な環境サンプリングとウイルスRNAの高感度な検出を可能にします。本手法は、環境サンプルに一般的に含まれる阻害物質に対して堅牢に設計されており、将来的な他のウイルスの公衆衛生監視への応用も可能です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 環境ウイルス学
- 公衆衛生サーベイランス
- 分子診断学
背景
- COVID-19パンデミックの間、SARS-CoV-2の表面伝播が懸念されていました。
- ほとんどの環境サーベイランスは、病院や公共交通機関などの高頻度検出場所を重点的に行っていました。
- 滅菌や清掃が滅多に行われない都市部の表面が、ウイルスのリザーバーとして機能している可能性があります。
- パンデミック中の供給不足により、代替的なサンプリングおよび検出戦略が必要となりました。
研究目的
- 滅菌処理が不十分な都市表面におけるSARS-CoV-2検出のためのワークフローを開発し、検証すること。
- 大規模な環境サンプリングにシチズンサイエンティストを関与させること。
- 供給不足や環境阻害物質の影響を受けにくいプロトコルを作成すること。
使用した手法
- 地域メディアおよびSNSを通じて、多言語サポートを提供し350名のシチズンサイエンティストを募集した。
- PPE、スワブ、およびプロトコルを含むサンプリングキットを配布した。
- 洗剤で湿らせたポリエステルスワブを用い、10 cm2の表面領域をスワブ採取した。
- コールドチェーンを必要としないグアニジンチオシアネートによる検体の保存を行った。
- 一次スクリーニングのために検体をプールし、プール検体が陽性となった場合に個別のRNA抽出を行った。
- グアニジンチオシアネートベースのプロトコルを用いてRNA抽出を行った。
- 比色RT-LAMP法により検出を行い、ゲル電気泳動で確認した。
- RT-qPCR法およびローリングサークル増幅法と比較した。
- ラボ情報管理システム（LIMS）および地理空間視覚化ツールを用いた集中的なデータ管理を行った。
主な結果
- 多様な都市表面から4,000以上のサンプルを収集した。
- RT-LAMPアッセイでは、25 µLの反応あたり500コピーの検出限界が示され、明確な比色読み取りが得られた。
- プーリングによってスクリーニング効率が向上し、陽性プールについては個別の解析のためにデコンボリューションを行った。
- RT-qPCRは低コピー数において阻害剤の影響を受けやすく、偽陽性または偽陰性の原因となった。
- ローリングサークル増幅では、RNAテンプレートがない状態で非特異的な増幅が認められた。
- このワークフローは地域社会の関与をうまく促し、包括的な環境サーベイランスを可能にした。
結論
- 本プロトコルにより、入手しやすい資材と市民の参加を通じて、都市表面におけるSARS-CoV-2 RNAの高感度な検出が可能になります。
- このワークフローは環境阻害物質に対して堅牢であり、将来的な他のウイルスの発生にも適応可能です。
- 検出された表面におけるウイルスの生存能力を評価するためには、さらなる研究が必要です。
よくある質問
業界における重要性
都市部の表面におけるウイルスRNAの環境サーベイランスは、市中感染のリスクや環境リザーバーを早期に検出するための拡張可能なフレームワークを提供します。このワークフローにより、サプライチェーンの制約下においても迅速かつ分散的なサンプリングと堅牢な検出が可能となり、公衆衛生およびバイオファーマR&Dにおける予測の信頼性を向上させます。本アプローチは将来的な病原体モニタリングに適応可能であり、発見からサーベイランスに至る一連のプロセス全体において、リスクアセスメントや介入戦略に寄与します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期発見とターゲットバリデーション
- 伝播動態に関連する環境中のウイルスリザーバーについて、仮説に基づいた評価を可能にする。
- 多様な表面におけるウイルスRNAの存在と分布を明らかにすることで、生物学的なリスク低減（de-risking）を支援する。
- 感染剤の環境曝露モデルにおける予測精度の向上を促進する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 複雑な環境マトリックス中のウイルスRNAを高感度に検出するための、検証済みプロトコルを提供します。
- 大規模コホートにおける再現性のある定量的な出力を得るために、サンプルの収集および処理を標準化します。
- 阻害剤に対するアッセイの堅牢性を実証し、実環境における信頼性の高いスクリーニングを支援します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 環境サーベイランスデータと公衆衛生上のバイオマーカー戦略を整合させ、アウトブレイクへの備えを強化します。
- 環境検出から前臨床リスクモデリングおよび介入計画への継続性を可能にします。
- 新興病原体に対するサーベイランスツールの、リスク調整に基づいた高度化を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このワークフローは、環境サンプリング、分子検出、および集中データ管理を連携させるものであり、初期の発見からトランスレーショナルなサーベイランスまでをカバーしています。
- 探索生物学： 環境伝播およびリザーバーマッピングに関する仮説検証をサポートします。
- スクリーニング： プール検体および個々の検体から、ウイルスRNAの再現性のある定量的な検出を実現します。
- 分析： 地理空間データとLIMSベースのデータを統合し、比較分析およびコンプライアンスへの対応を行います。
- トランスレーショナルリサーチ： 公衆衛生上のバイオマーカーの整合およびアウトブレイク対応戦略に情報を提供します。
- エンタープライズ再利用： 将来の病原体サーベイランス計画に向けた、拡張可能で適応性の高いプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 環境リスクアセスメントおよびターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を向上させる。
- 運用的価値： リソースに制限がある状況下で、標準化され拡張可能なサンプリングおよび検出を可能にする。
- 戦略的価値： 監視体制の展開および介入の優先順位付けに関するゴー/ノーゴー判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響： リスク調整に基づいた監視および診断ツール開発の優先順位付けを支援する。
実施上の考慮事項
- 分子診断および環境サンプリングプロトコルの専門知識が必要です。
- 基本的な研究室インフラおよびデータ管理用のLIMSへのアクセスが必要です。
- サンプルの収集、処理、およびデータ報告に関するチーム間の標準化が求められます。
- 必要最低限の備品で、さまざまな都市および地域環境に適応可能です。
- 検出はウイルスRNAに限定されており、生存能試験が今後の必須ステップとなります。
