Name: 15μs-ms タイムスケールにおけるタンパク質コンフォメーションダイナミクスの研究のためのN CPMG緩和分散 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: 学ぶ ¹⁵N CPMG緩和分散NMRを用いたタンパク質コンフォメーションダイナミクスの検出と特性評価。μs-msタイムスケールの動的構造変化を原子分解能で解析し、酵素活性やシグナル伝達の機構解明に貢献します。

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この作品は、NIGMS R35GM133488からの資金とロイJ.カーバー慈善信託からV.V.への資金によって支えられました。

1. NMRサンプルの調製
<ol><li>目的のタンパク質の2H、15 N-labledサンプルを精製して精製します。 注: 15個の N 標識タンパク質サンプルを使用して CPMG RD 実験を取得できますが、可能な場合は測定によって得られたデータの品質が大幅に向上します。透過性タンパク質の製造のためのプロトコルは、文献13で入手可能です。</li>
	<li>精製したタンパク質サンプルを脱気NMRバッファーにバッファー交換します。</li>
	<li>NMRサンプルをNMRチューブに移します。 注: シグナル対ノイズ比を最大化し、タンパク質とタンパク質の相互作用の発生を最小限に抑えるためには、NMRサンプルの濃度を慎重に最適化する必要があります。一般に、CPMG実験の典型的な濃度範囲は0.1〜1.0 mMである。</li>
</ol>2. 初回NMR実験のセットアップ
<ol><li>補足ファイルをダウンロードして解凍します。</li>
	<li>ファイル bits.vv と trosy_15N_cpmg.vv (pulseprogram という名前のフォルダーにある) をパルス プログラム ディレクトリ (<path>/exp/スタン/nmr/リスト/pp/user にコピーします。 注: trosy_15N_cpmg.vv ファイルの最初の行にリストされている bits.vv へのパスが正しいことを確認します。</path></li>
	<li>取得ソフトウェアを開き、以前に実行した 1H-15N HSQC 実験を、コマンド edcを使用して新しい実験にコピーします。</li>
	<li>パル プログコマンドを使用して、パルスプログラムtrosy_15N_cpmg.vvを新しく作成した実験にロードします。</li>
	<li>パルスプログラムファイル(trosy_15N_cpmg.vv)の最後に記載されている指示を使用して、CPMG実験を設定します。</li>
</ol>3. NMR実験のルーチンセットアップ
<ol><li>マグネットにサンプルを導入し、NMR実験を取得するためのすべての基本的な手順を実行します: サンプルをロックし、シム;1 H および15N チャネルに合致し、調整します。 </li>
	<li>p1とp7を それぞれ1Hおよび 15N硬度90°パルスの持続時間に設定します。 注意:最適な結果を得るには、15N 90°パルスを細心の注意を払って調整することが重要です。校正は、通常、分光器マニュアルに記載されているように、DMSOで15N標識尿素の100 mMサンプルを使用して行われます。また、最初のINEPTブロックの15N 90°パルスが180°パルスに切り替わった1H-15 N HSQCスペクトルの最初の増分を取得することにより、作業NMRサンプル上のキャリブレーションを直接再確認することができます。 キャリブレーションが正しい場合は、null を取得する必要があります。</li>
	<li>取得ウィンドウで 、1H および 15N 次元の中心とスペクトル幅を設定します。 注: 最適な水抑制のために、水信号の周波数で 1H スペクトルを中央に配置します。</li>
	<li>緩和遅延(d30)を0.7T2に設定し、T2はタンパク質の予想 される15N横方向緩和時間です。 注: d30 の値は経験的に最適化して最良の結果を得ることができます。</li>
	<li>コマンドvclistを使用して、図 1A および図 1Bのパラメーター n に対応する整数のリストを作成します。ν cpmg = 4 x n/d30 に従って、リスト内の各項目が異なるCPMGフィールド (νcpmg)に対応していることを確認してください。リストの最初の数値が 0 (CPMG ブロックがスキップされ、d30 = 0 s である参照実験に対応) であり、1,000 x d30 /4 より大きい数値を使用しないようにしてください。このしきい値より大きい数値は、1 kHz &gt; νcpmgとなり、プローブに損傷を与える可能性があります。</li>
	<li>l8 を vclist 内のエントリ数に設定し、l3 を間接ディメンションの実数 (通常は 64- 200 の範囲は l3 に設定) に設定し、1 td は l8 x l3 x 2 に等しい値に設定します。 注: 手順 3.7 ~ 3.11 を実行して、水の抑制を最適化します。</li>
	<li>受信機ゲイン (rg) を 1 に設定します。パルスプログラムファイル (edcpul) を開き、91 行目に移動し 、goto 999の前にあるセミコロンを削除して、ファイルを保存します。</li>
	<li>コマンド gs を使用して、FID 信号の強度を最小限に抑えるために、パラメーター spdb0 (または spdw0) を調整します。</li>
	<li>パルス・プログラム・ファイルの 91 行目にセミコロンを再導入し、ファイルを保存します。</li>
	<li>ステップ 3.7 から 3.9 を繰り返して、spdb11 (パルス・プログラム・ファイルの 168 行目)、spdb2 (パルス・プログラム・ファイルの 179 行目) 、および pldb2 (パルス・プログラム・ファイルの 184 行目) を最適化します。</li>
	<li>コマンド rga を実行して、レシーバゲインを最適化します。</li>
	<li>スキャンの数 (ns) を 8 の倍数に設定します。</li>
	<li>コマンド zg を実行して実験を開始します。</li>
</ol>4. NMRデータの処理と分析
<ol><li>Process (補足ファイル) という名前のフォルダを、ser ファイルが格納されているディレクトリにコピーします。</li>
	<li>ファイルsep_fid.comと ft2D.com を使用して、NMR データを処理します。 注: 処理スクリプトの編集方法については、sep_fid.comファイルと ft2D.com ファイル内で説明します。</li>
	<li>Sparky のディレクトリ CPMG_Sparky_filesに含まれる ucsf ファイルを開きます。 注: ucsf ファイルは、処理スクリプトによって作成されます。vclist の各エントリに対して 1 つの ucsf ファイルがあります。最初の ucsf ファイル(test_1.ucsf)には、参照実験が含まれています。後続の ucsf ファイル (test_2.ucsf、test_3.ucsf,...test_n.ucsf) は、νcpmgの最小値から最大値まで順に並べられます。</li>
	<li>参照 NMR スペクトル(test_1.ucsf)の NMR クロスピークをピックします。</li>
	<li>Sparky コマンド paを使用して、選択したすべてのクロスピークを選択します。</li>
	<li>Sparky コマンド rhを実行します。このコマンドは、ダイアログ ウィンドウを開きます。 各スペクトルの同じ位置にあるオプションの高さを選択します。 [設定 ]をクリックし、すべてのNMRスペクトルを確認します。 [更新 ]をクリックし、出力ファイルを作業ディレクトリに保存します。出力ファイルには、開かれた NMR スペクトル全体の信号強度の行列が含まれます。 注: インターリーブ擬似 3D 実験から強度を回復するために線形フィッティングを使用する、より正確なプロトコルが文献14に記載されています。ラインシェイプフィッティング用の自由に利用できるソフトウェアは、https://pint-nmr.github.io/PINT/(PINT)、https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/fuda/(FUDA)、NMRPipe(nLinLSモジュール)およびSPARKY(それモジュール)内で利用できます。</li>
	<li>各CPMGフィールドについて、I 0とI <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq03.jpg"> d30は、それぞれ基準(vc = 0)と緩和(vc &gt;0)NMRスペクトルの強度である式を使用して、R2レートに信号強度を変換します。 注: 補足ファイルでは、信号強度を R2 レートに変換し、RD プロファイルを視覚化するために使用されるスプレッドシート ファイル (R2_calc.xls) のテンプレートが提供されています。</li>
	<li>Sparky コマンド st を使用してリファレンススペクトルのノイズ レベルを読み取り、R2 レートでエラーを伝播します。 注: 補足ファイルでは、測定された R2 レートでエラーを伝播するために使用されるスプレッドシート ファイル (R2_calc.xls) のテンプレートが提供されます。</li>
</ol>5. フィッティングRDカーブ
<ol><li>RD_fitting (補足ファイル) という名前のフォルダを作業ディレクトリにコピーします。</li>
	<li>割り当てられた各 NMR ピークについて、R ex を計算して見積もる rexは <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq04.jpg"> <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq05.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq06.jpg"> vclist 内の最も低いおよび最高の νcpmgで測定される R2レートです。
</li>
	<li>Rex の推定誤差の 2 倍より大きい RD カーブを視覚的に調べ、正確にモデル化するにはあまりにも騒がすぎない RD カーブをすべて破棄します。 メモ: Rex上のノイズは、エラーと . <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq05.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq06.jpg"></li>
	<li>推定エラーの 2 倍を超える Rex を持つすべての RD カーブを使用して、適合スクリプト用の入力ファイルを準備します。 注: 入力ファイルの準備に関する詳細な指示は、フィッティングスクリプト内で提供されています。入力ファイルの例は 、補足ファイルとして提供されます。一般に、RDデータは2つの異なる静的フィールドで測定され、同時に適合します。このプロトコルでは、2 つの異なる入力ファイル (補足ファイル) が必要です。</li>
	<li>「 補足ファイル」に記載されているスクリプトを使用して RD データを適合します。 注: RD カーブの残基ベースまたはグローバル フィットを実行するために、それぞれ 2 つの異なるスクリプトが用意されています。どちらのスクリプトも、2 サイト交換モデルとカーバー リチャーズ方程式を使用して RD 曲線に適合します。フィッティングスクリプト内で、より詳細な手順が提供されています。Chemex(https://github.com/gbouvignies/ChemEx)やCATIA(https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/catia/)などの追加のソフトウェアパッケージを利用して、ブロック-マッコネル方程式を使用してデータフィッティングを実行できます。</li>
	<li>pbおよび kexの関数として、減らされたχ2を推定する適合パラメータの信頼性をテストします。 注: 減らされた χ2 は出力ファイルに提供されます。pb および kex は、フィッティング手順で下限と上限を使用して特定の値に拘束することができます。このスクリプトでは、pb の下限と上限はそれぞれ lb(2) と ub(2) です。kex の下限と上限はそれぞれ lb(3) と ub(3) です。</li>
	<li>適合パラメータの誤差を推定します。これは、スクリプト内のMC_facの値を 1 に設定し、フィッティングを複数回繰り返すことで行うことができます (通常、&gt;20 繰り返し)。各パラメータの誤差は分布の標準偏差として推定されます。 注: MC_facを 1 に設定すると、実験データにガウス分散誤差 (実験誤差に基づいて計算) が追加される合成データセットが生成されます。</li>
</ol>

<ol><li>Anthis, N. J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+transient+dark+states+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).</li>
<li>Lisi, G. P., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+NMR+spectroscopy+for+the+study+of+enzyme+allostery%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery.</a> Chemical Reviews. 116 (11), 6323-6369 (2016).</li>
<li>Mittermaier, A., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+provide+new+insights+in+NMR+studies+of+protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics.</a> Science. 312 (5771), 224-228 (2006).</li>
<li>Venditti, V., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+selection+and+substrate+binding+regulate+the+monomer%2Fdimer+equilibrium+of+the+C-terminal+domain+of+Escherichia+coli+enzyme+I%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Conformational selection and substrate binding regulate the monomer/dimer equilibrium of the C-terminal domain of Escherichia coli enzyme I.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26989-26998 (2012).</li>
<li>Venditti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+interdomain+rearrangement+triggered+by+suppression+of+micro-+to+millisecond+dynamics+in+bacterial+Enzyme+I%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Large interdomain rearrangement triggered by suppression of micro- to millisecond dynamics in bacterial Enzyme I.</a> Nature Communications. 6, 5960(2015).</li>
<li>Yip, G. N., Zuiderweg, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+cycle+scheme+that+significantly+suppresses+offset-dependent+artifacts+in+the+R2-CPMG+15N+relaxation+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">A phase cycle scheme that significantly suppresses offset-dependent artifacts in the R2-CPMG 15N relaxation experiment.</a> Journal of Magnetic Resonance. 171 (1), 25-36 (2004).</li>
<li>Mulder, F. A., Skrynnikov, N. R., Hon, B., Dahlquist, F. W., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+slow+%28micros-ms%29+time+scale+dynamics+in+protein+side+chains+by+%2815%29N+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy%3A+application+to+Asn+and+Gln+residues+in+a+cavity+mutant+of+T4+lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Measurement of slow (micros-ms) time scale dynamics in protein side chains by (15)N relaxation dispersion NMR spectroscopy: application to Asn and Gln residues in a cavity mutant of T4 lysozyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 123 (5), 967-975 (2001).</li>
<li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TROSY+CPMG+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+in+large+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">A TROSY CPMG sequence for characterizing chemical exchange in large proteins.</a> Journal of Biomolecular NMR. 15 (2), 151-155 (1999).</li>
<li>Dotas, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+thermophilic%2Fmesophilic+enzymes+reveal+a+role+for+conformational+disorder+in+regulation+of+bacterial+Enzyme+I%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hybrid thermophilic/mesophilic enzymes reveal a role for conformational disorder in regulation of bacterial Enzyme I.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (16), 4481-4498 (2020).</li>
<li>Purslow, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+site+breathing+of+human+Alkbh5+revealed+by+solution+NMR+and+accelerated+molecular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Active site breathing of human Alkbh5 revealed by solution NMR and accelerated molecular dynamics.</a> Biophysical Journal. 115, 1895-1905 (2018).</li>
<li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+relaxation-compensated+Carr%E2%88%92Purcell%E2%88%92Meiboom%E2%88%92Gill+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+by+NMR+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A relaxation-compensated Carr−Purcell−Meiboom−Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR Spectroscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 121 (10), 2331-2332 (1999).</li>
<li>Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+15N+relaxation+dispersion+experiment+for+the+measurement+of+millisecond+time-scale+dynamics+in+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">An improved 15N relaxation dispersion experiment for the measurement of millisecond time-scale dynamics in proteins.</a> Journal of Physical Chemistry B. 112 (19), 5898-5904 (2008).</li>
<li>Tugarinov, V., Kanelis, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotope+labeling+strategies+for+the+study+of+high-molecular-weight+proteins+by+solution+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isotope labeling strategies for the study of high-molecular-weight proteins by solution NMR spectroscopy.</a> Nature Protocols. 1 (2), 749-754 (2006).</li>
<li>Niklasson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+NMR+data+using+advanced+line+shape+fitting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of NMR data using advanced line shape fitting.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 93-99 (2017).</li>
<li>Palmer, A. G. 3rd, Kroenke, C. D., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+methods+for+quantifying+microsecond-to-millisecond+motions+in+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance methods for quantifying microsecond-to-millisecond motions in biological macromolecules.</a> Methods in Enzymology. 339, 204-238 (2001).</li>
<li>Tollinger, M., Skrynnikov, N. R., Mulder, F. A., Forman-Kay, J. D., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+dynamics+in+folded+and+unfolded+states+of+an+SH3+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Slow dynamics in folded and unfolded states of an SH3 domain.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 11341-11352 (2001).</li>
<li>Carver, J. P., Richards, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+two-site+solution+for+the+chemical+exchange+produced+dependence+of+T2+upon+the+Carr-Purcell+pulse+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">A general two-site solution for the chemical exchange produced dependence of T2 upon the Carr-Purcell pulse separation.</a> Journal of Magnetic Resonance. 6 (1), 89-105 (1972).</li>
<li>Egner, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Contrast%27+NMR+Reveals+Non-innocent+Role+of+Support+in+Pd%2FCeO2+Catalyzed+Phenol+Hydrogenation%5BTitle%5D)+AND+%22ChemCatChem%22%5BJournal%5D)">Surface Contrast' NMR Reveals Non-innocent Role of Support in Pd/CeO2 Catalyzed Phenol Hydrogenation.</a> ChemCatChem. 12 (6), 4160-4166 (2020).</li>
<li>Egner, T. K., Naik, P., Nelson, N. C., Slowing, I. I., Venditti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+Insight+into+Nanoparticle+Surface+Adsorption+by+Solution+NMR+Spectroscopy+in+an+Aqueous+Gel%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Edition+in+English%29%22%5BJournal%5D)">Mechanistic Insight into Nanoparticle Surface Adsorption by Solution NMR Spectroscopy in an Aqueous Gel.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 56, 9802-9806 (2017).</li>
<li>Tugarinov, V., Libich, D. S., Meyer, V., Roche, J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+energetics+of+a+three-state+protein+folding+system+probed+by+high-pressure+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Edition+in+English%29%22%5BJournal%5D)">The energetics of a three-state protein folding system probed by high-pressure relaxation dispersion NMR spectroscopy.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 54, 11157-11161 (2015).</li>
<li>Korzhnev, D. M., Kloiber, K., Kanelis, V., Tugarinov, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+slow+dynamics+in+high+molecular+weight+proteins+by+methyl-TROSY+NMR+spectroscopy%3A+application+to+a+723-residue+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Probing slow dynamics in high molecular weight proteins by methyl-TROSY NMR spectroscopy: application to a 723-residue enzyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3964-3973 (2004).</li>
<li>Mayzel, M., Ahlner, A., Lundstrom, P., Orekhov, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+backbone+%2813%29CO+and+%2815%29N+relaxation+dispersion+at+high+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein backbone (13)CO and (15)N relaxation dispersion at high resolution.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 1-12 (2017).</li>
<li>Pritchard, R. B., Hansen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterising+side+chains+in+large+proteins+by+protonless+%2813%29C-detected+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Characterising side chains in large proteins by protonless (13)C-detected NMR spectroscopy.</a> Nature Communications. 10, 1747(2019).</li>
</ol>

すべての著者は原稿を読み、承認しました。私たちは利益相反を宣言しません。

本稿では、タンパク質に関する15N RDデータの取得および分析のために研究室で実施されるプロトコルについて説明します。特に、NMRサンプルの調製、NMRデータの測定、およびRDプロファイルの分析のための重要なステップがカバーされています。RD実験の取得と解析に関する重要な側面について以下に説明します。しかし、実験とデータ分析の詳細な説明のために、元の文献の慎重な研究は3、8、11、15、16を強くお勧めします。
NMRサンプルを調製する際には、μs-msタイムスケール上の任意のマイナー(<1%人口)状態の存在が検出可能なRDプロファイル1を生成することを考慮することが極めて重要である。したが...

カーパーセルメイブーム-ギル(CPMG)の緩和分散体(RD)実験は、溶液NMR分光法1、2、3、4、5によってμs-msタイムスケールで発生する立体構造平衡を特徴付けるためにルーチンベースで使用される。コンフォメーションダイナミクスの他の方法と比較して、CPMG技術は、現代のNMR分光計で比較的容易に実装でき、特殊なサンプル調製ステップ(すなわち、結晶化、サンプル凍結または位置合わせ、および/または蛍光または常磁性タグを有する共有結合結合)を必要とせず、構造、運動、熱力学の構造、運動、熱力学の情報を返す共統構造の包括的な特性を提供する。CPMG実験が立体構造平衡を報告するためには、(i)観測されたNMRスピンが、立体構造交換を行っている状態(微小状態)と(ii)の間に50μsから~10msの範囲の時間スケールで起こらなければならないという2つの条件が適用されなければならない。これらの条件下では、観察された横方向緩和率 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq01v2.jpg"> ()は、組み込みR2(μs-msダイナミクスの無しで測定したR2) <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq02v3.jpg"> と、横弛緩(Rex)への交換寄与の和である。R2obsへのRex寄与は、パルス系列のCPMGブロックを構成する180°パルス間の間隔を減少させることによって徐々に消光することができ、そして得られたRD曲線は、ブロッホ・マッコネル理論を用いて、微小状態間の化学シフト差、各微小状態の小数体の母集団、およびマイクロステート間の交換率を得ることができる( 図1,2.
15N CPMG実験の文献では、いくつかの異なるパルスシーケンスおよび分析プロトコルが報告されている。本明細書において、実験室で実施されるプロトコルについて説明する。特に、NMRサンプルの調製、NMR実験の設定と取得、およびNMRデータの処理と分析のための重要なステップが導入される(図2)。プロトコルを他の研究所に転送しやすくするために、パルスプログラム、処理および解析スクリプト、およびデータセットの例が補足ファイルとして提供され、(https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html)からダウンロードできます。提供されたパルスシーケンスは、オフセット依存性アーチファクト6の抑制のためにCPMGブロックに4段階のフェーズサイクルを組み込み、いくつかのインターリーブ実験を取得するためにコード化される。これらのインターリーブ実験は、同じ緩和期間を有するが、異なるCPMGフィールド7を達成するために、再焦点パルスの異なる数を有する。また、説明されたパルスプログラムがNMR信号8のTROSY成分の15 NR2を測定することに注意することも重要である。全体として、このプロトコルは、中型および大型タンパク質4、5、9、10における立体構造交換の特性評価に対して正常に適用されている。より小さいシステム(&lt;20 kDa)の場合、ヘテロ核単一量子コヒーレンス(HSQC)ベースのパルスシーケンス11、12の使用が推奨される。

<table><tbody><tr><td>クライオプローブ</td><td>ブルカー</td><td>5mm TCI 800 H-C/N-D クライオプローブ</td><td>感度の向上</td></tr><tr><td>酸化重水素</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>756822-1</td><td>>99.8% 純度、NMRサンプルや重水素化培養物の調製に利用</td></tr><tr><td>手持ち遠心分離機</td><td>ユナイテッド・サイエンティフィックの供給</td><td>CENTFG1</td><td>NMRチューブの壁に付着した気泡や残留液を除去するために使用されます。</td></tr><tr><td>高磁場NMR分光計</td><td>Bruker</td><td>Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800</td><td>NMRデータの取得</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html</td><td>NMRデータのモデリング</td></tr><tr><td>NMRパスツール ピペット</td><td>コーニング・インコーポレーション</td><td>7095D-NMR</td><td>Pyrexガラスパスチュアピペット NMRチューブ内の液体サンプルを移す</td></tr><tr><td>NMRチューブ</td><td>Willmad Precision</td><td>535-PP-7</td><td>5mm薄肉7インチ円筒ガラス管</td></tr><tr><td>NMRパイプ</td><td>生物科学・バイオテクノロジー研究所</td><td>研究 https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html</td><td>NMRデータ処理</td></tr><tr><td>スパーキー</td><td>カリフォルニア大学サンフランシスコ校</td><td>https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/</td> <td>NMRデータの分析</td></tr><tr><td>Tospin 3.2(またはそれ以降)</td><td>ブルカー</td><td>https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html</td><td>取得ソフトウェア</td></tr></tbody></table>

15μs-ms タイムスケールにおけるタンパク質コンフォメーションダイナミクスの研究のためのn cpmg緩和分散

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

タンパク質立体構造ダイナミクスは、重要な生物学的プロセスである酵素触媒、リガンド結合、アロステリー、およびシグナル伝達の調節において基本的な役割を果たします。構造とダイナミクスのバランスが生物学的機能をどのように支配するかを理解することは、現代の構造生物学における新たなフロンティアであり、いくつかの技術的および方法論的発展に火をつけた。これらの中で、CPMG緩和分散液NMR法は、μs-msタイムスケールで発生するタンパク質の構造、運動学、熱力学に関するユニークな原子分解能情報を提供します。ここでは、15Nの緩和分散実験の取得および分析のための詳細なプロトコルを提示する。例として、細菌のC末端領域におけるμs-msダイナミクスの分析のためのパイプラインを示す酵素I。

ここで説明するプロトコルは、1H-15N TROSYスペクトルの各ピークのRDプロファイルを取得する結果となる(図3A)。取得したRDプロファイルから、各バックボーンアミド群の15N横方向緩和への交換寄与を推定することができる(図3A、3B)。調査中のタンパク質の3D構造にRexをプロットすることにより、μs-ms時間スケールで立体構造交換を行っている構造領域を特定することができる(図3C)。カーバー・リチャーズ方程式を用いたRD曲線のモデリングは、平衡状態の状態の小数母集団やこれらの状態間の交換速度など、交換プロセスにおける熱力学的および運動的パラメータを返す(図1、図3D)。これらの熱力学および運動パラメータ(複数の実...

ここでは、NMR分光法による溶液NMRの緩和分散プロファイルを 取得および分析するための実験室で実施されるプロトコルの詳細な説明が提供される。

15μs-ms タイムスケールにおけるタンパク質コンフォメーションダイナミクスの研究のためのN CPMG緩和分散

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

このプロトコルは、さまざまな細胞プロセスを理解するために不可欠なタンパク質立体構造ダイナミクスの検出と特性評価に使用できます。他の方法と比較して、この方法は特殊なサンプル調製ステップを必要とせず、キネティックス、熱力学、および確認平衡の構造的側面の包括的な特性を提供する。CPMG緩和分散は、核酸および他の生体分子における確認ダイナミクスの特性化や、リガンドナノ粒子相互作用の特性化のために、より広く適用することができる。当社のプロトコルは、初めてのCPMGユーザーを対象としています。だから、それは良い出発点です。しかし、従来のNMR実験を実行するための基本的な手順をユーザーに知っ求めています。初めて NMR 実験をセットアップするには、まずこれらの補助ファイルをダウンロードして解凍します。ビットをコピーします。vvとtrosy_15N_CPMG。パルスプログラムフォルダ内のvvファイルをパルスプログラムディレクトリに移動します。取得ソフトウェアを開き、EDC コマンドを使用して、以前に実行した水素窒素 15 HSQC 実験を新しい実験にコピーします。パルスプログラムコマンドを使用してtrosy_15N_CPMGをロードします。vvパルスプログラムファイルを新しく作成した実験に。次に、パルス プログラム ファイルの末尾の指示を使用して CPMG 実験をセットアップします。日常的なNMR実験を設定するには、サンプルを磁石に導入し、基本的なNMR取得手順をすべて実行します。P1を水素硬度90度パルスの持続時間に設定し、P7を持続時間窒素15硬度90度パルスに設定する。取得ウィンドウで、水素と窒素15の寸法の中心とスペクトル幅を設定します。緩和遅延を0.7 T2に設定し、VC listコマンドを使用してNに対応する整数のリストを作成します。L8 を VC リストのエントリ数に設定し、L3 を間接寸法の実数に設定し、1TD を L3 倍 2 倍に設定します。水の抑制を最適化するには、受信機ゲインを1に設定し、EDCプルと入力してパルスプログラムファイルを開きます。91 行目で、goto 999 の前にあるセミコロンを削除し、ファイルを保存します。GS コマンドを使用して、FID 信号の強度を最小限に抑えるために SPDB0 パラメーターを調整します。信号強度が変更されたら、パルスプログラムファイルの91行目にセミコロンを再導入し、ファイルを保存します。SPDB11 を最適化するには、受信機ゲインを 1 に設定し、タイプ EDC プルを設定してパルス・プログラム・ファイルを開きます。168 行目で、goto 999 の前にあるセミコロンを削除し、ファイルを保存します。GS コマンドを使用して、FID 信号の強度を最小限に抑えるために SPDB11 パラメータを調整します。信号強度が変更されたら、168行目にセミコロンを再導入し、ファイルを保存します。SPDB2 を最適化するには、受信機ゲインを 1 に設定し、EDC プルと入力してパルス・プログラム・ファイルを開きます。179 行目で、goto 999 の前にあるセミコロンを削除し、ファイルを保存します。GS コマンドを使用して、FID 信号の強度を最小限に抑えるために SPDB2 パラメーターを調整します。信号強度が変更されたら、パルスプログラムファイルの行179でセミコロンを再導入し、ファイルを保存します。PLDB2を最適化するには、受信機ゲインを1に設定し、EDCプルを入力してパルス・プログラム・ファイルを開きます。184 行目で、goto 999 の前にあるセミコロンを削除し、ファイルを保存します。GS コマンドを使用して、PLDB2 パラメーターを調整して、FID 信号の強度を最小化します。信号強度が変更されたら、パルスプログラムファイルの行184でセミコロンを再導入し、ファイルを保存します。RGA コマンドを実行して、レシーバゲインを最適化します。次に、ZG コマンドを実行して実験を開始します。この図では、水素窒素15トロシースペクトルにおけるピーク毎に取得した緩和分散プロファイルの結果が観察できる。取得した緩和分散プロファイルから、各骨格AMI基の窒素15横方向緩和への交換寄与を推定することができる。調査中のタンパク質の3D構造に横方向の緩和をプロットすることにより、マイクロ秒ミリ秒のタイムスケールで確認交換を行っている構造領域を同定することが可能です。カーバー・リチャーズ方程式を使用した緩和分散曲線のモデリングは、平衡状態の州の小数母集団やこれらの状態間の交換速度など、交換プロセスにおける熱力学的および運動的パラメータを返します。これらの熱力学および運動パラメータの温度依存性は、van't Hoff方程式とIリング方程式をそれぞれ使用してモデル化し、確認交換のエネルギーに関する詳細な情報を得ることができます。すべての取得パラメータ、特にP7を慎重に最適化することが重要です。また、スプリアス分散を避けるために、非常に純粋で均質なサンプルを生成することも重要です。このプロトコルを使用して得られた運動、熱力学、および化学チップパラメータは、確認交換を受けている種に関するエネルギー的かつ構造的な情報を導出するために使用することができる。CPMG法によって得られるタンパク質確認ダイナミクスの特性評価は、シグナル伝達および酵素活性の理解に向けた重要な情報と、薬物設計のための新しい視点を提供する。

15n-cpmg-relaxation-dispersion-for-investigation-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

原子分解能で分子タンパク質複合体の構造は、多様な生命現象で重要な役割のため関連性が高いです。ここで、マジック角回転固体核磁気共鳴分光法 (MAS SSNMR) による不溶性と非晶質高分子タンパク質複合体の高分解能構造解析を実行するためのプロトコルを提案する.

固体核磁気共鳴分光法による高分子アセンブリの原子スケール構造の研究

核磁気共鳴(NMR)分光法は、構造タンパク質のダイナミクスを残留物特異的な方法で特徴付けることができます。私たちは、ピコ秒からナノ秒の時間スケールに敏感なNMR 15N R1 およびR2...

タンパク質のピコ秒からナノ秒の構造ダイナミクスを調べるためのNMR 15N緩和実験

このNMRベースのプロトコルは、シアノビリン-NおよびD-マンノースを使用して弱いタンパク質-糖鎖相互作用を調査します。リガンドとタンパク質の検出方法を組み合わせて、結合部位をマッピングし、アロステリック効果を検出し、遭遇複合体を同定します。このアプローチは、サンプル前処理とデータ分析の概要を示し、糖鎖特異的診断と認識メカニズムに役立つ構造的および動的な洞察を提供します。...

タンパク質と糖鎖の相互作用の探索:核磁気共鳴の進歩

この論文は、脂質近位環境におけるin vitroでの内在性膜タンパク質とさまざまなパートナー因子との相互作用と集合を評価する方法を説明しています。...

足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成しますインビトロ

コンフォメーションの柔軟性は、タンパク質の機能に重要な役割を果たしています。本明細書において、我々は、規則及び不規則タンパク質に機能を駆動急速な構造変化をプロービングするための水素 - 重水素交換に結合された時間分解エレクトロスプレーイオン化質量分析法の使用を記載しています。...

時間分解エレクトロスプレーイオン化水素 - 重水素交換質量分析タンパク質の構造とダイナミクスを学ぶために

ここで急速に線虫成長メディア寒天、ウェルあたりCaenorhhabditis 線虫の一貫性のある数 96...

カエノラブディティス ・ エレガンスにおけるハイスループット化合物スクリーニングのための簡単な方法

生物がその有効期間中に発生する最も困難なストレス条件の 1 つは酸化物質の蓄積を含みます。酸化ストレス時に細胞は分子シャペロンに大きく依存します。HDX MS...

Hsp33 の酸化還元規制シャペロン活性を定義および水素重水素交換質量分析法による Hsp33 の構造変化をマッピング

蛋白質蛋白質の相互作用、生物学的システムにとって重要と拘束運動の研究は、ダイナミクスとタンパク質複合体の機能に対する洞察を提供します。蛋白質の蛍光共鳴エネルギー移動ストップト...

ミリ秒時間スケールでのタンパク質複合体のダイナミクスを調べるため体外蛍光共鳴エネルギー移動の使用

ここでは、単一分子レベルの複雑な蛋白質のサンプルのそれぞれのタンパク質種のラベリングの均質性を評価するためのプロトコルを提案する.

プロテオーム的分類の単一分子レベルでの均一性の定量化

このプロトコルの目的は、ラティス光シート顕微鏡を使用して、生細胞の表面受容体ダイナミクスを4次元的に可視化する方法を示すことを目的としています。ここで、CD4+一次T細胞上のT細胞受容体が示されている。...

格子光シート顕微鏡による表面T細胞受容体ダイナミクスの可視化4次元的な研究

学ぶ ¹⁵N CPMG緩和分散NMRを用いたタンパク質コンフォメーションダイナミクスの検出と特性評価。μs-msタイムスケールの動的構造変化を原子分解能で解析し、酵素活性やシグナル伝達の機構解明に貢献します。

¹⁵μs-ms タイムスケールにおけるタンパク質コンフォメーションダイナミクスの研究のためのN CPMG緩和分散

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