低腫瘍含量組織における腫瘍濃縮のための自動解剖プロトコル
2021年3月29日
自動組織解剖によるデジタル注釈は、腫瘍含有量の低い症例で腫瘍を濃縮するための革新的なアプローチを提供し、パラフィン組織と凍結組織の両方のタイプに適応可能です。説明したワークフローは、精度、再現性、スループットを向上させ、研究と臨床の両方の場面に適用することができます。
FFPEまたは新鮮な凍結材料からの関心のある小さな分散領域の単離または濃縮は、従来の方法よりも迅速かつ効率的に自動解剖によって達成することができる。FFPEまたは新鮮な凍結組織からのゲノム材料の抽出は、多くの臨床およびトランスレーショナルリサーチラボの要件です。自動解剖は、マクロ解剖とレーザーキャプチャマイクロ解剖の間の大きなギャップを埋める。
まず、ベンダーが提供する表示プラットフォームまたはオープンソースのビューアを使用して、関心のある腫瘍領域のスキャンされたスライド画像に注釈を付けます。デジタルスライドリファレンスを使用する場合、染色されていないサンプル組織スライドをステージ上に第1〜第4スライド位置に置きます。自動組織切除ソフトウェアを使用してフライス加工ジョブを作成するには、[ジョブ] リストを開き、[新しいジョブの作成] を選択し、ケース ID と名前を入力してジョブの名前を入力します。
[厚さ]に移動し、上矢印タブまたは下矢印タブを使用して断面の厚さを選択します。次に、組織調製に移動し、パラフィン処理または脱パラフィン処理を選択します。「参照画像」を選択し、「画像のインポート」を選択します。
次に、ドロップダウンからデジタル参照としてインポートするファイルを選択します。右下隅にある「スキャンステージ」ボタンを選択してステージをスキャンし、第1から第4の位置にある各サンプル組織スライドをキャプチャします。ステージ上の参照の場合は、ボックスをドラッグして組織上に長方形の領域を作成し、長方形の領域の下にある円形のバブルを選択してステージ参照イメージをキャプチャします。
この長方形のフィールドを、参照画像の右上隅にあるコピーオプションを選択して、2番目から4番目のスライド位置にある残りのサンプル組織スライドにコピーします。次に、必要に応じて整列とサイズ変更を行います。デジタル参照画像の場合は、選択した長方形の領域に画像を重ねます。
次に、デジタルリファレンスのサイズを変更して整列させ、もちろんズームして、サンプル組織上のサイズと位置に最も一致するようにします。この長方形のフィールドを、参照画像の右上隅にあるコピーオプションを選択して、2番目から4番目のスライド位置にある残りのサンプル組織スライドにコピーします。次に、必要に応じて整列とサイズ変更を行います。
右下隅にある[スキャンステージ]ボタンを選択して、微調整ステップに進みます。最初のステージ位置を選択し、右側のツールバーにある変形ツールアイコンを選択して、サンプルのスライドオーバーレイに最も合うように参照の微調整とズーム調整を行います。画面下部のサンプルへの参照スライドバーを使用して、参照画像とサンプル画像を切り替えます。
ズームインとズームアウト機能により、各スライド位置のアライメントを調整して実現します。最適なサンプルオーバーレイが得られたら、右側のツールバーのカラーピッカーツールアイコンを選択して、マスクされた参照画像の色付き部分にミリングパスの指定を描画します。ミリングパスをサンプルスライドに描画するには、画面の右下隅にある「注釈を取得」ボタンを選択します。
ミリングパスの計算時に、4 つ以下のミリングチップを持つアノテーション付き関心領域をキャプチャして収集します。左上隅のミリングチップの使用量は、カバーされる面積と選択したチップサイズに基づいて計算されます。チップサイズはミリングチップ矢印の下で変更でき、チップの使用状況が再計算されます。
最初のスライド位置でミリングパスを選択すると、残りのスライド位置にコピーされます。画面の右下隅にある「ステージをセットアップ」ボタンを選択すると、ステージ上の適切な指定で収集チューブからミリングチップがプロンプトでロードされます。リザーバに、組織タイプおよび下流の核酸抽出用の適切な解剖バッファーを3ミリリットル充填する。
次に、画面の右下隅にある[解剖]ボタンを選択します。自動解剖後、収集チューブと解剖したサンプルスライドをステージから取り外します。収集チューブをチューブ・ラックに入れ、スライドをスライド・ラックに入れます。
異種移植片中の転移性結腸直腸癌を含むH&E染色ホルマリン、固定パラフィン包埋、および新鮮な凍結マウス肝臓切片を、スライドイメージャ全体上で20倍の倍率でスキャンし、基準スライドとして使用した。H&E染色された参照スライドに注釈を付け、解剖および核酸抽出のために腫瘍領域をデジタルマスクした。解剖後のサンプルスライドをH&E染色し、10マイクロメートルおよび20マイクロメートルのスライドで解剖領域を確認した。
キャプチャされたメトリックは、自動解剖と核酸抽出の成功を実証しました。このプロトコルを試すときは、染色されていないスライドに比較的正確に注釈を重ね合わせることが、関心のある領域を分離するために重要であることに注意してください。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
本記事では、腫瘍含有量の低い組織から腫瘍領域を濃縮するための自動組織切除プロトコルを紹介します。これにより、全エキソームシーケンシングなどのダウンストリームアプリケーションに向けた高品質な核酸抽出が可能になります。本手法は、未染色のスライド上にデジタルアノテーションをオーバーレイさせることで、従来の肉眼的なマクロ切除やレーザーキャプチャーマイクロダイセクションと比較して、精度、再現性、およびスループットを向上させています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 分子病理学
- 組織切片作成技術
- ゲノム解析
背景
- 腫瘍含有量の少ない組織（腫瘍20%未満）では、信頼性の高いダウンストリームアッセイを行うための十分な検体を回収できないことがよくあります。
- 従来のマクロ切除はユーザーの習熟度に依存し精度に欠け、一方、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションは時間とコストがかかります。
- 自動組織切除は、デジタルアノテーションと精密な自動ミリングを組み合わせることで、これらの課題に対する解決策を提供します。
- 臨床および研究におけるシーケンシングワークフローにおいて、腫瘍領域を正確に濃縮することは極めて重要です。
研究目的
- FFPE標本または新鮮凍結組織における腫瘍領域の自動濃縮プロトコルを提示すること。
- 核酸抽出のための組織切除における効率性と再現性を向上させること。
- 腫瘍含有率の低いサンプルから、シーケンシングアプリケーションに向けた高品質なデータを生成することを可能にすること。
使用された手法
- 専用ソフトウェアまたはオープンソースソフトウェアを用いた、スキャン済みH&E染色参照スライド上の腫瘍領域のデジタルアノテーション。
- 精密な標的設定のため、未染色の組織スライド上へのデジタルアノテーションの重ね合わせ。
- FFPEまたは新鮮凍結切片（厚さ20 µmまで）において、直径250 µm2のブレードを用いたアノテーション領域の自動切削。
- 核酸抽出およびその後の全エクソームシーケンシングのための、切除組織の回収。
主要な結果
- 自動解剖により、腫瘍含有量の低い組織から、小さく分散した腫瘍領域を効率的に分離できます。
- 解剖後のH&E染色により、注釈付き領域が正確に除去されたことが確認されます。
- 回収指標により、濃縮および核酸抽出が成功したことが示されます。
- 本プロトコルは、手動法と比較してスループットを向上させ、スライドの使用量を削減します。
結論
- 自動組織切除により、低含有量サンプルからの腫瘍濃縮における精度と再現性が向上します。
- 本手法は、マクロ切除とレーザーキャプチャーマイクロダイセクションの間のギャップを埋めるものです。
- シーケンシング用の高品質な核酸を必要とする臨床および研究の両方の用途に適しています。
よくある質問
産業界における重要性
腫瘍含有量の少ない組織における腫瘍濃縮のための自動解剖は、後続のゲノムアッセイに向けた高品質な核酸を生成する際の重大なボトルネックを解消します。ユーザー依存のばらつきを抑え、スループットを向上させることで、本プロトコルは探索研究とトランスレーショナルリサーチの接点における予測の信頼性と再現性を高めます。この手法の導入は、オンコロジーに特化した研究開発パイプラインにおけるリスク調整後の意思決定とポートフォリオの推進を支援します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 腫瘍領域の精密な単離を可能にし、不均一な組織サンプルにおける堅牢なターゲットバリデーションをサポートします。
- 分子解析に用いる投入材料の純度を高めることで、生物学的な不確実性を低減します。
- 非腫瘍組織からのコンタミネーションを最小限に抑え、信頼性の高い仮説検証を促進します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 次世代シーケンシングなどの標準化されたダウンストリームアッセイに適した濃縮サンプルを調製します。
- 組織の選択および切り出しステップを自動化することで、アッセイの再現性を向上させます。
- スループットを向上させ、スライドの使用量を削減することで、スケーラブルなワークフローをサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 翻訳バイオマーカーの探索およびバリデーションの要件に合わせて、サンプル調製を最適化します。
- 前臨床モデルにおいて、組織採取からゲノムデータ生成までの一貫性を確保します。
- 高品質で腫瘍濃縮された核酸入力を提供することで、翻訳研究のリスクを低減します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この自動解剖プロトコルは、組織採取から核酸抽出までの工程に適用可能であり、探索的ワークフローおよびトランスレーショナルワークフローの両方において、シーケンシングおよび分子プロファイリングのための信頼性の高いサンプル調製を実現します。
- 探索生物学： 複雑な組織から関心領域を正確に分離することを可能にし、仮説駆動型の研究を支援します。
- スクリーニング： ハイスループットシーケンシング解析に適した、再現性のある定量的な濃縮を実現します。
- 分析： サンプルの品質と濃縮の成功を検証するための、回収指標および回収後の確認を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ： 標準化され拡張可能な濃縮法により、前臨床および臨床サンプルの処理を橋渡しします。
- エンタープライズ再利用： さまざまな組織タイプや研究課題に適応可能な、プラットフォームに依存しない機能を提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 分子解析における予測の信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを低減します。
- 運用の価値： 組織濃縮を標準化し、再現性とスループットを向上させます。
- 戦略的価値： 下流アッセイへの高品質なインプットを確保することで、より根拠に基づいた意思決定（go/no-go決定）を可能にします。
- ポートフォリオへの影響： ゲノム研究におけるサンプル由来のばらつきを抑えることで、リスク調整後の優先順位付けをサポートします。
実施上の留意点
- デジタルパソロジーのアノテーションおよび自動切削ソフトウェアの操作に関する専門知識が必要です。
- 互換性のあるイメージング、アノテーション、および切削装置へのアクセスが必要です。
- 再現性を確保するため、チーム間でアノテーションおよび切削パラメータの標準化を行う必要があります。
- 動物またはヒト由来の、FFPEおよび新鮮凍結組織の両方に適用可能です。
- 最適な濃縮を実現するには、デジタルアノテーションの正確なオーバーレイとアラインメントに依存します。
